堿性蛋白酶對蛹蟲草蛋白質(zhì)水解的工藝技術(shù)優(yōu)化研究

張新武，朱長文

（1.河南省食品工業(yè)科學(xué)研究所有限公司，鄭州 450053；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，鄭州 450002）

蛹蟲草（Cordyceps militaris）是民間所謂的冬蟲夏草或北蟲草，其實是一種菌，歸屬于蟲草的類別，它的藥用、使用價值都很高，味甘、有益肺和止咳化痰、抗腫瘤等功效[1-3]。蛹蟲草是一種橙黃透明的菌絲，呈管柱狀、圓柱狀、扁平狀，有時從寄主的頭部伸出、有時從節(jié)與節(jié)間生出[4]。蛹蟲草的生長發(fā)育受到營養(yǎng)條件、溫度、含水量、氧氣等[5]外部因素影響。20世紀(jì)80年代后我國在世界上首次突破蛹蟲草人工栽培技術(shù)，并大規(guī)模生產(chǎn)，隨著蛹蟲草研究開發(fā)的不斷進行，國內(nèi)許多廠家生產(chǎn)了保健品，產(chǎn)品投入市場后深受消費者喜愛，蛹蟲草在未來將形成更大的產(chǎn)業(yè)[6]，但蛹蟲草的化學(xué)成分復(fù)雜[7]，主要包括糖分、脂肪、蛋白質(zhì)，其中涵蓋了18種氨基酸、37種無機元素[8]，且栽培生產(chǎn)技術(shù)尚需不斷完善和提高，生產(chǎn)技術(shù)也需進一步普及。蛹蟲草中的蛋白質(zhì)具有一般蛋白質(zhì)的特點，也是大分子物質(zhì)，不易被消化吸收，如何將蛹蟲草中的蛋白質(zhì)降解為小分子的肽類，且易于被人體吸收是今后的研究方向。目前蛹蟲草蛋白質(zhì)水解一般采用的酶是胰蛋白酶或中性蛋白酶[9]，利用堿性蛋白酶進行蛹蟲草蛋白質(zhì)水解工藝研究的文獻未見報道[10]。堿性蛋白酶主要作用于具有芳香族或疏水性氨基酸的底物，其水解能力比中性蛋白酶或胰蛋白酶更強，且堿性蛋白酶具有一定的酯酶活力，其所得產(chǎn)物多肽分子質(zhì)量會隨著水解時間的延長而越來越小，酶解多肽得率高，有利于獲得高產(chǎn)量的小分子蛹蟲草多肽產(chǎn)品[11-12]。

本實驗通過堿性蛋白酶酶解蛹蟲草蛋白質(zhì)并經(jīng)蒸煮滅酶，用適當(dāng)?shù)姆椒ㄓ嬎愠雒附獾寐屎退舛龋╠egree of hydrolysis，DH），最終得出較好的酶解條件和水解條件，經(jīng)酶解、過濾、干燥等工藝處理后，酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量小，酶解剩余物少，酶解得率高，可以進行產(chǎn)業(yè)化推廣應(yīng)用[13-16]，提高企業(yè)的生產(chǎn)效益。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛹蟲草蛋白粉（蛋白質(zhì)含量60%）：河南科騰生物科技有限公司；堿性蛋白酶（10 000 U/g）：南寧龐博生物工程有限公司。甲醛、氫氧化鈉、鹽酸（均為分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3E型雷磁pH計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；DS-1500型實驗型噴霧干燥器：上海矩源機械設(shè)備有限公司；SHA-C型恒溫振蕩器：常州智博瑞儀器制造有限公司；TD25-WS型多管架自動平衡離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；HH-S4型電熱恒溫水浴鍋：北京科偉永興儀器有限公司；LT/W2E型電子天平：常熟市天量儀器有限責(zé)任公司；FA2004N型電子天平：上海菁海儀器有限公司；RE52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

原料→配制溶液→調(diào)節(jié)pH、溫度等條件→酶解→蒸煮滅酶→離心→濃縮處理→噴霧干燥→產(chǎn)品

1.3.2 操作要點

稱取蛹蟲草蛋白粉并配制不同濃度底物的溶液，改變?nèi)芤簆H值、溫度等條件，添加堿性蛋白酶進行酶解處理，酶解期間控制pH值在8.2左右，酶解結(jié)束后85℃滅酶，蒸煮滅酶過后離心除去剩余物，將上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行濃縮，濃縮至一定濃度后噴霧干燥獲得多肽產(chǎn)品。

1.3.3 單因素試驗

采用單因素試驗設(shè)計的方法，以下單因素試驗重復(fù)3次，結(jié)果取其平均值。

（1）酶解時間對蛹蟲草蛋白質(zhì)水解度和酶解得率的影響

稱取蛹蟲草蛋白粉并配制底物濃度為8%的溶液，在堿性蛋白酶加酶量（以干料物質(zhì)計算，下同）為1%，酶解pH值8.20，溫度為50℃，振蕩水浴鍋振蕩頻率108 r/min，置于振蕩水浴鍋中酶解6 h、7 h、8 h、9 h、10 h，酶解期間，前3 h每隔30 min調(diào)節(jié)一次pH值，后期每隔1 h調(diào)節(jié)一次pH值并測定水解度，酶解結(jié)束后85℃滅酶14 h，滅酶過后取出，然后離心10 min（4 000 r/min），料液分離后，將上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行濃縮，濃縮至一定濃度后噴霧干燥獲得多肽產(chǎn)品，稱質(zhì)量計算蛋白質(zhì)酶解得率。

（2）底物濃度對蛹蟲草蛋白質(zhì)水解度和酶解得率的影響

稱取蛹蟲草蛋白粉并配制五組底物濃度分別為6%、7%、8%、9%、10%的溶液，在堿性蛋白酶1%，酶解pH值8.20，溫度為50℃，振蕩水浴鍋振蕩頻率108 r/min的條件下分別置于振蕩水浴鍋酶解8 h，酶解期間，前3 h每隔30 min調(diào)節(jié)一次pH值，后期每隔1 h調(diào)節(jié)一次pH值并測定水解度，酶解結(jié)束后85℃滅酶14 h，滅酶過后取出，然后離心10 min（4 000 r/min），料液分離后，將上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行濃縮，濃縮至一定濃度后噴霧干燥獲得多肽產(chǎn)品，稱質(zhì)量計算蛋白質(zhì)酶解得率。

（3）酶解溫度對蛹蟲草蛋白質(zhì)水解度和酶解得率的影響

稱取蛹蟲草蛋白粉并配制底物濃度為8%的溶液，分別控制酶解溫度為44℃、47℃、50℃、53℃、56℃，在堿性蛋白酶1%，酶解pH值8.20，振蕩水浴鍋振蕩頻率108 r/min的條件下酶解8 h，酶解期間，前3 h每隔30 min調(diào)節(jié)一次pH值，后期每隔1 h調(diào)節(jié)一次pH值并測定水解度，酶解結(jié)束后85℃滅酶14h，滅酶過后取出，然后離心10min（4000r/min），料液分離后，將上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行濃縮，濃縮至一定濃度后噴霧干燥獲得多肽產(chǎn)品，稱質(zhì)量計算蛋白質(zhì)酶解得率。

（4）堿性蛋白酶加酶量對蛹蟲草蛋白質(zhì)水解度和酶解得率的影響

稱取蛹蟲草蛋白粉并配制底物濃度為8%的溶液，分別調(diào)節(jié)堿性蛋白酶添加量0.7%、1.0%、1.3%、1.6%、1.9%，在酶解pH值8.20，酶解溫度為50℃，振蕩水浴鍋振蕩頻率108 r/min的條件下酶解8 h，酶解期間，前3 h每隔30 min調(diào)節(jié)一次pH值，后期每隔1 h調(diào)節(jié)一次pH值并測定水解度，酶解結(jié)束后85℃滅酶14 h，滅酶過后取出，然后離心10 min（4 000 r/min），料液分離后，將上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行濃縮，濃縮至一定濃度后噴霧干燥獲得多肽產(chǎn)品，稱質(zhì)量計算蛋白質(zhì)酶解得率。

1.3.4 蛹蟲草蛋白質(zhì)水解工藝優(yōu)化正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上設(shè)計了正交試驗，確定酶解時間、底物濃度、酶解溫度、加酶量4個因素對蛹蟲草蛋白質(zhì)水解度和酶解得率的影響，試驗因素水平見表1。

表1 蛋白質(zhì)水解工藝優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for protein hydrolysis process optimization

1.3.5 分析方法

（1）氨基酸總量（氨基酸態(tài)氮）的測定[17]

首先量取5 mL水解蛋白液倒入250 mL燒杯中，再加入60 mL已除去CO2的蒸餾水，用干凈的攪拌棒攪拌均勻。隨后滴入0.1 mol/L NaOH，直至pH值為8.2。然后加入已中和的甲醛溶液20.0 mL，并且記錄當(dāng)pH值為9.2時對應(yīng)消耗的NaOH體積，記為V1。最后按相同操作方法做空白對比實驗，過程中記錄對應(yīng)pH數(shù)值所消耗的NaOH體積，記為V2。水解蛋白液中蛋白質(zhì)的氨基酸態(tài)氮含量計算公式如下：

h=1 000×M（V1-V2）/（V×C）

式中：h為水解蛋白液氨基酸態(tài)氮含量，mmol/g；M為NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L；V1為滴定樣品稀釋液消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V2為空白消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；C為所用蛋白質(zhì)溶液的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，g/L；V為用于甲醛滴定的水解液體積，mL。

（2）水解度的測定

采用甲醛滴定法[18-19]，水解度計算公式如下：

DH=h/htot×100%

式中：DH為水解度，%；h為水解蛋白液氨基酸態(tài)氮含量，mmol/g；htot為水解前蛋白液氨基酸態(tài)氮含量，mmol/g（現(xiàn)有資料顯示，htot是一個常數(shù)，蛹蛋白的氨基酸態(tài)氮含量為7.8 mmol/g[20]）。

（3）蛋白質(zhì)酶解得率的計算

蛹蟲草蛋白水解結(jié)束，經(jīng)離心機將料液分離，對上清液進行噴霧干燥，計算蛋白質(zhì)酶解得率，計算公式如下：

蛋白質(zhì)酶解得率=m1/m×100%

式中：m1為上清液噴霧干燥質(zhì)量，g；m為原料質(zhì)量，g。

（4）肽分子質(zhì)量分布的測定[21-22]

參照GB/T 22729—2008《海洋魚低聚肽粉》中的高效液相色譜方法進行分子質(zhì)量測定，直觀的了解產(chǎn)品的分子量分布情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對蛹蟲草蛋白質(zhì)水解工藝的影響

2.1.1 酶解時間對蛹蟲草蛋白質(zhì)水解度和酶解得率的影響

酶解時間對蛹蟲草蛋白質(zhì)水解度和酶解得率的影響結(jié)果見圖1。由圖1可知，酶解時間越長，酶解得率和水解度都隨之增大。在6～8 h時，速率增加的最快。酶解時間對水解度和酶解得率大小存在顯著性差異（P＜0.05）；當(dāng)達到8 h后，水解度和酶解得率都趨于平緩上升狀態(tài)，當(dāng)達到8 h后，兩者都達到穩(wěn)定狀態(tài)。由于6～8h變化較大，且6h的酶解得率和水解度都較低，所以在設(shè)計正交試驗時取8 h、9 h、10 h作為正交試驗水平。

圖1 酶解時間對蛹蟲草蛋白質(zhì)水解度和酶解得率的影響Fig.1 Effect of hydrolysis time on hydrolysis degree and enzymolysis yield of C.militaris protein

2.1.2 底物濃度對蛹蟲草蛋白質(zhì)水解度和酶解得率的影響

底物濃度對蛹蟲草蛋白質(zhì)水解度和酶解得率的影響見圖2。由圖2可知，酶解得率和水解率隨著底物濃度的增加呈下降趨勢，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?%～8%時，底物濃度大小對水解度和酶解得率大小影響顯著（P＜0.05）。由于酶的添加量固定，低底物濃度有利于提高水解度和酶解得率，高底物濃度時水解度和酶解得率反而下降，水解度為6%時最高，所以取底物濃度為6%、7%、8%作為正交試驗水平。

圖2 底物濃度對蛹蟲草蛋白質(zhì)水解度和酶解得率的影響Fig.2 Effect of substrate concentration on hydrolysis degree and enzymolysis yield of C.militaris protein

2.1.3 酶解溫度對蛹蟲草蛋白質(zhì)水解度和酶解得率的影響

酶解溫度對蛹蟲草蛋白質(zhì)水解度和酶解得率的影響見圖3。由圖3可知，酶解溫度對蛹蟲草蛋白質(zhì)水解度和酶解得率的影響較大，隨著酶解溫度的增加，水解度和酶解得率都呈上升趨勢。當(dāng)酶解溫度低于50℃時，水解度和酶解得率的上升趨勢較大，酶解溫度的高低對水解度和酶解得率大小均差異明顯（P＜0.05）；當(dāng)酶解溫度高于50℃時，酶解得率上升趨勢不大，趨于穩(wěn)定；當(dāng)溫度高于53℃，水解度大小差異不顯著（P＞0.05）。因此，取酶解溫度為50℃、53℃、56℃作為正交試驗水平。

圖3 酶解溫度對蛹蟲草蛋白質(zhì)水解度和酶解得率的影響Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on hydrolysis degree and enzymolysis yield of C.militaris protein

2.1.4堿性蛋白酶添加量對蛹蟲草蛋白質(zhì)水解度和酶解得率的影響

堿性蛋白酶添加量對蛹蟲草蛋白質(zhì)水解度和得率的影響見圖4。由圖4可知，堿性蛋白酶的添加量對蛹蟲草蛋白質(zhì)水解度和得率的影響較大，隨著酶的添加量的增加水解度和酶解得率呈上升趨勢，當(dāng)酶的添加量＜1.3%時，水解度和酶解得率上升趨勢較大，酶的添加量大小對酶解得率大小差異顯著（P＜0.05）；當(dāng)酶的添加量＞1.3%時，水解度和酶解得率趨于平緩上升狀態(tài)，對酶解得率大小影響不大（P＞0.05）；因此，取堿性蛋白酶添加量為1.3%、1.6%、1.9%作為正交試驗水平。

圖4 堿性蛋白酶加酶量對蛹蟲草蛋白質(zhì)水解度和得率的影響Fig.4 Effect of alkaline protease addition on hydrolysis degree and enzymolysis yield of C.militaris protein

2.2 堿性蛋白酶對蛹蟲草蛋白質(zhì)水解工藝的正交試驗優(yōu)化

在單因素試驗的基礎(chǔ)上進行正交試驗，以酶解時間、底物濃度、酶解溫度、堿性蛋白酶添加量為評價因素，水解度和酶解得率為評價指標(biāo)進行正交試驗，正交試驗結(jié)果與分析見表2，方差分析分別見表3和表4。

表2 蛋白水解工藝優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for protein hydrolysis process optimization

續(xù)表

從正交試驗結(jié)果分析可知，影響水解度效果的因素為A＞D＞C＞B，由表2可以得出蛹蟲草水解度最高的一組是A3B3C2D1，即酶解時間為10 h、底物濃度為8%、酶解溫度為53℃、堿性蛋白酶的添加量為1.3%，此時的水解度為15.01%。

影響酶解得率效果的因素A＞C＞D＞B，由表2可以得出蛹蟲草酶解得率最高的一組是A1B3C3D3，即酶解時間8 h、底物濃度為8%、酶解溫度56℃、堿性蛋白酶的添加量為1.9%，此時的酶解得率為75.27%，由此可以得出正交試驗優(yōu)化條件就是這兩組組合，所以企業(yè)在生產(chǎn)過程中，可以根據(jù)生產(chǎn)需求選擇合適的優(yōu)化條件，提高產(chǎn)品利用率和企業(yè)效益。

表3 以水解度為評價指標(biāo)的正交試驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results using hydrolysis degree as evaluation index

表4 以蛋白質(zhì)酶解得率為評價指標(biāo)的正交試驗結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results using protein hydrolysis yield as evaluation index

由表3可知，在酶解時間、底物濃度、加酶量以及水解溫度幾個變量中，酶解時間對蛋白質(zhì)水解度帶來的影響顯著（P＜0.05），其他因素影響不顯著。由表4可知，酶解時間對蛹蟲草蛋白質(zhì)水解的酶解得率有顯著性影響（P＜0.05），而底物濃度、加酶量和酶解溫度對酶解得率的影響不顯著（P＞0.05），這說明要提高蛹蟲草蛋白質(zhì)水解的水解度和酶解得率，控制酶解時間尤為關(guān)鍵。

2.3 肽分子質(zhì)量分布的測定結(jié)果

蛹蟲草蛋白粉經(jīng)堿性蛋白酶酶解、過濾、干燥等工藝處理后，采用高效液相色譜法對酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布進行測定，肽分子質(zhì)量峰面積分布結(jié)果見圖5和表5。

圖5 肽分子質(zhì)量峰面積分布圖Fig.5 Distribution figure of peak area of peptide molecular mass

表5 肽分子質(zhì)量分布范圍Table 5 Distribution range of peptide molecular mass

由圖5和表5所示，通過高效液相色譜分析可知，水解濃縮物處理后肽相對分子質(zhì)量＜2 000 Da的占峰值面積的90.8%，主要分布區(qū)域為分子質(zhì)量＜500 Da，占峰面積的55.1%，結(jié)果表明，堿性蛋白酶水解蛹蟲草蛋白質(zhì)后肽的分子質(zhì)量分布大多＜500 Da，效果較理想。

3 結(jié)論

試驗結(jié)果表明，當(dāng)酶解溫度為53℃、底物濃度為8%，堿性蛋白酶添加量1.3%，酶解時間10 h時，水解度最高，為15.01%。當(dāng)?shù)孜餄舛葹?%、堿性蛋白酶添加量為1.9%，酶解時間8 h、酶解溫度為56℃時，酶解得率最高，為75.27%。經(jīng)堿性蛋白酶酶解、過濾、干燥等工藝處理后，水解濃縮物相對分子質(zhì)量＜2000Da的占峰值面積的90.8%，肽分布區(qū)域為分子質(zhì)量＜500 Da；酶解剩余物較少，得率高，但酶解液顏色較深，生產(chǎn)中可以考慮用堿性蛋白酶和胰蛋白酶混合酶解，以達到更好的生產(chǎn)效益。

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