高鹽脅迫下米曲霉FUJX 001產(chǎn)草甘膦降解酶空間結(jié)構(gòu)變化研究

童火艷，王鳳雪，吳曉江，張 鵬，萬(wàn) 茵，劉成梅，付桂明*

（1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué) 食品學(xué)院，江西 南昌 330031；3.南昌大學(xué) 中德食品工程中心，江西 南昌 330047）

草甘膦（glyphosate）是一種非選擇性內(nèi)吸傳導(dǎo)型廣譜有機(jī)磷除草劑，具有高效、廣譜、低毒、低殘留、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，已成為世界上應(yīng)用最廣、用量最大的除草劑[1-2]。由于其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、自然降解速度慢，可通過(guò)在飲用水、農(nóng)作物中殘留等多種途徑進(jìn)入人體。世界衛(wèi)生組織（world health organization，WHO）的研究表明[3]，草甘膦會(huì)造成小鼠胎仔數(shù)的減少及精子數(shù)的降低，且人體長(zhǎng)期接觸草甘膦后，會(huì)導(dǎo)致流產(chǎn)及早產(chǎn)率的升高。隨著它的廣泛應(yīng)用，草甘膦及其代謝物氨基甲基膦酸的安全性引起人們的普遍關(guān)注。大豆發(fā)酵食品是中國(guó)乃至東亞國(guó)家歷史悠久的傳統(tǒng)食品[4]。目前在耐草甘膦的轉(zhuǎn)基因大豆豆粒里已檢測(cè)到草甘膦及其代謝物的殘留[5]。隨著我國(guó)對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆產(chǎn)品消耗量和進(jìn)口量的逐年增加，大豆中草甘膦殘留風(fēng)險(xiǎn)將增加。草甘膦在轉(zhuǎn)基因大豆中殘留、加工過(guò)程中的消長(zhǎng)及危害已成為研究的熱點(diǎn)[6-8]。

隨著草甘膦的大量使用，其殘留危害和消除策略受到人們的廣泛關(guān)注。草甘膦在土壤中的自然降解半衰期約為60 d，其降解方式有光降解、化學(xué)降解和微生物降解。微生物降解條件溫和、高效，成為草甘膦降解的未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)。能夠降解草甘膦的微生物種類主要有：枯草芽孢桿菌[9]、銅綠假單胞菌[10]、酵母菌[11]、擬青霉[12]和米曲霉[13]等。微生物降解草甘膦的途徑主要有兩個(gè)：一個(gè)是氨甲基磷酸（aminomethyl phosphonic acid，AMPA）途徑，草甘膦在轉(zhuǎn)氨酶的作用下C-N鍵氧化斷裂生成為AMPA，再在磷?；宜崴饷福╬hosphonoacetate hydrolase，PhnA）的作用下C-P鍵斷裂轉(zhuǎn)化為甲胺和磷酸，甲胺進(jìn)一步分解成甲醛和氨進(jìn)入C-N循環(huán)；另一途徑是肌氨酸途徑，草甘膦中的C-P鍵經(jīng)C-P裂解酶直接作用脫磷酸生成肌氨酸（sarcosine），并在肌氨酸氧化酶（sarcosineoxidase，SOX）的作用下進(jìn)一步分解成甘氨酸[14-16]。

醬油是一種在亞洲國(guó)家盛行的具有咸味和獨(dú)特風(fēng)味的大豆類傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品。它是由豆粕和麩皮（或大豆和小麥）的混合原料通過(guò)米曲霉制曲發(fā)酵，后期添加酵母和乳酸菌進(jìn)行厭氧發(fā)酵，再用鹽水淋洗而成的[17]。米曲霉是食品發(fā)酵工業(yè)中醬油、豆豉制造的主要生產(chǎn)菌之一。米曲霉純種發(fā)酵醬油具有生產(chǎn)工藝條件易于控制、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、安全性高、發(fā)酵的醬油口味好、營(yíng)養(yǎng)豐富[18-19]等優(yōu)點(diǎn)。本研究以課題組前期篩選到的米曲霉（Aspergillusoryzae）FUJX 001[20]來(lái)源的草甘膦降解酶為研究目標(biāo)，探討高鹽條件下，草甘膦降解酶的空間結(jié)構(gòu)變化，以期為高鹽稀態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)醬油過(guò)程中草甘膦殘留的生物酶法消除提供重要的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米曲霉（Aspergillusoryzae）FUJX 001：實(shí)驗(yàn)室篩選的對(duì)草甘膦有較高降解率的菌株；葡聚糖凝膠G-150（Sephadex G-150）、葡聚糖凝膠G-50（Sephadex G-50）填料（1.6 cm×45cm）：安發(fā)瑪西亞生物技術(shù)公司；二乙基氨基乙基（diethyl aminoethyl，DEAE）-葡聚糖凝膠A-50（Sephadex A-50）填料（1.6 cm×45 cm）：上海化學(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)站分裝廠；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）：上海源葉生物科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250（生化試劑）、Tris-HCl（色譜純）：北京索萊寶科技有限公司；甲醇（色譜純）、溴化鉀、硫酸銨、氯化鈉、亞硝酸鈉、硫酸（均為分析純）：西隴科學(xué)股份有限公司；草甘膦（純度≥95%）：成都格拉西亞卡爾科技有限公司。

產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母膏1 g，硫酸銨2 g，可溶性淀粉3 g，氯化鈉2 g，蒸餾水900 mL，121℃滅菌15 min。添加經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾草甘膦溶液（10 g/L，pH 7.0）至草甘膦質(zhì)量濃度為1 g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

ZDX-35BI型座式蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；DHG-9053型電熱恒溫干燥箱：上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；ZHWY-2102C型恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；TGL-16B型高速離心機(jī)：美國(guó)熱電公司；LC-1260型高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）：美國(guó)安捷倫公司；BS-100A自動(dòng)部分收集器、HD-1核酸蛋白紫外檢測(cè)器：上海青浦瀘西儀器廠；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵：鞏義市英峪予華儀器廠；Mili-Q50超純水制備系統(tǒng)：美國(guó)Millipore公司；MOS-450/AF-CD圓二色光譜儀（circular dichroism，CD）：法國(guó)Bio-Logic公司；F-7000熒光分光光度計(jì)、U-2910紫外分光光度計(jì)：日本日立（HIATCHI）高新技術(shù)公司；Nicolet5700傅里葉紅外光譜（Fourier transforminfrared，F(xiàn)T-IR）：美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 草甘膦誘導(dǎo)米曲霉FUJX 001產(chǎn)酶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

對(duì)具有降解草甘膦能力的米曲霉（A.oryzae）FUJX 001進(jìn)行斜面活化，28℃培養(yǎng)3 d，待長(zhǎng)出大量孢子時(shí)，用無(wú)菌生理鹽水（含0.05%Triton X-100）洗脫后制得孢子懸浮液。接種1mL孢子懸浮液于100 mL的產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基，在30℃條件下150 r/min培養(yǎng)2 d獲得種子液，再將100 mL種子液接種到4 L產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基，以2 L/min的流速通入無(wú)菌空氣（過(guò)0.45μm微孔濾膜），30℃培養(yǎng)5 d。

1.3.2 草甘膦降解酶的純化

將抽濾所得的米曲霉菌絲體置于研缽中，快速加入適量的液氮進(jìn)行研磨后獲得菌絲體固體粉末。然后將菌絲體與Tris-HCl緩沖溶液（0.05 mol/L、pH 7.0）按1∶10（g∶mL）的比例混合后，在4℃、7 000×g條件下離心30 min，所得上清液即為草甘膦降解酶粗酶液，測(cè)定粗酶液中草甘膦降解酶酶活和蛋白質(zhì)含量。移取草甘膦降解酶粗酶液20 mL，分別向其中緩慢加入研磨過(guò)的硫酸銨粉末，使溶液中硫酸銨飽和度最終達(dá)到80%，完全溶解后置于4℃條件下過(guò)夜，再經(jīng)4℃、7 000×g條件下離心30 min，獲得沉淀物。用Tris-HCl緩沖溶液將沉淀物溶解定容至10 mL，分別將沉淀溶解液裝入透析袋（截留分子質(zhì)量為1 500 Da）中，透析48 h，經(jīng)過(guò)間斷時(shí)間更換聚乙二醇進(jìn)行濃縮，待溶液濃縮至原體積1/2后取出，測(cè)定硫酸銨沉淀后的草甘膦降解酶酶活和蛋白質(zhì)含量。經(jīng)Sephadex G-150柱層析不能達(dá)到完全分離的效果，因此將收集的樣品進(jìn)一步用Sephadex G-50和DEAE-Sephadex A-50純化。經(jīng)過(guò)Sephadex G-150、Sephadex G-50和DEAE Sephadex A-50三級(jí)柱層析純化，分別收集每級(jí)純化中有草甘膦降解酶活的蛋白峰部分，測(cè)定每級(jí)柱層析純化后的草甘膦降解酶酶活和蛋白質(zhì)含量，并將經(jīng)過(guò)DEAESephadex A-50純化后有草甘膦降解酶酶活部分，透析、濃縮、凍干備用。

1.3.3 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

運(yùn)用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE）變性凝膠電泳分析草甘膦降解酶純度。純化后的草甘膦降解酶樣品溶于Tris-HCl緩沖溶液，使其蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度約為1 mg/mL，100℃煮沸5 min，離心取上清液，電泳上樣量10μL。配制SDS-PAGE變性凝膠電泳分離膠（12 g/100 mL）和濃縮膠（5g/100mL），預(yù)電泳電壓100V，1h，進(jìn)入分離膠后調(diào)到200 V，考馬斯亮藍(lán)R-250染色脫色后，經(jīng)Multifunction Printer掃描得電泳圖[21]。

1.3.4 草甘膦降解酶酶活力的測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)品草甘膦溶液的制備：準(zhǔn)確稱取40 mg草甘膦的標(biāo)準(zhǔn)品溶于少量蒸餾水中，待充分溶解后定容至100 mL。用移液槍分別吸取0、2.00 mL、4.00 mL、6.00 mL、8.00 mL、10.00mL的于100mL容量瓶中，先加入30mL的蒸餾水，再依次加入2 mL硫酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%）、1 mL溴化鉀（2.0mol/L）、2 mL亞硝酸鈉溶液（0.1mol/L），搖勻靜置30min后定容，制得質(zhì)量濃度依次為0、8.00μg/mL、16.00μg/mL、24.00μg/mL、32.00μg/mL、40.00μg/mL的草甘膦標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

取1 mL草甘膦降解酶酶液和9 mL草甘膦溶液（由濃度為0.05 mol/L，pH 7.0的Tris-HCl緩沖溶液配制，草甘膦質(zhì)量濃度為1g/L）分別經(jīng)過(guò)37℃水預(yù)熱5min后，混勻反應(yīng)30min，沸水終止反應(yīng)，冷卻至室溫，獲得反應(yīng)液[20，22]。

參照標(biāo)準(zhǔn)品草甘膦溶液的制備步驟，取2 mL反應(yīng)液，依次加硫酸、溴化鉀和亞硝酸鈉等試劑對(duì)其進(jìn)行亞硝化處理，再采用HPLC法測(cè)定草甘膦含量[23]，分別以有酶無(wú)底物和有底物無(wú)酶的樣品為空白對(duì)照。

色譜條件：ThermoHypersil-ODS色譜柱（150mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇∶水=2∶98（V/V）；流速0.8 mL/min；選用紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)240nm：柱溫25℃；進(jìn)樣量10μL。

草甘膦降解酶的活力[20]定義為：在溫度為37℃，pH 7.0的條件下，每分鐘分解1μg草甘膦所需酶的量為1個(gè)酶活力單位（U）。

1.3.5 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

蛋白質(zhì)含量采用Bradford法[24]測(cè)定，以牛血清白蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在10 mL試管中加入1 mL草甘膦降解酶粗酶液和5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250染液，混勻，室溫靜置5 min后在波長(zhǎng)595 nm處測(cè)定光吸光度值。根據(jù)牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計(jì)算粗酶液蛋白質(zhì)含量。

比酶活、蛋白回收率、酶活回收率、純化倍數(shù)的計(jì)算公式如下：

1.3.6 傅里葉紅外光譜分析檢測(cè)

將經(jīng)1.3.2制備的草甘膦降解酶樣品分別用蒸餾水、15%NaCl溶液和20%NaCl溶液配制成質(zhì)量濃度為0.1mg/mL樣液，混勻靜置10 s后凍干成粉末，在紅外燈下研磨成細(xì)小的粉末，直至可以壓片，然后用壓片機(jī)壓成透明的薄片，在波數(shù)500～4 000 cm-1條件下掃描得到紅外光譜。

1.3.7 紫外-可見(jiàn)光掃描圖譜分析檢測(cè)

將經(jīng)1.3.2制備的草甘膦降解酶樣品分別用蒸餾水、15%NaCl溶液和20%NaCl溶液配制成質(zhì)量濃度為0.07 mg/mL的樣液，并進(jìn)行波長(zhǎng)180～500 nm范圍的波段掃描，觀察其在波長(zhǎng)范圍內(nèi)主要特征吸收峰以及不同鹽濃度對(duì)酶的吸收波長(zhǎng)和吸光強(qiáng)度的影響。

1.3.8 圓二色光譜分析檢測(cè)

將經(jīng)1.3.2制備的草甘膦降解酶樣品分別用蒸餾水、15%NaCl溶液和20%NaCl溶液將其稀釋相同的倍數(shù)，至草甘膦降解酶的質(zhì)量濃度為0.1mg/mL，采用圓二色譜儀進(jìn)行分析檢測(cè)。

檢測(cè)條件：掃描波長(zhǎng)190～260nm，掃描速度100nm/min，分辨率0.000 6 mdeg，光譜間隔0.1 nm。實(shí)驗(yàn)值采取3個(gè)平行樣的掃描平均值。根據(jù)草甘膦降解酶分子中氨基酸的α-碳原子不對(duì)稱性和主鏈構(gòu)象的不對(duì)稱而具有的光學(xué)特性，利用在線dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/process.shtml軟件分析其二級(jí)結(jié)構(gòu)的組成情況。

1.3.9 熒光光譜分析檢測(cè)

分別用蒸餾水、15%NaCl溶液和20%NaCl溶液將1.3.2制備的草甘膦降解酶樣品稀釋質(zhì)量濃度為0.03 mg/mL樣液，采用熒光光譜儀分析樣品的熒光強(qiáng)度及熒光吸收波長(zhǎng)。

檢測(cè)條件：激發(fā)波長(zhǎng)280 nm，掃描光譜的波長(zhǎng)范圍為300～500 nm，發(fā)射與激發(fā)狹縫均為5 nm[25]，樣品檢測(cè)量為3 mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 草甘膦降解酶的純化

由表1可知，米曲霉（A.oryzae）FUJX 001經(jīng)液氮研磨，與Tris-HCl緩沖液按一定比列混合后，經(jīng)離心獲得發(fā)酵上清液100 mL，測(cè)得總蛋白質(zhì)量為156.40 mg，總酶活為1 686 U。經(jīng)Sephadex G-150柱層析獲得的目的酶經(jīng)SDS-PAGE電泳后，發(fā)現(xiàn)仍有一些分子質(zhì)量較小且不等的雜條帶，這可能是由于Sephadex G-150凝膠填料不能達(dá)到完全分離的效果，因此進(jìn)一步采用Sephadex G-50和DEAE-Sephadex A-50柱層析純化。經(jīng)過(guò)Sephadex G-150、Sephadex G-50和DEAESephadex A-50柱層析純化后，酶活回收率分別為51.84%、43.40%和36.21%，純化倍數(shù)分別為1.64、2.42和2.76，說(shuō)明經(jīng)過(guò)此三步柱層析方法純化草甘膦降解酶達(dá)到較為理想的效果。

表1 米曲霉中草甘膦降解酶的分離純化結(jié)果Table 1 Results of separation and purification of glyphosate degradation enzyme from A.oryzae

2.2 草甘膦降解酶的分子質(zhì)量

對(duì)純化后的草甘膦降解酶樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，經(jīng)DEAE-Sephadex A-50柱層析分離純化后得到的草甘膦降解酶樣品有明顯的單一條帶，分子質(zhì)量約為34.7 kDa，表明草甘磷降解酶純度較高，達(dá)到電泳純。

圖1 經(jīng)DEAE-Sephadex A-50柱純化后草甘膦降解酶的SDS-PAGE電泳圖Fig.1 SDS-PAGE electrophoresis of glyphosate degradation enzyme after purification by DEAE-Sephadex A-50 column

2.3 高濃度NaCl對(duì)草甘膦降解酶結(jié)構(gòu)的影響

目前國(guó)內(nèi)大部分以米曲霉發(fā)酵生產(chǎn)醬油采用高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)鹽濃度范圍為15～25%。研究在此高鹽濃度脅迫下，高鹽離子濃度和高滲透壓對(duì)米曲霉中草甘膦降解酶分子空間構(gòu)象的影響，為研究發(fā)酵轉(zhuǎn)基因大豆生產(chǎn)醬油中降解草甘膦提供研究基礎(chǔ)。因此本實(shí)驗(yàn)研究15%和20%NaCl溶液對(duì)草甘膦降解酶結(jié)構(gòu)的影響。

2.3.1 傅里葉紅外光譜檢測(cè)結(jié)果

紅外光譜是一種可以獲知分子化學(xué)基團(tuán)組成和確定物質(zhì)化學(xué)式的高效靈敏的檢測(cè)方法，其主要是依據(jù)光的吸收和電子的躍遷。經(jīng)15%和20%NaCl溶液處理后，草甘膦降解酶的傅里葉紅外光譜檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，在4 000～2 900 cm-1氫鍵區(qū)，可能由O-H、C-H和N-H基團(tuán)振動(dòng)吸收引起，其峰寬、強(qiáng)度大。其中3 390 cm-1處為O-H和N-H伸縮振動(dòng)區(qū)，可能由N-H鍵伸縮振動(dòng)引起，2 977.45 cm-1為C-H伸縮振動(dòng)區(qū)，可能是-CH3鍵引起，2 595 cm-1為S-H伸縮振動(dòng)區(qū)，附近可能由S-H基團(tuán)產(chǎn)生吸收峰。1635～1550cm-1吸收峰可能是C-N鍵和C=O鍵的振動(dòng)吸收，1 554 cm-1處對(duì)應(yīng)酰胺Ⅱ帶，且1 630 cm-1左右振動(dòng)吸收對(duì)應(yīng)分子內(nèi)β-折疊。在1 460～1 000 cm-1范圍內(nèi)可能由CH2鍵的搖擺振動(dòng)吸收引起，1 300～1 295 cm-1范圍內(nèi)吸收峰可能是由氨基酸分子內(nèi)仲酰胺N-H鍵彎曲、C-H鍵的延伸或兩者間耦合造成的酰胺Ⅲ帶所致，1 296 cm-1為C-C伸縮振動(dòng)區(qū)，可能是由CH3鍵的變性、C-N鍵延伸引起。1 140 cm-1、1 042 cm-1附近特征吸收峰分別對(duì)應(yīng)分子中C-C、C-OH的伸縮振動(dòng)[26-27]。在900～850 cm-1之間吸收峰可能是C-C鍵和羧基上的OH鍵延伸所致。

圖2 高濃度NaCl對(duì)草甘膦降解酶紅外光譜的影響Fig.2 Effect of high concentration NaCl on infrared spectroscopy of glyphosate degradation enzyme

由圖2可知，15%和20%的NaCl溶液對(duì)草甘膦降解酶紅外吸收的影響相差不大。與不含NaCl溶液的草甘膦降解酶相比，2種濃度NaCl溶液條件下的草甘膦降解酶在2686.77cm-1、2595.43cm-1、2119.96cm-1、881.78cm-1處的特征吸收峰消失，以及在3193.11cm-1、2977.45cm-1和1629.93～1 139.07 cm-1范圍內(nèi)的特征吸收峰大大削弱。這可能由于高濃度NaCl的存在，造成分子內(nèi)各部分結(jié)構(gòu)間的排斥作用增強(qiáng)，與蛋白分子中極性基團(tuán)發(fā)生相互作用，從而影響部分化學(xué)鍵的伸展方式[28]。

2.3.2 全波段掃描圖譜

草甘膦降解酶溶液經(jīng)不含NaCl、15%NaCl和20%NaCl溶液處理后進(jìn)行180～500 nm全波段掃描的紫外吸收?qǐng)D譜如圖3所示。由圖3可知，不含NaCl的草甘膦降解酶液在波長(zhǎng)214 nm處呈現(xiàn)最大吸收強(qiáng)度2.471，而含15%和20%NaCl的草甘膦降解酶溶液在波長(zhǎng)205 nm處具有最大吸收強(qiáng)度，與不含NaCl的草甘膦降解酶的吸收強(qiáng)度相比，分別下降為2.085、2.012。在15%NaCl和20%NaCl溶液條件下，草甘膦降解酶的最大吸收波長(zhǎng)藍(lán)移9 nm，紫外吸收強(qiáng)度明顯有減弱的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)楦邼舛萅aCl溶液改變酶分子所在微環(huán)境，影響了草甘膦降解酶分子中的生色基團(tuán)或共軛體系等分子結(jié)構(gòu)，從而使草甘膦降解酶的紫外吸收強(qiáng)度減弱，且最大吸收波長(zhǎng)λmax伴隨藍(lán)移現(xiàn)象。

圖3 鹽溶液對(duì)草甘膦降解酶全波段紫外吸收?qǐng)D譜的影響Fig.3 Effect of saline solution on the full band ultraviolet absorption spectrometry of glyphosate degradation enzyme

2.3.3 圓二色譜分析

β-折疊結(jié)構(gòu)相對(duì)明確而穩(wěn)定，而α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲相對(duì)開(kāi)放、靈活[29]。

表2 鹽溶液對(duì)草甘膦降解酶二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Table 2 Effect of saline solution on the secondary structure of glyphosate degradation enzyme

由表2可知，不含NaCl溶液的草甘膦降解酶二級(jí)結(jié)構(gòu)中β-折疊結(jié)構(gòu)比例最高，說(shuō)明未經(jīng)高鹽處理的草甘膦降解酶結(jié)構(gòu)較為有序。與不含NaCl溶液的草甘膦降解酶二級(jí)結(jié)構(gòu)相比，含15%NaCl的草甘膦降解酶分子中α-螺旋比例從19.1%上升至33%，β-折疊比例從39%降低至23.5%，說(shuō)明經(jīng)15%NaCl溶液處理后的草甘膦降解酶結(jié)構(gòu)由有序向無(wú)序轉(zhuǎn)變，草甘膦降解酶結(jié)構(gòu)變得松散、不穩(wěn)定，草甘膦降解酶分子整體結(jié)構(gòu)更加靈活；另外兩種構(gòu)象所占比例變化相對(duì)較??；與含15%NaCl溶液的草甘膦降解酶分子相比，含20%NaCl的草甘膦降解酶分子中無(wú)規(guī)則卷曲比例迅速增加，由26.1%增加至40.1%，β-折疊比例由23.5%進(jìn)一步降低至16.8%，α-螺旋比例由33%下降至25.8%，β-轉(zhuǎn)角所占比例無(wú)明顯變化。這說(shuō)明高濃度NaCl會(huì)誘導(dǎo)β-折疊先向α-螺旋，再向無(wú)規(guī)則卷曲轉(zhuǎn)化。這也許是由于高濃度NaCl的存在，對(duì)草甘膦降解酶分子的側(cè)鏈影響較大，增加了草甘膦降解酶蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)各部分間的離子作用，增加了分子結(jié)構(gòu)的無(wú)規(guī)則卷曲，而無(wú)規(guī)則卷曲這類有序的非重復(fù)性結(jié)構(gòu)經(jīng)常構(gòu)成酶活性部位和其他蛋白質(zhì)特異的功能部位。綜上所述，含20%NaCl的溶液比含15%NaCl的溶液更加有可能對(duì)草甘膦降解酶酶活產(chǎn)生影響。

2.3.4 熒光光譜分析

天然蛋白質(zhì)中只有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸有熒光性，這3種氨基酸殘基由于側(cè)鏈芳香族基團(tuán)不同而有不同的熒光光譜。由于色氨酸殘基熒光量子產(chǎn)率較酪氨酸和苯丙氨酸高，熒光光譜主要顯示色氨酸殘基的熒光性[30]。

圖4 鹽溶液對(duì)草甘膦降解酶熒光光譜的影響Fig.4 Effect of saline solution on fluorescence intensity spectrometry of glyphosate degradation enzyme

由圖4可知，與不含NaCl溶液的草甘膦降解酶的熒光圖譜相比，含有15%和20%NaCl溶液的草甘膦降解酶最大熒光波長(zhǎng)λmax從352.8 nm藍(lán)移到350.0 nm，與不含NaCl溶液的草甘膦降解酶最大熒光強(qiáng)度（250.1）相比，分別增大到272.4和265.8。通常而言，最大熒光波長(zhǎng)與蛋白質(zhì)分子中色氨酸殘基的位置有關(guān)[31]。15%和20%NaCl溶液處理的草甘膦降解酶最大熒光波長(zhǎng)λmax從352.8 nm藍(lán)移到350.0 nm，表明草甘膦降解酶分子中部分色氨酸殘基在高鹽環(huán)境中發(fā)生了掩埋。熒光強(qiáng)度增強(qiáng)說(shuō)明NaCl會(huì)誘導(dǎo)草甘膦降解酶結(jié)構(gòu)發(fā)生一定程度改變[32]，暴露出部分發(fā)色基團(tuán)，減弱了芳香族氨基酸的親水作用或熒光淬滅相關(guān)的作用。隨著鹽濃度從15%增至20%，熒光強(qiáng)度繼續(xù)減弱，表明鹽濃度過(guò)高會(huì)提高蛋白質(zhì)脫水程度，減弱了與色氨酸等構(gòu)象相關(guān)的相互作用力，其三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生一定程度變化[32]。

3 結(jié)論

本研究對(duì)具有降解草甘膦能力的米曲霉（Aspergillus oryzae）FUJX 001進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，收集菌絲體，經(jīng)液氮研磨，獲得的粗酶液經(jīng)硫酸銨沉淀初步分離后，再經(jīng)過(guò)Sephadex G-150、Sephadex G-50和DEAE-Sephadex A-50三級(jí)柱層析純化后，酶活回收率達(dá)36.21%，純化倍數(shù)達(dá)2.76倍。所獲草甘膦降解酶的分子質(zhì)量約為34.7 kDa。結(jié)果表明，與不含NaCl溶液的草甘膦降解酶相比，含15%和20%NaCl溶液的草甘膦降解酶部分特征吸收峰大大削弱和消失；紫外吸收強(qiáng)度減弱，吸收波長(zhǎng)藍(lán)移；α-螺旋比例上升，β-折疊比例降低，無(wú)規(guī)則卷曲比例增加；最大熒光強(qiáng)度增強(qiáng)且伴隨微弱的藍(lán)移。草甘膦降解酶分子在高濃度NaCl下，影響酶分子所在的微環(huán)境，引入較高濃度離子，與蛋白分子中極性基團(tuán)發(fā)生相互作用，同時(shí)引起蛋白質(zhì)脫水，導(dǎo)致其蛋白質(zhì)二、三級(jí)結(jié)構(gòu)均發(fā)生一定變化。為進(jìn)一步研究草甘膦降解酶在高鹽狀態(tài)下如何與底物結(jié)合、蛋白結(jié)構(gòu)與酶活變化的關(guān)系等提供基礎(chǔ)，同時(shí)為草甘膦降解酶在含15%～20%NaCl溶液醬油發(fā)酵條件下，如何發(fā)揮降解草甘膦能力，消除轉(zhuǎn)基因大豆中殘留草甘膦提供一定理論依據(jù)。

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