響應(yīng)面法優(yōu)化固相微萃取生板栗香氣成分條件

王圣儀，趙玉華，常學(xué)東*

（河北科技師范學(xué)院 食品科技學(xué)院，河北 秦皇島 066000）

板栗（Castanea mollissima）是殼斗科栗屬的植物，隨著人們對(duì)板栗認(rèn)識(shí)的提高，板栗加工制品受到越來(lái)越多的關(guān)注。板栗獨(dú)特的香氣是板栗制品增加的重要原因之一，生板栗具有復(fù)雜的鮮果香氣，前人對(duì)生板栗的香氣成分研究較少，國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)涉及的范圍有限，關(guān)于板栗的分析研究側(cè)重在不同的加工方式，對(duì)生板栗香氣成分萃取方法的研究鮮有報(bào)道。

不同萃取方法對(duì)板栗揮發(fā)性香氣成分的萃取結(jié)果有較大差異，選用不同的萃取技術(shù)并優(yōu)化萃取條件，能為鑒別和提高生板栗的質(zhì)量提供新的技術(shù)手段，同時(shí)為鑒定板栗特征風(fēng)味提供基礎(chǔ)的分析方法[1]。固相微萃?。╯olidphasemicroextraction，SPME）技術(shù)作為一項(xiàng)新穎的樣品前處理與富集技術(shù)[2]，由于其取樣后原樣品體系組成不出現(xiàn)顯著變化，可用于化學(xué)反應(yīng)實(shí)時(shí)過(guò)程分析[3]，己經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于食品風(fēng)味的分析檢測(cè)中。

響應(yīng)面法是一種常用的試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)處理方法，能通過(guò)一系列試驗(yàn)近似擬合得到多項(xiàng)式函數(shù)來(lái)預(yù)測(cè)真實(shí)情況，目前已廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的優(yōu)化研究。本試驗(yàn)以早豐板栗為原料，使用響應(yīng)面法優(yōu)化固相微萃取技術(shù)對(duì)生板栗香氣成分的提取條件，以期獲得生板栗提取效果最優(yōu)時(shí)的提取條件，為生板栗香氣成分的萃取研究及氣質(zhì)聯(lián)用法（gaschromatography-mass spectrometer，GC-MS）測(cè)定含量提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

早豐板栗：采于遷西縣栗園，板栗成熟果實(shí)采后用保鮮膜包裝后在貯藏庫(kù)中4℃貯藏；高純氦氣（純度99.999%）：河南源正科技發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

220-MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)安捷倫公司；57330-U固相微萃取手動(dòng)進(jìn)樣手柄、固相微萃取纖維頭（100μm聚二甲基硅烷（polydimethylsiloxane，PDMS）、65μm PDMS/二乙烯苯（divinylbenzene，DVB）、75 μm Carboxen（CAR）/PDMS、50/30 μm DVB/CAR/PDMS）：美國(guó)Supelco公司；MS-TS分析天平：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；DK-S22電熱恒溫水浴鍋：上海精宏儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 試驗(yàn)條件

氣相色譜條件：色譜柱為HP-5MS石英彈性毛細(xì)柱（30.0m×320μm×0.25μm），載氣為氨氣（He）（純度99.999%），分流比20∶1，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣口溫度230 ℃，起始溫度為40℃，保持3 min，以10℃/min升至180℃，保持3 min，再以10℃/min升至200℃，保持2 min。質(zhì)譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV，離子源溫度230℃，接口溫度250℃，四極管溫度150℃，質(zhì)量掃描范圍30～500 m/z。

萃取頭的老化處理與試驗(yàn)流程：每支萃取頭在首次使用時(shí)，需在氣相色譜進(jìn)樣口于230℃老化30 min，以后每次使用前于230℃進(jìn)樣口處老化10 min以脫去其雜質(zhì)。

試驗(yàn)流程：取飽滿(mǎn)、無(wú)機(jī)械損傷的板栗果實(shí)，去殼后將栗仁切碎成體積約2.0 mm3的小塊。準(zhǔn)確稱(chēng)取樣品2.0 g于15 mL頂空樣品瓶?jī)?nèi)。將固相微萃取針管插入萃取瓶中并固定固相微萃取頭在樣品瓶中的位置，保持每次萃取時(shí)萃取頭處于相同位置，伸出纖維頭。吸附完成后，縮回纖維頭后抽出針管，直接將萃取頭插入氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，于解吸溫度230℃條件下進(jìn)行解吸5 min。

1.3.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

影響固相微萃取過(guò)程中萃取效果的主要因素包括萃取頭的種類(lèi)、平衡時(shí)間、萃取時(shí)間以及萃取溫度。優(yōu)化試驗(yàn)以檢出香氣成分的數(shù)量和色譜峰的總峰面積為評(píng)價(jià)指標(biāo)，先通過(guò)單因素試驗(yàn)考察各因素對(duì)頂空固相微萃取效果的影響[4]。

萃取頭種類(lèi)的優(yōu)化：在平衡時(shí)間10 min，萃取時(shí)間30 min，萃取溫度50℃的條件下，分別考察不同的萃取頭（100 μm PDMS、65 μm PDMS/DVB、75 μm CAR/PDMS、50/30μm DVB/CAR/PDMS）對(duì)萃取效果的影響。

平衡時(shí)間的優(yōu)化：使用65μm PDMS/DVB的纖維頭，在萃取時(shí)間30min，萃取溫度50℃的條件下，分別考察不同平衡時(shí)間（0、5min、10min、15min、20min）對(duì)萃取效果的影響。

萃取時(shí)間的優(yōu)化：使用65μm PDMS/DVB的纖維頭，在平衡時(shí)間10 min，萃取溫度50℃的條件下，分別考察不同萃取時(shí)間（20 min、30 min、40 min、50 min、60 min）對(duì)萃取效果的影響。

萃取溫度的優(yōu)化：使用65μm PDMS/DVB的纖維頭，在平衡時(shí)間10 min，萃取時(shí)間30 min的條件下，分別考察不同萃取溫度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃）對(duì)萃取效果的影響。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇平衡時(shí)間（A）、萃取時(shí)間（B）和萃取溫度（C）3個(gè)因素為自變量，以香氣物質(zhì)的萃取物種類(lèi)為響應(yīng)值（Y），根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)采用3因素3水平的響應(yīng)面分析方法[5]，響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1。

表1 萃取條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factor and levels of response surface methodology for extraction conditions optimization

1.3.4 定性定量分析

定性分析：通過(guò)GC-MS分析軟件進(jìn)行分析，化合物經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索與計(jì)算機(jī)標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫(kù)美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）11中的數(shù)據(jù)比較（最大值1 000），相似指數(shù)（similarity index，SI）＞800即為確認(rèn)化合物。

定量分析：按峰面積歸一法計(jì)算化合物相對(duì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.1.1 萃取頭的選擇[6]

圖1 不同萃取頭對(duì)萃取效果的影響Fig.1 Effects of different extraction fibers head on extraction efficiency

由圖1可知，對(duì)生板栗香氣成分的總吸附量來(lái)說(shuō)，吸附能力由強(qiáng)到弱依次是100μm PDMS、65μm PDMS/DVB、50/30μm DVB/CAR/PDMS、75μm CAR/PDMS，吸附揮發(fā)性成分種類(lèi)由多到少依次是65μm PDMS/DVB、100μm PDMS、50/30μm DVB/CAR/PDMS、75μm CAR/PDMS。

100μm PDMS是非極性的光纖維涂層，在揮發(fā)性物質(zhì)的分析中廣泛用于香氣分析。這種纖維在提取板栗香氣時(shí)得到了最高的總峰面積，但得到的萃取物種類(lèi)少于65μm PDMS/DVB，對(duì)個(gè)別香氣成分的萃取效果遠(yuǎn)高于其他香氣成分，因此該纖維不適合生板栗香氣的分析[7]。

混合極性的纖維涂層中65μm PDMS/DVB表現(xiàn)顯著，DVB/CAR/PDMS纖維涂層的萃取范圍廣泛，對(duì)低沸點(diǎn)和高沸點(diǎn)的化合物有更好的萃取效果，而PDMS/DVB纖維涂層能吸收更多的極性和具有高保留指數(shù)（retention index，RI）的芳香族化合物[8]，在生板栗中萃取得到的化合物種類(lèi)最多，且在混合極性的纖維涂層中65μm PDMS/DVB纖維的萃取頭在板栗香氣活性化合物中提取效率最高。因此，選擇65μm PDMS/DVB纖維頭為最適的萃取頭。

2.1.2 平衡時(shí)間的選擇

圖2 不同平衡時(shí)間對(duì)萃取效果的影響Fig.2 Effects of different balance time on extraction efficiency

由圖2可知，板栗香氣成分的吸附量由多到少依次是平衡時(shí)間15 min、5 min、10 min、0 min、20 min；吸附揮發(fā)性成分種類(lèi)由多到少依次是平衡時(shí)間15 min、10 min、5 min、20 min、0 min，說(shuō)明平衡時(shí)間為15 min時(shí)，萃取到香氣成分的種類(lèi)最多且揮發(fā)性成分吸附量最大，因此選擇15 min為最佳平衡時(shí)間。

2.1.3 萃取時(shí)間的選擇[9]

圖3 不同萃取時(shí)間對(duì)萃取效果的影響Fig.3 Effects of different extraction time on extraction efficiency

由圖3可知，在萃取時(shí)間為50 min時(shí)，檢出的香氣成分種類(lèi)最多，雖然在萃取時(shí)間為60 min時(shí)檢出物的總峰面積略高與萃取時(shí)間50min，但檢出香氣成分種類(lèi)減少，考慮到降低成本，使更多的樣品可以在相同的時(shí)間內(nèi)處理，因此選擇50 min為最佳萃取時(shí)間。

2.1.4 萃取溫度的選擇[10-11]

圖4 不同萃取溫度對(duì)萃取效果的影響Fig.4 Effects of different extraction temperature on extraction efficiency

由圖4可知，萃取香氣成分種類(lèi)隨著萃取溫度的升高而增加，檢出的香氣成分種類(lèi)和總峰面積在萃取溫度50～60℃時(shí)萃取效果相對(duì)穩(wěn)定，溫度到達(dá)70℃時(shí)香氣種類(lèi)與強(qiáng)度驟增。但在70℃萃取結(jié)束后，樣品產(chǎn)生與熟板栗類(lèi)似香氣，為避免溫度對(duì)目標(biāo)樣品產(chǎn)生影響改變樣品理化性質(zhì)，因此選擇55℃為最佳萃取溫度。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表2?；貧w模型方差分析見(jiàn)表3。

表2 萃取條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of response surface methodology for extraction conditions optimization

采用Design Expert軟件對(duì)表2結(jié)果進(jìn)行二次回歸響應(yīng)面回歸分析，分別建立回歸模型，得擬合方程：

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface experiments

由表3可知，失擬項(xiàng)不顯著，方程決定系數(shù)R2=0.940 8，校正決定系數(shù)R2adj=0.834 3，說(shuō)明該模型與試驗(yàn)擬合良好。可以看出，萃取溫度對(duì)萃取種類(lèi)影響極顯著（P＜0.01），平衡時(shí)間和萃取溫度交互對(duì)萃取種類(lèi)影響顯著（P＜0.05），二次項(xiàng)A2、C2對(duì)萃取種類(lèi)影響顯著（P＜0.05）。通過(guò)所選3個(gè)因素的F值可知，對(duì)萃取種類(lèi)的影響順序依次為萃取溫度、平衡時(shí)間、萃取時(shí)間。

采用Design Expert軟件對(duì)以萃取種類(lèi)最多為目標(biāo)，對(duì)模型進(jìn)行優(yōu)化，可得到回歸模型的穩(wěn)定點(diǎn)（0.62，0.06，0.74），理想性為0.891，穩(wěn)定點(diǎn)為最大值點(diǎn)，考慮到實(shí)際操作情況，選擇萃取條件為平衡時(shí)間18 min，萃取時(shí)間50 min，萃取溫度58.5℃，萃取種類(lèi)達(dá)到21種，總峰面積為47 381.3。

由3 d重復(fù)分析揮發(fā)物的日間重復(fù)性評(píng)價(jià)方法，在相同樣品相同條件下[13]對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)得到的預(yù)測(cè)值進(jìn)行連續(xù)3d驗(yàn)證試驗(yàn)。測(cè)得的萃取種類(lèi)中，21種化合物被正確識(shí)別，總峰面積48 382.7，與理論值相差2.11%，說(shuō)明應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的試驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠，具有實(shí)用性?xún)r(jià)值。

板栗的生食與熟食在口感風(fēng)味上存在明顯差異，生板栗口感清脆略澀，味道清香甘甜，與生紅薯味道相近。不同加工方式的熟板栗味道上略有不同，總體呈糯性酥性口感，味道濃郁，香而甜潤(rùn)。因此通過(guò)對(duì)栗仁進(jìn)行感官評(píng)價(jià)可以對(duì)生板栗和熟板栗進(jìn)行判斷[14-17]。

采取1.3.1中栗仁處理方法，取24個(gè)15 mL萃取瓶分成三組，每個(gè)萃取瓶中放置顆粒大小約2.0 mm3立方體的新鮮栗仁2.0 g，分別置于50℃、60℃、70℃水浴鍋中加熱90 min，由8位熟悉板栗的實(shí)驗(yàn)室人員對(duì)三組不同水浴溫度的栗仁進(jìn)行評(píng)價(jià)。

其中50℃水浴溫度下，8位評(píng)價(jià)人員均判定栗仁的香氣口感味道與生板栗一致；60℃水浴溫度下，1位評(píng)價(jià)人員認(rèn)為栗仁口感輕微變糯，香氣味道與生板栗一致，7位評(píng)價(jià)人員判定栗仁的香氣口感味道與生板栗一致；在70℃水浴溫度下，8位評(píng)價(jià)人員均聞出類(lèi)似煮板栗香氣，且部分口感變糯，味道處于生板栗與熟板栗混雜狀態(tài)。因此萃取溫度58.5℃時(shí)可以判定萃取后仍為生板栗。

表4 早豐板栗的揮發(fā)性物質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果Table 4 Determination results of volatile substances contents in ZaoFeng chestnut

2.3 SPME與GC-MS聯(lián)用分析生早豐板栗香氣成分的組成

采用優(yōu)化后的頂空固相微萃取條件分析生早豐板栗中的風(fēng)味物質(zhì)組成，得到21種風(fēng)味物質(zhì)相對(duì)含量見(jiàn)表4。

續(xù)表

由表4可知，香氣成分中醛類(lèi)物質(zhì)占14.40%、醇類(lèi)物質(zhì)占7.06%、酮類(lèi)物質(zhì)占7.72%、酯類(lèi)物質(zhì)占52.97%。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)單因素研究，響應(yīng)面優(yōu)化條件后，選擇出適宜生板栗香氣成分的頂空固相微萃取的條件為：纖維頭65μm聚二甲基硅烷/二乙烯苯（PDMS/DVB）、平衡時(shí)間18 min、萃取時(shí)間50 min、萃取溫度58.5℃，在此優(yōu)化萃取條件下，經(jīng)過(guò)氣質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)出香氣成分為21種，總峰面積48 382.7。其中醛類(lèi)占14.40%、醇類(lèi)占7.06%、酮類(lèi)占7.72%、酯類(lèi)占52.97%。說(shuō)明固相微萃取與氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法可定性與定量分析生板栗的主要香氣成分，為板栗風(fēng)味成分的基礎(chǔ)研究提供一種新的高效、快速、安全、節(jié)能的分析方法。

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