中草藥有效成分的高效提取及抑菌性檢測

吳彥壯 王峰 魏雯靜 張嵐 桂榮娟 孫鵬 李浩 王藝峰 戴洪偉

【中圖分類號】R544.1 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】B 【文章編號】2095-6851（2018）03--01

金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）是嚴(yán)重危害人類生命健康的一種重要病原菌，它是引起人類化膿感染中最常見的病原菌，可直接導(dǎo)致局部化膿感染、肺炎等疾病，甚至引發(fā)敗血癥、膿毒癥等全身感染。[1]目前，臨床上用于治療細(xì)菌感染的藥物是抗生素，但是抗生素通過直接抑制病原菌的生長或者以直接殺死病原菌的方法來達(dá)到治療的效果。[2]這種固有的作用機(jī)理給予細(xì)菌強(qiáng)大的選擇壓力催生并進(jìn)一步富集了耐藥性菌株，因此細(xì)菌的耐藥性已經(jīng)成為日益嚴(yán)峻的全球公共衛(wèi)生問題。

中草藥作為我國的優(yōu)勢國藥，因其成分復(fù)雜，具有對人體毒副作用小，易于代謝等優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊應(yīng)用前景。

據(jù)報(bào)道，許多中草藥都具有抗菌性和抗真菌作用，其中魚腥草、五倍子、金銀花、甘草相對于其他中草藥材而言，具有來源廣泛、價(jià)格低廉等特點(diǎn)，故選用這四種中草藥進(jìn)行抑菌性實(shí)驗(yàn)，以期從中篩選出抑菌性最好的中草藥，為臨床研究及應(yīng)用提供一種參考。[3]

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 中草藥 魚腥草（Houttuynia cordata Thunb）、五倍子（Galla Chinensis ）、金銀花（honeysuckle）、甘草（glycyrrhiza）

1.2 菌種 金黃色 葡萄球菌（Staphyloccocus aureus） 西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院提供。

1.3 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基

2 實(shí)驗(yàn)過程

2.1 準(zhǔn)備階段

2.1.1 中草藥有效成分提取

2.1.1.1 魚腥草（癸酰乙醛）：選取魚腥草新鮮地下莖，剪成2cm長小段置于磨口錐形瓶中，加入適量乙酸乙酯浸泡456小時(shí)（40℃水浴加熱）后，采用水蒸氣蒸餾法對有效成分進(jìn)行提取，所得淺黃色精油即為癸酰乙醛粗提取物，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.1.2 五倍子（沒食子酸）：將五倍子洗凈、烘干（70℃烘箱中烘烤48h）并粉碎（粉碎樣通過60目篩），將粉末置于磨口錐形瓶中，加入適量濃度為15U/g的單寧酶酶制劑，在PH=6的條件下40℃水浴加熱4h，最后將提取液置于100℃沸水中加熱5min以達(dá)到滅酶的目的，所得溶液即為沒食子酸粗提取物，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.1.3 金銀花（金銀花提取物）：將金銀花提前用水潤濕，在蒸餾器內(nèi)安裝一個多孔隔板，樣品置于隔板上，進(jìn)行加熱蒸餾，所得揮發(fā)油即為金銀花粗提取物，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.1.4 甘草（甘草總黃酮）：將甘草洗凈、烘干（50℃）并粉碎（粉碎樣通過80目篩），利用水提法除去其中的甘草酸，過濾、烘干，置于磨口錐形瓶中，向其中加入適量無水乙醇，在超聲功率為250W的超聲清洗儀中60℃C提取1h，過濾，所得濾液即為甘草總黃酮粗提取物，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 試驗(yàn)階段

2.2.1 藥敏紙片法

2.2.1.1 藥敏紙片的制備：將空白藥敏紙片在試驗(yàn)前浸泡在各中草藥提取液中4-5小時(shí)。

2.2.1.2 涂板：

2.2.1.1.1 培養(yǎng)基的制作 蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl5g，加熱至所有藥品熔化后，蒸餾水定容至1000ml，瓊脂15g，調(diào)節(jié)pH=7.0～7.2，高溫高壓蒸汽滅菌30min，待冷卻至55℃左右時(shí)倒入培養(yǎng)皿。

2.2.1.1.2 接菌 待培養(yǎng)皿冷卻后，取10-6濃度金黃色葡萄球菌懸液，用無菌微量移液器取10μL菌液，盡快用無菌L型涂菌棒均勻涂布于培養(yǎng)基表面，靜置2-3min，將制備好的藥敏紙片放置在培養(yǎng)基中央，37°C培養(yǎng)24h。

2.2.1.3 測量：用千分尺測量抑菌圈直徑，標(biāo)準(zhǔn)為人肉眼可見的無細(xì)菌生長的邊緣。

2.2.2 MIC測定

2.2.2.1 藥液稀釋：將中草藥原液分別稀釋10倍、20倍、40倍、80倍、160倍、320倍、640倍、1280倍、2560倍，即最終藥液濃度分別為100mg/ml、50mg/ml、25mg/ml、12.5mg/ml、6.25mg/ml、3.125mg/ml、1.5625mg/ml、0.7825mg/ml、0.39125mg/ml。

2.2.2.2 MIC實(shí)驗(yàn) 將上述稀釋液各取1ml分別置于9支試管中，分別向其中0.1ml菌液（菌液濃度為105cfu/ml），設(shè)空白對照管，在恒溫培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng)24h。

3.結(jié)果與討論

3.1 藥敏紙片法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表1結(jié)果顯示，四種中草藥均有較好的抑菌效果，其中以五倍子的抑菌效果最為明顯，這四種中草藥的抑菌性排序?yàn)槲灞蹲?gt;金銀花>甘草>魚腥草。

3.2 MIC結(jié)果

3.3 分析與討論

金黃色葡萄球菌作為臨床感染主要病原菌之一，不同的中草藥對金黃色葡萄球菌的抑菌、殺菌作用、原理不同[4]。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得，五倍子、甘草、金銀花、魚腥草這四種中草藥對金黃色葡萄球菌抑制作用效果最好的是五倍子，其次為金銀花、甘草，最小為魚腥草。而五倍子的主要成分為鞣酸，鞣酸具有凝固蛋白的作用，能使菌體內(nèi)的原生質(zhì)及酶等蛋白質(zhì)凝固，導(dǎo)致微生物生長代謝受到影響甚至死亡[5]，且五倍子在我國資源分豐富、來源廣泛，符合生產(chǎn)生活需求。

因此，我們有責(zé)任去利用好我國的優(yōu)勢國藥，開發(fā)出中草藥更大的潛在價(jià)值，為日后減少抗生素的使用，延長抗生素的使用壽命打下堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

陳洪升.金黃色葡萄球菌氨基糖苷類、喹諾酮耐藥基因的研究[D].廣東藥學(xué)院，2015

沈慧玲.關(guān)于呼吸內(nèi)科疾病的抗生素治療探究[J].醫(yī)藥衛(wèi)生：文摘版：00119-00119.

李軍紅，田勝尼，方曉光，等.5種常見中草藥的抑菌性研究[J].生物技術(shù)通報(bào)，2006（c00）：395-399.

王瑞君.幾種中草藥對金黃色葡萄球菌體外抑制作用的研究[J].現(xiàn)代食品科技，2009，25（9）：1104-1106.

王利，林華忠，劉玉娟，等.4種中草藥對金黃色葡萄球菌的抑制作用研究[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2012（17）：258-258.