高效液相色譜法測定山楂黃酮的研究

李博藝，諶柄旭，魏志陽，王希彬，肖冬光*

（天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

山楂（Crataegus pinnatifida Bge.）為薔薇科山楂屬植物果實(shí)，又稱山里紅、山楂果、山梨、紅果等[1-2]，在我國北方地區(qū)廣泛栽培，是重要的藥食同源植物。中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為山楂具有消食健胃，行氣散瘀，化濁降脂的作用；現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，山楂具有促進(jìn)消化酶分泌，調(diào)節(jié)胃腸平滑肌、抗氧化、降血壓、降血脂、抑菌等藥理活性[3]。山楂中主要的生物活性成分包括黃酮類化合物、原花青素、三帖酸等[4-8]，目前從山楂中已分離得到60余種黃酮類化合物[9]。

山楂黃酮檢測方法中，NaNO2-AL（NO3）3比色法是應(yīng)用最廣泛的[10]，樣品以蘆丁作為對照標(biāo)準(zhǔn)品，顯色后在波長500～510 nm處測定總黃酮含量[11-13]，使用比色法檢測山楂黃酮總含量在10～70 g/kg之間[14-16]。郭亞健等[17]通過篩選發(fā)現(xiàn)某些黃酮類化合物，如槲皮素、山柰素、黃芩素等在波長500～510 nm范圍內(nèi)無最大吸收或吸收較弱，而某些非黃酮類化合物如咖啡酸、綠原酸等卻在該處有最大或較強(qiáng)吸收，在應(yīng)用中可能造成黃酮類化合物假陰性和非黃酮類化合物假陽性干擾，方法專屬性不強(qiáng)；同時(shí)黃酮類物質(zhì)分類較廣，種類繁多，一概以蘆丁為對照品進(jìn)行比對，檢測結(jié)果誤差較大。

液相色譜法將樣品中單體物質(zhì)分離檢測，可以有效消除酚酸類物質(zhì)對黃酮含量檢測造成的影響[18-22]。孫立立等[23]對比色法測定山楂總黃酮含量與液相法測定山楂中金絲桃苷含量進(jìn)行了對比；張永超等[24]使用高效液相色譜法對山楂中蘆丁與槲皮素檢測進(jìn)行了方法學(xué)考察；陳寶龍等[25]采用高效液相色譜法建立了山楂藥材黃酮類成分指紋圖譜；王珍等[26]建立了全波長高效液相色譜法測定山楂總黃酮提取物中蘆丁、金絲桃苷和槲皮素含量的方法。但在山楂黃酮類物質(zhì)檢測中，還存在色譜分離效果不好，準(zhǔn)確定量分析方法未完善等不足。本研究對高效液相色譜（high performanceliquid chromatograph，HPLC）測定山楂中主要黃酮類物質(zhì)的方法進(jìn)行了優(yōu)化，建立定性定量檢測牡荊素、蘆丁和槲皮素的方法，并對五個(gè)不同地區(qū)山楂樣品中的主要黃酮類物質(zhì)進(jìn)行了分析檢測，研究不同山楂果實(shí)中黃酮含量差異，旨在為山楂黃酮定量檢測提供參考，為山楂資源綜合利用、資源評價(jià)及深度開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山楂：分別購于天津、山西運(yùn)城、河北邯鄲、山東蒙陰山、山東萊蕪；牡荊素、蘆丁、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品（純度均＞99%）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；高效液相色譜檢測所需試劑均為色譜純，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HPLC-UV高效液相色譜儀：美國Agilent公司；FA2204B電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 山楂黃酮的提取

采用回流提取法[20]提取山楂黃酮類化合物：準(zhǔn)確稱取山楂細(xì)粉樣品0.500 0 g，置于100 mL圓底燒瓶中，精密加入體積分?jǐn)?shù)60%乙醇50 mL，稱質(zhì)量，水浴回流提取4 h，冷卻至室溫，稱質(zhì)量，補(bǔ)充損失的溶劑質(zhì)量（精確至0.001 g），搖勻，使用孔徑為0.22μm的濾膜過濾，濾液即為山楂黃酮提取液，備用。

1.3.2 色譜柱柱溫的選擇

高效液相色譜條件為：色譜柱Cosmosil C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相A 100%甲醇，流動相B 1%乙酸；流速0.6mL/min；檢測波長360nm，進(jìn)樣量20μL。分別在30℃、40℃、50℃柱溫下，對山楂黃酮提取液進(jìn)樣分析，記錄高效液相色譜圖并進(jìn)行對比。

1.3.3 梯度洗脫流程的確定

色譜條件同1.3.2，柱溫30℃，梯度洗脫流程見表1，按4種梯度洗脫流程對山楂黃酮提取液進(jìn)樣分析，從而確定最佳梯度洗脫流程。

表1 不同HPLC流動相梯度洗脫時(shí)間表Table 1 Gradient elution schedules for different HPLC mobile phases

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱取牡荊素0.010 0 g、蘆丁0.020 0 g和槲皮素0.020 0 g，分別用甲醇溶解定容至50 mL容量瓶中，得到標(biāo)準(zhǔn)儲備液，按表2稀釋成不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)使用液。

表2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中各標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度Table 2 Concentration of each standard substance in the mixed standard solution

1.3.5 不同地區(qū)山楂黃酮相似度分析

取5個(gè)不同地區(qū)山楂樣品，按1.3.1方法制備山楂黃酮提取液，并按照優(yōu)化后液相色譜檢測方法進(jìn)行分析，記錄液相色譜圖。運(yùn)用中國藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2004A版”對5組山楂黃酮樣品的液相色譜圖進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜柱柱溫的選擇

按1.3.2的方法，在柱溫為30℃、40℃、50℃條件下，對山楂黃酮提取液進(jìn)行分析得色譜圖，結(jié)果見圖1。由圖1可知，隨著柱溫的升高，柱壓下降，洗脫效率增強(qiáng)，幾種物質(zhì)出峰時(shí)間均有所提前。在40℃和50℃時(shí)，色譜圖在20～30 min間出峰過于密集，不利于各種物質(zhì)的分離辨別，對比色譜圖的分離效果，確定30℃為最佳柱溫。

圖1 不同柱溫山楂樣品高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of hawthorn sample with different column temperature

2.2 液相色譜梯度洗脫流程優(yōu)化

按照1.3.3中的方法，以4種梯度洗脫流程對供試樣品進(jìn)樣分析，色譜圖見圖2。由圖2可知，流程Ⅰ起始水相比例較高，牡荊素峰與雜質(zhì)峰混在一起，無法分離；隨著起始有機(jī)相比例的升高，流程Ⅱ、流程III、流程IV中物質(zhì)的出峰時(shí)間逐漸提前，20～30 min之間物質(zhì)出峰也更加密集，在流程Ⅱ中，牡荊素與雜峰分離效果較好，色譜基線更加平穩(wěn)，讀取數(shù)據(jù)更加準(zhǔn)確。所以選擇流程Ⅱ?yàn)樯介S酮檢測梯度洗脫流程。

圖2 不同流動相梯度洗脫程序高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of different mobile phase gradient elution procedures

2.3 外標(biāo)法測定山楂中主要黃酮含量

山楂黃酮提取液與標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見圖3，對照標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖，山楂樣品液在相同保留時(shí)間出現(xiàn)了牡荊素、蘆丁、槲皮素的色譜峰，且峰形較好。

圖3 3種對照標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液(A)和山楂樣品(B)的高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of 3 mixtures standard solutions(A)and hawthorn sample(B)

按表2制備不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)樣20μL，按照優(yōu)化后液相色譜條件進(jìn)行測定，以進(jìn)樣量對色譜峰面積進(jìn)行最小二乘法線性回歸，分別建立各標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程，結(jié)果見表3。由表3可知，牡荊素、蘆丁、槲皮素的保留時(shí)間分別為25.59 min、30.76 min和46.68 min，回歸方程的線性范圍分別為1～100 mg/L、1～120 mg/L和1～40 mg/L，相關(guān)系數(shù)在0.999 2～0.999 7，表明線性關(guān)系較好，3種黃酮的檢出限為0.020～0.082 mg/L，定量限為0.065～0.253 mg/L。

表3 標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍(n=6)Table 3 Retention time,linear regression equation,correlation coefficient and linear range of standard substances(n=6)

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 重復(fù)性試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取山楂樣品，按照1.3.1的方法制備山楂黃酮提取液，采用優(yōu)化后的色譜條件測定山楂中三種主要黃酮含量，6次平行試驗(yàn)結(jié)果見表4。由表4可知，各共有峰相對保留時(shí)間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）均＜5%，三種主要黃酮含量的RSD均＜5%，表明該方法重復(fù)性良好，符合定性定量檢測要求。

表4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of repeatability tests

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精確稱取樣品，按照1.3.1的方法制備山楂黃酮提取液，分別放置0、1 h、2 h、4 h、8 h后進(jìn)行高效液相色譜測定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。由表5可知，各黃酮含量的RSD均＜5%，表明山楂黃酮提取液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of stability tests

2.4.3 回收率試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取已知黃酮含量的同一批山楂樣品3份，每份約0.500 0 g，加入與樣品中含量大致相等的標(biāo)準(zhǔn)品，按1.3.1操作，制備山楂黃酮提取液，依優(yōu)化后色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表6。由表6可知，三種物質(zhì)加標(biāo)回收率在99.63%～104.76%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值均低于5%，符合定量檢測要求。

表6 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=3）Table 6 Results of adding standard recovery rate（n=3）

2.5 不同地區(qū)山楂主要黃酮含量的檢測

2.5.1 不同地區(qū)山楂黃酮類物質(zhì)液相色譜圖相似度分析

按1.3.5方法，對5組山楂黃酮樣品的液相色譜圖進(jìn)行分析，設(shè)定河北邯鄲樣品為參照圖譜，選取“時(shí)間窗寬度”為0.1 min，采用中位數(shù)法計(jì)算，選定3個(gè)特征峰進(jìn)行多點(diǎn)校正，自動匹配，生成山楂黃酮成分的對照指紋圖譜，見圖4，匹配后的5批樣品色譜圖見圖5。由圖5可知，五個(gè)不同地區(qū)山楂樣品均有牡荊素、蘆丁和槲皮素的色譜峰，且均以蘆丁為主要黃酮物質(zhì)。

圖4 山楂標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of hawthorn standard

以對照指紋圖譜為參照，進(jìn)行各樣品的相似度評價(jià)，5個(gè)不同地區(qū)山楂樣品相似度關(guān)系見表7。由表7可知，五組樣品與對照色譜圖譜相似度在0.772～0.993，說明各產(chǎn)地的山楂樣品差別較大；另一方面，來自于山東省的兩個(gè)山楂樣品（S1、S2）和來自于天津和河北的兩個(gè)山楂樣品（S3、S5）相似度分別為0.938和0.996，說明產(chǎn)地相近的山楂樣品相似度較高。

圖5 5個(gè)不同地區(qū)山楂樣品高效液相色譜指紋圖譜Fig.5 HPLC fingerprint of hawthorn samples in five different regions

表7 5個(gè)不同地區(qū)山楂樣品高效液相色譜圖相似度結(jié)果Table 7 Similarity results of hawthorn samples in five different regions by HPLC

2.5.2 不同地區(qū)山楂樣品主要黃酮含量測定

對5個(gè)不同地區(qū)山楂的黃酮類物質(zhì)進(jìn)行定量分析，結(jié)果見表8。由表8可知，不同地區(qū)山楂主要黃酮類物質(zhì)總量相差較大，最高的是山東蒙陰山山楂（897.80 mg/kg），最低的為天津山楂（420.47 mg/kg），其中牡荊素和槲皮素的含量差別較小，而蘆丁的含量差別較大，山東地區(qū)山楂中蘆丁的含量約為天津地區(qū)的4倍。

表8 不同地區(qū)山楂黃酮含量測定結(jié)果Table 8 Determination results of hawthorn flavonoids in different regions mg/kg

3 結(jié)論

通過對高效液相色譜測定山楂黃酮方法的優(yōu)化，建立了外標(biāo)法定量測定山楂中牡荊素、蘆丁和槲皮素含量的方法，方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明，重復(fù)性試驗(yàn)RSD為1.73%，穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD為1.04%，加標(biāo)回收率為99.63%～104.8%，說明此方法重復(fù)性高，穩(wěn)定性好，具有較好的準(zhǔn)確性。

對5種不同地區(qū)山楂樣品黃酮類物質(zhì)色譜圖的相似度分析，結(jié)果表明不同地區(qū)山楂黃酮類物質(zhì)組成相差較大，受到地域環(huán)境條件、成熟度、采摘年份等多種因素影響，山楂黃酮的組成和含量都可能存在較大的差別，其中蘆丁含量的差別最為明顯。

本研究采用高效液相色譜法檢測山楂中三種主要黃酮的總量僅為420.47～897.80 mg/kg，與比色法所測的黃酮總量相差較大。分析原因主要包括兩個(gè)方面：一是目前從山楂中已分離得到黃酮類化合物有60余種，而本方法僅定量分析了其中三種主要的黃酮；另一方面，比色法的測定原理為利用類黃酮結(jié)構(gòu)上的酚羥基特征及其還原性進(jìn)行顯色，只要有鄰二羥基或有3,5位羥基結(jié)構(gòu)的化合物，都會與NaNO2-AL（NO3）3顯色劑發(fā)生顯色反應(yīng)，對黃酮而言顯色劑NaNO2-AL（NO3）3并不具有專屬性，而許多酚酸類物質(zhì)也含有類似結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致山楂總黃酮檢測結(jié)果的數(shù)據(jù)偏大。如何準(zhǔn)確定量測定山楂總黃酮含量，有待進(jìn)一步研究。

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