玉米六肽的酶法糖基化修飾對產(chǎn)物生物活性的影響

王曉杰，劉曉蘭，叢萬鎖，鄭喜群

（齊齊哈爾大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院 黑龍江省普通高校農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

玉米蛋白粉是濕法玉米淀粉加工中產(chǎn)量最大、蛋白質(zhì)含量最高的副產(chǎn)物。玉米蛋白粉中約含62%～71%的蛋白質(zhì)，其主要組分是玉米醇溶蛋白（65%～68%）和谷蛋白（22%～33%）[1]。玉米醇溶蛋白分子內(nèi)存在大區(qū)域的α-螺旋結(jié)構(gòu)，使之具有很強的疏水性，是高憎水蛋白，而谷蛋白（約為22%）也只溶于堿性水溶液中[2]。因此，玉米蛋白的食品功能性很差，國內(nèi)大都作為飼料出售。

目前，食品蛋白質(zhì)的改性主要是采用美拉德反應(yīng)。美拉德反應(yīng)能夠顯著改善蛋白質(zhì)的溶解性、乳化性、泡沫性、凝膠性以及抗氧化活性[3-7]。然而，美拉德反應(yīng)難以控制糖基化度，還會導(dǎo)致產(chǎn)生致突變物而存在安全隱患，所以需要研究一種更安全、更有效的方法來替代美拉德反應(yīng)進(jìn)行食品蛋白質(zhì)的糖基化修飾。

轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（transglutaminase，TGase）能催化蛋白質(zhì)中谷氨酰胺殘基的γ-甲酰胺（供體）和不同化合物的ε-氨基（受體）之間異肽鍵的形成[8]。如果?；荏w由含有賴氨酸殘基的蛋白質(zhì)提供，則發(fā)生蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間的交聯(lián)反應(yīng)；如果受體由含有伯胺基團(tuán)的糖提供，則發(fā)生糖與蛋白質(zhì)的共價結(jié)合反應(yīng)，即發(fā)生蛋白質(zhì)的酶法糖基化修飾。已有研究表明，TGase催化的蛋白質(zhì)糖基化反應(yīng)能夠改善蛋白質(zhì)的溶解性、乳化性、起泡性、流變學(xué)性質(zhì)等功能性質(zhì)[9-11]，并且其反應(yīng)條件比美拉德反應(yīng)更溫和，不存在美拉德反應(yīng)中所存在的副反應(yīng)。

玉米蛋白含有高比例的酰胺基氨基酸，且賴氨酸殘基含量少，因此，在含有伯胺基團(tuán)的糖的反應(yīng)體系中，TGase催化的糖基化反應(yīng)主要發(fā)生在玉米蛋白與供糖體之間，而發(fā)生在蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)反應(yīng)幾率低，因此玉米蛋白是酶法糖基化修飾的良好底物。但是由于糖基化反應(yīng)體系比較復(fù)雜，所以無法直接確認(rèn)糖基化反應(yīng)是否發(fā)生。

基于TGase的催化機理，本研究在前期研究工作中，從玉米蛋白水解物中分離出一個氨基酸序列為谷氨酰胺-谷氨酰胺-脯氨酸-谷氨酰胺-脯氨酸-色氨酸（Gln-Gln-Pro-Gln-Pro-Trp）的六肽，該六肽分子中含有三個谷氨酰胺殘基，在含有D-氨基葡萄糖的反應(yīng)體系中，TGase能將D-氨基葡萄糖共價連接在六肽分子上形成糖肽，由于該反應(yīng)體系中干擾小，反應(yīng)機制清楚，可以利用電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）質(zhì)譜確定D-氨基葡萄糖糖基化反應(yīng)是否發(fā)生，為糖蛋白或糖肽制備的機理提供理論依據(jù)。同時對糖基化修飾產(chǎn)物的部分生物活性進(jìn)行研究，以表征糖基化修飾對玉米六肽生物活性的影響，為玉米糖蛋白/肽在食品工業(yè)的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米六肽（純度＞99%）：上海波泰生物科技有限公司合；微生物TGase（酶活力為1 000 U/g）：泰興市一鳴生物制品有限公司；D-氨基葡萄糖、硫代巴比妥酸：上海生工生物有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2-azino-bis（3-ethyl benzo-thiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS）、2-脫氧-D-核糖：美國Sigma公司；氧化型輔酶Ⅰ：上海寶曼生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PC/PLCLD-53真空冷凍干燥機：美國Millrock公司；TDL-5-A離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；pB-10 pH計：北京賽多利斯儀器有限公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；EnSpire多功能酶標(biāo)儀：珀金埃爾默公司；Waters Xevo G2 QTof高分辨質(zhì)譜儀：美國Waters公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 玉米六肽的糖基化修飾

向3%的玉米六肽溶液中添加D-氨基葡萄糖，保證反應(yīng)體系中?；w與酰基受體的物質(zhì)的量比為1∶3，用濃度為3 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，按60 U/g蛋白的加酶量加入TGase，反應(yīng)混合物充分混勻后，置于37℃恒溫水浴振蕩器中反應(yīng)8 h。反應(yīng)結(jié)束后，置于85℃水浴鍋中滅酶5 min，冷卻至室溫后冷凍干燥即獲得玉米糖肽。

1.3.2 玉米六肽糖基化修飾產(chǎn)物的反相高效液相色譜分析

測定方法參照文獻(xiàn)[2]。色譜柱：Waters C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相A：正丁胺，磷酸，四氫呋喃水溶液；流動相B：流動相A與乙腈等體積混合的溶液；洗脫條件：0～30 min，96%A，4%B；30～45 min，100%B，洗柱；45～65 min，96%A，4%B，平衡20 min；紫外檢測器，檢測波長230 nm；進(jìn)樣量：20μL。

1.3.3 玉米六肽及其糖基化修飾產(chǎn)物的質(zhì)譜分析

采用WatersXevo G2QTof MS系統(tǒng)，離子源為電噴霧離子化（electrospray ionization，ESI）源；離子源溫度：300℃；毛細(xì)管電壓：3.0kV；霧化器溫度：300℃；霧化器流速：600L/h；采集模式：全信息串聯(lián)質(zhì)譜（MSE）。

1.3.4 玉米六肽及其糖基化修飾產(chǎn)物抗氧化活性的測定

測定指標(biāo)包括四種自由基清除活性（DPPH、ABTS、羥基自由基和超氧陰離子自由基），還原力和亞鐵離子螯合活性。測定方法均參照文獻(xiàn)[12]，略有改動，即DPPH自由基和ABTS自由基清除實驗采用多功能酶標(biāo)儀測定。所有實驗均以質(zhì)量濃度為0.012 2 g/mL的D-氨基葡萄糖為對照（在17.5 mL的反應(yīng)體系中含有D-氨基葡萄糖0.207 7 g）。

1.3.5 玉米六肽及其糖基化修飾產(chǎn)物體外促酒精代謝活性的測定

參考瓦勒-霍赫（Valle&Hoch）法[13]，略有改動。將待測物配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、2.0mg/mL、2.5mg/mL的溶液（以蛋白基計）。在測定管中分別加入pH為8.8的焦磷酸鈉緩沖液1.5 mL，27 mmol/L氧化型輔酶Ⅰ（NAD+）1.0mL，體積分?jǐn)?shù)11.5%的乙醇溶液0.5mL，各濃度待測物0.1 mL，混合后，放入25℃的水浴中加蓋溫浴5 min。溫浴后的測定管立即加入乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）（0.25 U/mL）0.1 mL，搖勻后立即用分光光度計測定其在波長340nm處的吸光度值，以后每隔10 s讀數(shù)一次，連續(xù)測定5 min，取反應(yīng)最初的線性部分作圖，記斜率為K p。以0.5mL蒸餾水代替0.5mL體積分?jǐn)?shù)為11.5%的乙醇溶液，作參比調(diào)零，以0.1 mL蒸餾水代替0.1 mL待測物，測定對照組波長340nm處的吸光度值，以后每隔10 s讀數(shù)一次，連續(xù)測定5min，取反應(yīng)最初的線性部分作圖，記斜率為K c。ADH激活率的計算公式如下：

式中：K p為測定管的線性斜率；K c為對照管的線性斜率。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米六肽糖基化反應(yīng)的確認(rèn)

2.1.1 玉米六肽糖基化修飾產(chǎn)物的RT-HPLC分析

氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和糖基化修飾玉米六肽經(jīng)酸水解后，利用鄰氨基苯甲酸衍生試劑標(biāo)記后進(jìn)行HPLC檢測分析，HPLC譜圖如圖1所示。

由圖1可知，D-氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（圖1 A）和玉米六肽糖修飾產(chǎn)物（圖1 B）在保留時間為10 min、11 min的譜圖特征相同，均出現(xiàn)了氨基葡萄糖（峰1）及其在酸性介質(zhì)中衍生時產(chǎn)生的差向異構(gòu)體（氨基甘露糖的衍生產(chǎn)物，峰2），這與JIANG SJ等[9-10]的研究結(jié)果一致。HPLC分析結(jié)果表明，在糖基化修飾產(chǎn)物中含有D-氨基葡萄糖分子。

圖1 D-氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（A）和糖基化修飾玉米六肽（B）的RT-HPLC色譜圖Fig.1 RT-HPLC chromatogram of D-glucosamine standard(A)and glycosylated corn hexapeptide(B)

2.1.2 玉米六肽及其糖基化修飾產(chǎn)物的質(zhì)譜分析

將玉米六肽和經(jīng)D-氨基葡萄糖糖基化修飾生成的糖肽進(jìn)行ESI-質(zhì)譜分析，通過分子質(zhì)量遷移進(jìn)一步表征D-氨基葡萄糖是否成功連接到玉米六肽分子上，實驗結(jié)果如圖2所示。

圖2 玉米六肽（A）及玉米糖肽（B）的ESI-MS圖Fig.2 ESI-MS spectrum of corn hexapeptide(A)and corn glycopeptide(B)

由圖2A可知，玉米六肽的分子質(zhì)量為783.38，實際上玉米六肽的分子量為782，因此，玉米六肽在ESI質(zhì)譜中屬于M+H型分子。在TGase的催化下，如果將一分子D-氨基葡萄糖（分子質(zhì)量為179）共價連接到玉米六肽分子上，將釋放出一分子NH3，使分子量遷移162[15]，即連接一個D-氨基葡萄糖的糖肽的分子質(zhì)量為944。由圖2B可知，有分子質(zhì)量為944的組成存在，說明有一分子的D-氨基葡萄糖共價連接到玉米六肽分子上，確認(rèn)酶法糖基化反應(yīng)發(fā)生。

2.2 糖基化修飾對玉米六肽抗氧化活性的影響

2.2.1 糖基化修飾對玉米六肽DPPH自由基清除能力的影響

將玉米六肽和糖基化修飾產(chǎn)物分別配制成質(zhì)量濃度為0.50mg/mL、0.65mg/mL、0.75mg/mL、0.85mg/mL、0.95mg/mL的溶液，以D-氨基葡萄糖為對照，測定三者對DPPH自由基的清除活性，實驗結(jié)果如圖3所示。

圖3 糖基化修飾玉米六肽對DPPH自由基清除率的影響Fig.3 Effect of the glycosylation on DPPH free radical scavenging rate of corn hexapeptide

由圖3可知，隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，玉米六肽和糖基化修飾產(chǎn)物的DPPH自由基清除率均逐漸增大，并且均大于反應(yīng)體系中D-氨基葡萄糖的清除能力。玉米六肽和糖基化修飾玉米六肽清除DPPH自由基的半最大抑制濃度（50%effective concentration，EC50）值分別為1.28 mg/mL和1.04 mg/mL，說明糖基化修飾改善了玉米六肽對DPPH自由基的清除能力，可能是由于與玉米六肽共價結(jié)合的D-氨基葡萄糖能夠向DPPH自由基提供氫原子，使DPPH自由基形成穩(wěn)定的DPPH-H而致。

2.2.2 糖基化修飾對玉米六肽ABTS自由基清除能力的影響

將玉米六肽和糖基化修飾玉米六肽分別配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL、0.65 mg/mL、0.75 mg/mL、0.85 mg/mL、0.95 mg/mL的溶液，以D-氨基葡萄糖為對照，測定三者對ABTS自由基的清除活性[16]，實驗結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，玉米六肽和糖基化修飾玉米六肽均具有ABTS自由基的清除能力，且清除能力與質(zhì)量濃度之間呈正相關(guān)。玉米六肽和糖基化修飾玉米六肽的EC50值分別為0.895mg/mL和0.799mg/mL，且兩者的ABTS自由基清除率均大于D-氨基葡萄糖本身?？赡苁怯捎贒-氨基葡萄糖共價連接到玉米六肽分子上，D-氨基葡萄糖分子上的羥基與ABTS自由基陽離子發(fā)生反應(yīng)使溶液的吸光度值降低，糖肽清除ABTS自由基的能力增強。

圖4 糖基化修飾玉米六肽對ABTS自由基清除率的影響Fig.4 Effect of the glycosylation on ABTS free radical scavenging rate of corn hexapeptide

2.2.3 糖基化修飾對玉米六肽羥基自由基清除率的影響

將玉米六肽和糖基化修飾玉米六肽分別配制成質(zhì)量濃度為0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL、2.5mg/mL的溶液，以D-氨基葡萄糖為對照，測定三者對羥基自由基的清除活性，實驗結(jié)果如圖5所示。

圖5 糖基化修飾玉米六肽對羥基自由基清除率的影響Fig.5 Effect of the glycosylation on hydroxyl free radical scavenging rate of corn hexapeptide

由圖5可知，玉米六肽和糖基化修飾玉米六肽對羥基自由基的清除能力都隨著樣品質(zhì)量濃度的增加而逐漸增大。在質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL時，玉米糖肽的羥基自由基清除率為23.98%，比玉米六肽高63.13%。糖肽清除羥基自由基的能力增強，分析有兩方面原因：（1）作為氫原子供體，與羥基自由基反應(yīng)抽提氫，阻止了自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；（2）作為金屬螯合劑，能夠與Fe2+螯合而抑制羥基自由基的產(chǎn)生。

另外，玉米糖肽的羥基自由基清除率低于反應(yīng)體系中D-氨基葡萄糖的清除率，分析可能的原因是氨基葡萄糖發(fā)揮清除羥基自由基活性時，依靠其分子上含有活潑氫的羥基和活潑的氨基[17]，在糖基化反應(yīng)過程中，氨基葡萄糖與玉米六肽共價結(jié)合，封閉了兩者分子中一些具有抗氧化功能的基團(tuán)，如活潑氨基等，從而使清除率下降。

2.2.4 糖基化修飾對玉米六肽超氧陰離子自由基清除活性的影響

超氧陰離子是需氧細(xì)胞線粒體內(nèi)電子轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的一種自由基，它在機體內(nèi)會長時間攻擊靶細(xì)胞，具有較強的氧化毒性，從而引起機體的病變與衰老[18]。采用鄰苯三酚自氧化法測定玉米六肽、D-氨基葡萄糖和玉米糖肽對超氧陰離子自由基的清除能力，實驗結(jié)果如圖6所示。

圖6 糖基化修飾玉米六肽對超氧陰離子自由基清除率的影響Fig.6 Effect of the glycosylation on superoxide anion radical scavenging rate of corn hexapeptide

由圖6可知，玉米六肽和玉米糖肽對超氧陰離子自由基的清除能力均與濃度呈正相關(guān)。在質(zhì)量濃度為2.5mg/mL時，玉米糖肽對超氧陰離子自由基的清除率為18.30%，比玉米六肽高16.29%。同時，在質(zhì)量濃度＞1.0 mg/mL時，玉米六肽和玉米糖肽對超氧陰離子自由基的清除率都高于反應(yīng)體系中D-氨基葡萄糖的清除率，說明糖基化修飾改善了玉米六肽的抗氧化活性，原因是D-氨基葡萄糖提供的?；荏w共價連接到玉米六肽的谷氨酰胺殘基上，玉米六肽分子中具有的抗氧化活性的氨基酸，如N-末端的Trp與D-氨基葡萄糖分子中存在還原端基和伯、仲-OH的協(xié)同作用，改善了玉米六肽原有的超氧陰離子自由基清除能力。

2.2.5 糖基化修飾對玉米六肽還原力的影響

將玉米六肽和玉米糖肽分別配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、2.0 mg/mL、2.5 mg/mL的溶液，以D-氨基葡萄糖為對照，測定三者的還原力，實驗結(jié)果如圖7所示。

由圖7可知，玉米糖肽和玉米六肽的還原力都隨著質(zhì)量濃度的增加呈逐漸增加的變化趨勢。與玉米六肽相比，玉米糖肽的還原力明顯增大，在2.5 mg/mL時，玉米糖肽的還原力為1.988，比玉米六肽高143.37%，說明在TGase的催化作用下，玉米六肽成為良好的電子供體，通過提供電子給Fe3+，將其還原成Fe2+形式，使普魯士藍(lán)的生成量增加，波長700 nm處的吸光度值升高，使樣品的還原力增強。

圖7 糖基化修飾玉米六肽對還原力的影響Fig.7 Effect of the glycosylation on reducing power of corn hexapeptide

2.2.6 糖基化修飾對玉米六肽亞鐵離子螯合能力的影響

金屬離子在自由基氧化過程中起催化劑作用，將金屬離子螯合可以鈍化金屬離子的催化作用，大大降低自由基的氧化作用。將玉米六肽和糖基化修飾玉米六肽分別配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、1.5 mg/mL、2.0 mg/mL、2.5 mg/mL的溶液，以D-氨基葡萄糖為對照，測定三者對亞鐵離子的螯合能力，實驗結(jié)果如圖8所示。

圖8 糖基化修飾玉米六肽對亞鐵離子螯合能力的影響Fig.8 Effect of the glycosylation on Fe2+-chelating capacity of corn hexapeptide

由圖8可知，玉米六肽和D-氨基葡萄糖都不具有亞鐵離子螯合能力，而糖基化修飾產(chǎn)物具有亞鐵離子的螯合能力，并且隨著樣品濃度的增加螯合能力逐漸增大。在質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL時，亞鐵離子螯合率達(dá)到13.33%，與玉米六肽相比提高100%。說明糖基化修飾玉米六肽可以通過與亞鐵離子螯合來阻止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而消除自由基的氧化對機體造成傷害，與2.2.3部分的實驗結(jié)果相一致。

2.3 糖基化修飾對玉米六肽體外促酒精代謝活性的影響

將玉米六肽和糖基化修飾玉米六肽分別配制成質(zhì)量濃度為0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL、2.5mg/mL的溶液，以D-氨基葡萄糖為對照，測定三者體外的乙醇脫氫酶激活率，以表征樣品的體外促酒精代謝活性，實驗結(jié)果如圖9所示。

圖9 糖基化修飾玉米六肽對ADH激活率的影響Fig.9 Effect of the glycosylation on ADH activation rate of corn hexapeptide

由圖9可知，D-氨基葡萄糖本身對ADH的激活率僅為0.65%，而玉米六肽和糖基化修飾玉米六肽的ADH激活率均隨著質(zhì)量濃度的升高而逐漸增加。在質(zhì)量濃度為2.5mg/mL時，糖基化修飾玉米肽的ADH激活率為12.11%，比玉米六肽的ADH激活率高9.95%，說明糖基化修飾玉米六肽具有更好的體外促酒精代謝活性，可能的原因是D-氨基葡萄糖和玉米六肽共價結(jié)合的產(chǎn)物更有利于穩(wěn)定NAD+，而NAD+是ADH的輔酶，進(jìn)而使得玉米糖肽的ADH激活率增強。ADH是參與乙醇在體內(nèi)代謝的主要酶，玉米糖肽能夠通過激活A(yù)DH來降低乙醇的濃度而達(dá)到促酒精代謝的目的，對預(yù)防酒精性肝損傷、酒精中毒等具有重要的意義。

3 結(jié)論

為了研究酶法糖基化反應(yīng)的機制，本實驗以微生物TGase作為催化劑，D-氨基葡萄糖為?；荏w，通過糖基化反應(yīng)修飾玉米六肽（Gln-Gln-Pro-Gln-Pro-Trp）制備玉米糖肽。ESI-質(zhì)譜結(jié)果表明，在TGase的催化下，D-氨基葡萄糖與玉米六肽發(fā)生共價連接，酶法糖基化反應(yīng)發(fā)生。與玉米六肽相比，玉米糖肽具有更高抗氧化活性和體外促酒精代謝等生物活性。這些實驗結(jié)果為糖基化玉米肽在食品工業(yè)的應(yīng)用提供參考。

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