海洋放線菌（Salinispora arenicola）基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的建立

馬艷玲，李海賢，翁 萍，劉澤璇，許小慶，曾 榮*

（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528231）

天然藥物的一個(gè)重要來源是海洋放線菌[1]，其作為一類特殊菌群其可以產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，這些活性物質(zhì)很多都具有成為新藥先導(dǎo)化合物的研制潛能，如多肽、酶類、抗腫瘤物質(zhì)和抗生素等[2-4]。隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，各種病原微生物的耐藥性不斷增強(qiáng)，解決該問題最直接的解決方法就是開發(fā)新型抗生素類藥物。但是近幾年發(fā)現(xiàn)，通過天然藥物篩選來開發(fā)新型藥物的難度越來越大，因此如何采用新的技術(shù)，通過新資源的篩選來開發(fā)新型藥物已成為當(dāng)代天然藥物開發(fā)中亟待需要解決的重要問題[5]。海洋放線菌由于其生活環(huán)境的特殊性—高壓、高鹽、低氧、低溫、寡營(yíng)養(yǎng)和低光照，導(dǎo)致其在長(zhǎng)期進(jìn)化中代謝過程發(fā)生了巨大改變，為了適應(yīng)不良環(huán)境在其代謝過程中會(huì)形成一系列活性特別而且結(jié)構(gòu)特殊的生物活性物質(zhì)[6-7]。曾經(jīng)一度有人認(rèn)為，海洋微生物來源于陸地，因此，在代謝產(chǎn)物上海洋微生物的代謝產(chǎn)物與陸地上的微生物相比并沒有特殊性，直到一系列新型化合物fijimycinsA-C和etamycin A和salinosporamide A的發(fā)現(xiàn)直接顛覆了前人的想法，有力的證明了海洋微生物與陸生微生物相比具有其特殊性，從此，海洋成為了一個(gè)藥物開發(fā)的寶貴資源庫(kù)[8-13]，直接改變了前人曾質(zhì)疑海洋微生物的代謝物質(zhì)具有新穎性的想法[14]。2006年人類首次發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)專屬性海洋放線菌——鹽孢菌屬（Salinispora），該菌株必須依賴海水才能正常生長(zhǎng)，并且可以產(chǎn)生一系列聚酮化合物[15]。2007年研究學(xué)者首次對(duì)該海洋放線菌完成了基因組測(cè)序[16]。2009年已發(fā)現(xiàn)的專屬性海洋放線菌的數(shù)量已達(dá)到22個(gè)[17]。2010年又從海洋中發(fā)現(xiàn)50個(gè)放線菌屬，其中12個(gè)屬于首次發(fā)現(xiàn)[18]。到現(xiàn)在，研究者從菌體的發(fā)現(xiàn)和菌體的次生代謝產(chǎn)物到現(xiàn)在探究對(duì)海洋放射菌次生代謝產(chǎn)物對(duì)沉積物微生物的影響[19-20]。

本研究擬建立海洋放線菌Salinispora arenicola的接合轉(zhuǎn)移體系，探討通過該系統(tǒng)將外源脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）片段導(dǎo)入海洋放線菌Salinisporaarenicola的可能性，旨在為該菌的抗生素生物合成機(jī)制研究和生物學(xué)改造奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

海洋放線菌Salinispora arenicola、整合型質(zhì)粒pIB139和pSET152、接合轉(zhuǎn)移供體菌E.coli ET12567（pUZ8002）、基因克隆受體E.coli DH10B均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑

卡那霉素、阿泊拉霉素、氯霉素、硫鏈絲菌素、硫鏈絲菌素、氨芐青霉素、限制性內(nèi)切酶Lambda/Hind III、DNA回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒：大連寶生物工程有限；黃豆餅粉甘露醇海鹽（soybeanflourmannitolsalt，SFMS）培養(yǎng)基：上海士鋒生物技術(shù)有限公司；LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和2×YT肉湯培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基和抗生素

SFMS培養(yǎng)基用于海洋放線菌Salinispora arenicola的平板培養(yǎng)和接合轉(zhuǎn)移；LB培養(yǎng)基用于細(xì)菌的培養(yǎng)；2×YT肉湯培養(yǎng)基用于孢子的預(yù)萌發(fā)。LB培養(yǎng)基中抗生素終質(zhì)量濃度為：氯霉素25μg/mL，阿泊拉霉素25μg/mL，氨芐青霉素100μg/mL，卡那霉素25μg/mL；接合轉(zhuǎn)移培養(yǎng)基抗生素使用終質(zhì)量濃度為萘啶酮酸25μg/mL，阿泊拉霉素25μg/mL。

1.2 儀器與設(shè)備

LRH-150生化培養(yǎng)箱：上海印溪儀器儀表有限公司；SW-CJ-2FD雙人單面垂直送風(fēng)超凈工作臺(tái)：上?？灯髟O(shè)路儀備有限公司；T100型梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechain reaction，PCR）儀、BYKT-Sub-cellGT型水平電泳槽：美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)

融化已滅菌的SFMS培養(yǎng)基，將溫度降至45℃后，加入適當(dāng)質(zhì)量濃度的抗生素（氯霉素0～100μg/mL，卡那霉素0～100μg/mL，硫鏈絲菌素0～100μg/mL，阿泊拉霉素0～100 μg/mL），將Salinispora arenicola菌株孢子懸液涂布于SFMS培養(yǎng)基平板，并于28℃培養(yǎng)5 d，最終依據(jù)菌株生長(zhǎng)狀態(tài)來評(píng)定該菌株對(duì)抗生素的敏感性。

1.3.2 質(zhì)粒DNA的跨屬接合轉(zhuǎn)移

pSET152整合質(zhì)粒大小為5.5 kbp，是由鏈霉菌噬菌體ΦC31發(fā)展而來的，包含了阿泊拉霉素的抗性基因[acc（3）IV]、完整的大腸桿菌pUC18的復(fù)制子、用于結(jié)合轉(zhuǎn)移的ori T以及噬菌體ΦC31的整合酶（int）和整合位點(diǎn)（attP）。質(zhì)粒pIB139是鏈霉菌的表達(dá)質(zhì)粒，啟動(dòng)子和復(fù)制子分別為ermEp和pBR322 ori，質(zhì)粒標(biāo)簽為L(zhǎng)acZα，具有安普霉素的原核抗性特性。通過CaCl2法將整合型質(zhì)粒pIB139和pSET152導(dǎo)入接合轉(zhuǎn)移的大腸桿菌ET12567（pUZ8002）中，借助于pUZ8002上的tra基因，上述兩種質(zhì)粒可以以接合轉(zhuǎn)移的方式從大腸桿菌進(jìn)入Salinisporaarenicola細(xì)胞中，并發(fā)生整合。

1.3.3 接合轉(zhuǎn)移子的驗(yàn)證

以質(zhì)粒pIB139和pSET152上的阿泊拉霉素抗性基因aac（3）IV為模板，進(jìn)行引物設(shè)計(jì)以驗(yàn)證陽(yáng)性接合轉(zhuǎn)移子，引物如下：

CP1：5'-TTTATCACCACCGACTATTTGC-3'；

CP2：5'-TCATCTCGTTCTCCGCTCA-3'。

提取Salinisporaarenicola總DNA進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）驗(yàn)證。其反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃、1 min，98℃、30 s，58℃、30 s，72 ℃、30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.3.4 穩(wěn)定性驗(yàn)證

于不含抗生素的SFMS平板上接種接合子轉(zhuǎn)移子，28℃培養(yǎng)15 d，然后將菌體再次接種在不含抗生素的SFMS平板上，按照上述方法連續(xù)轉(zhuǎn)接3次進(jìn)行分離純化，然后隨機(jī)挑選單菌落，并將其轉(zhuǎn)接到含有25μg/mL阿泊拉霉素的SFMS平板上，培養(yǎng)5 d后依據(jù)單菌落的生長(zhǎng)狀態(tài)來確定質(zhì)粒pIB139和pSET152在接合轉(zhuǎn)移子中的遺傳穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 海洋放線菌Salinispora arenicola抗生素敏感性檢測(cè)

為確定在進(jìn)行遺傳操作時(shí)的可用選擇標(biāo)記，分別測(cè)試了Salinispora arenicola菌株對(duì)幾種抗生素的敏感性，結(jié)果（表1）顯示，在含有阿泊拉霉素和卡那霉素含量≥25μg/mL的培養(yǎng)基平板上Salinisporaarenicola菌株不能生長(zhǎng)，表明該菌株對(duì)于阿泊拉霉素和卡那霉素比較敏感；在含有50μg/mL氯霉素的培養(yǎng)基平板上Salinisporaarenicola菌株不能生長(zhǎng)，說明該菌株對(duì)于氯霉素較為敏感；在含有100μg/mL硫鏈絲菌素的培養(yǎng)基平板上Salinispora arenicola菌株可以生長(zhǎng)，說明該菌株對(duì)于硫鏈絲菌素不敏感。由于本研究所使用的接合轉(zhuǎn)移質(zhì)粒上攜帶有阿泊拉霉素抗性基因aac（3）IV，因此綜合考慮，用25μg/mL阿泊拉霉素篩選接合轉(zhuǎn)移子。

表1 海洋放線菌S.arenicola在4種不同含量抗生素平板上的生長(zhǎng)情況Table 1 Growth of the actinomycetes S.arenicola in media with four different concentrations of antibiotic tablets

2.2 Salinispora arenicola菌株與大腸桿菌之間兩親接合轉(zhuǎn)移

通過接合轉(zhuǎn)移法分別將質(zhì)粒pIB139和pSET152從供體菌E.coli ET12567（pUZ8002）中導(dǎo)入Salinispora arenicola菌株的孢子和新鮮菌絲體中，結(jié)果表明，當(dāng)以孢子作為受體時(shí)，在接合轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)中，能夠獲得抗性菌落；當(dāng)以新鮮菌絲體作為受體時(shí)，在接合轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)中，不能成功獲得抗性菌落；因此證明，該接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中孢子是最佳受體。

2.3 受體菌和供體菌的比例

為確定該系統(tǒng)供體菌和受體菌最佳比例，將不同比例的Salinispora arenicola孢子和大腸桿菌進(jìn)行混合涂布平板。結(jié)果（表2）表明，當(dāng)大腸桿菌與孢子的比例為15∶1和8∶1時(shí)都能獲得數(shù)量較多的轉(zhuǎn)化子，且大腸桿菌與孢子的比例為8∶1時(shí)獲得的轉(zhuǎn)化子更多，說明在該比例體系中大腸桿菌數(shù)量的持續(xù)增加并不能繼續(xù)提高轉(zhuǎn)化效率，綜合考慮最終選擇大腸桿菌與孢子比例為8∶1。

表2 基于鏈霉菌孢子的接合轉(zhuǎn)移平板統(tǒng)計(jì)Table 2 Statistical analysis of conjugation and transfer based on streptomyspore

2.4 接合轉(zhuǎn)移子的驗(yàn)證

以CP1和CP2為引物對(duì)獲得的接合轉(zhuǎn)移子進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，以質(zhì)粒pIB139和pSET152的擴(kuò)增結(jié)果為陽(yáng)性對(duì)照，以出發(fā)菌株Salinispora arenicola總DNA的擴(kuò)增結(jié)果為陰性對(duì)照，擴(kuò)增結(jié)果（圖1）顯示，2株接合轉(zhuǎn)移子都可成功擴(kuò)增出目標(biāo)882 bp條帶。分別回收2株接合轉(zhuǎn)移子的擴(kuò)增條帶，進(jìn)行TA克隆后送公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，2株接合轉(zhuǎn)移子皆為陽(yáng)性克隆。

圖1 pIB139和pSET152接合轉(zhuǎn)移子的PCR驗(yàn)證Fig.1 PCR verification from pIB139 and pSET152 zygote

2.5 質(zhì)粒pIB139和pSET152在Salinispora arenicola接合轉(zhuǎn)移子中的穩(wěn)定性檢測(cè)

為進(jìn)一步檢測(cè)整合型質(zhì)粒pIB139和pSET152在Salin ispora arenicola接合轉(zhuǎn)移子中的穩(wěn)定性，隨機(jī)挑取已驗(yàn)證正確的300個(gè)接合轉(zhuǎn)移子進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)300個(gè)接合轉(zhuǎn)移子在無抗生素和添加有阿泊拉霉素的SFMS培養(yǎng)基平板上均能生長(zhǎng)。結(jié)果表明，整合型質(zhì)粒pIB139和pSET152在Salinispora arenicola接合轉(zhuǎn)移子中可穩(wěn)定存在。

3 討論

向宿主細(xì)胞中導(dǎo)入外源DNA的方法有很多，包括顯微注射、接合轉(zhuǎn)移、電轉(zhuǎn)化和鈣轉(zhuǎn)化等。其中，接合轉(zhuǎn)移方法價(jià)格最低，而且導(dǎo)入效率較高，因此被廣泛應(yīng)用于放線菌領(lǐng)域的研究。質(zhì)粒是一種閉合環(huán)狀雙鏈DNA[21]，其游離于染色體DNA之外。在進(jìn)行放線菌遺傳操作時(shí)常被作為載體用于介導(dǎo)向宿主細(xì)胞中導(dǎo)入外源DNA，可分為整合型載體和非整合型載體，如整合型質(zhì)粒pIB139和pSET152[22-23]。而非整合型載體又可分為游離型載體和自殺型載體[24]，例如游離型載體pYH7[25-26]。在接合轉(zhuǎn)移過程中，含有外源載體的供體菌和受體菌在同一個(gè)平板上生長(zhǎng)，兩者之間存在相互競(jìng)爭(zhēng)。一般放線菌的生長(zhǎng)速度大大慢于大腸桿菌，所以過量的大腸桿菌會(huì)大大抑制放線菌的正常生長(zhǎng)，最終導(dǎo)致接合轉(zhuǎn)移率大大降低。因此，在建立遺傳操作系統(tǒng)時(shí)摸索受體菌和供體菌之間的最佳比例就顯得尤為重要。

4 結(jié)論

本研究通過對(duì)菌株Salinisporaarenicola抗生素敏感性測(cè)定和基于孢子和菌絲體接合轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的摸索，成功地將整合型載體質(zhì)粒pIB139和pSET152導(dǎo)入菌株Salinispora arenicola的染色體中，并通過PCR的方法證明了所獲得的接合轉(zhuǎn)移子的正確性，充分說明在本研究中建立的遺傳操作系統(tǒng)是有效可行的。

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