海藻糖合酶的結構和催化機制研究進展

王一雯，馬 煥，權淑靜，劉德海*，解復紅，王佰濤，安明理

（河南省科學院 生物研究所，河南 鄭州 450008）

非還原性雙糖—海藻糖自1832年由WIGGERSH A L等從麥角菌中分離提取后，有關其化學結構、理化特性、功能應用及生產(chǎn)研發(fā)等相關研究便層出不窮[1-6]。這種對稱的雙葡萄糖分子結構擁有最小的自由能和化學鍵能，所具有的溫度穩(wěn)定性及pH適應性遠超麥芽糖、蔗糖、葡萄糖等其他糖類小分子，使其成為保持細胞活性、保濕類化妝品中的重要組成成分，更可作為防止食品劣化、保持食品新鮮風味、提升食品品質的獨特食品配料。由于海藻糖在食品、化妝品和制藥等行業(yè)的應用前景巨大，全球市場對海藻糖的需求量逐年上升，海藻糖的生產(chǎn)也由千克級別向成噸規(guī)模不斷發(fā)展。其生產(chǎn)方法從微生物提取這種天然途徑到化學合成、酶轉換法、工程菌構建等人工途徑，每一條有關海藻糖生成途徑的創(chuàng)新和改進都是對相關生產(chǎn)工藝的全面改善與優(yōu)化[7-10]；從簡單檢測海藻糖二聚體構型到借助X射線衍射技術，觀測與海藻糖合成或分解有關的6-磷酸海藻糖合成酶、6-磷酸海藻糖磷酸酶、麥芽寡糖基海藻糖合成酶等各種酶分子的晶體結構[11-12]，每一種蛋白晶體的理化分析均有助于深入了解海藻糖合成與分解機制、改進和完善海藻糖的工業(yè)生產(chǎn)途徑。

酶轉化法生產(chǎn)的海藻糖因其產(chǎn)量高、成本低而逐漸走入了人們的視線，目前已知的酶轉化法生成海藻糖主要分為三種途徑，兩種體系。一是以葡萄糖為底物的6-磷酸海藻糖合成酶（trehalose-6-phosphate synthase，TPS）與6-磷酸海藻糖磷酸酶（trehalose-6-phosphate phosphatase，TPP）途徑（即TPS-TPP途徑，亦稱為OtsA/OtsB途徑），LELOIRLF等[13]在布魯士酵母中首次發(fā)現(xiàn)該途徑。該途徑由6-磷酸海藻糖合成酶催化尿苷二磷酸葡萄糖和6-磷酸葡萄糖，合成6-磷酸海藻糖，再在6-磷酸海藻糖磷酸酯酶作用下脫離磷酸基團最終生成海藻糖。該途徑在自然界中分布最為廣泛，在真核生物、真細菌和古生菌中都有發(fā)現(xiàn)，但反應過程需要大量耗能，因而不被用于工業(yè)生產(chǎn)；二是麥芽寡糖基海藻糖合成酶和麥芽寡糖基海藻糖水解酶途徑（即TreY-TreZ途徑），由日本科研人員在節(jié)桿菌（Arthrobacter sp.）Q36中首次發(fā)現(xiàn)[14]，也包括兩步酶促反應。由麥芽寡糖基海藻糖合成酶（maltooligosyl trehalosesynthase，MTS）催化麥芽糊精，經(jīng)分子間重排作用將α-1,4-糖苷鍵扭轉為α-1,1-糖苷鍵，形成麥芽寡糖基海藻糖，然后由麥芽寡糖基海藻糖水解酶（maltooligosyl trehalosetrehalohydrolase，MTH）水解麥芽寡糖基海藻糖，釋放一分子海藻糖。該途徑主要存在于細菌和古生菌中，反應底物為廉價淀粉且反應單向進行，因而長期以來被廣泛運用到規(guī)模化生產(chǎn)中，但該過程程序繁瑣、技術被國外壟斷導致生產(chǎn)成本一直居高不下。以上4種蛋白酶的晶體結構現(xiàn)已被全面解析出來[15]，兩種途徑均以淀粉為底物，經(jīng)兩步酶解反應最終產(chǎn)生海藻糖，稱為雙酶法[16]，與之相關的催化機理和優(yōu)化改造也在進行全面深入的研究和探索。海藻糖合成酶途徑（trehalosesynthase，TreS途徑）的發(fā)現(xiàn)打破了TreY-TreZ途徑長期壟斷的局面，其利用麥芽糖為原料，經(jīng)分子內(nèi)重排產(chǎn)生海藻糖，稱為單酶法。該途徑反應過程簡單可控且原料成本低廉，已被國內(nèi)外眾多專家視為未來海藻糖酶法生產(chǎn)新方向。但該過程發(fā)現(xiàn)較晚，有關海藻糖合酶的晶體結構及催化作用機制一直未能被人們了解，因而延誤了利用該酶在海藻糖規(guī)?；a(chǎn)中的應用。

海藻糖合酶最早在脂肪桿菌（Pimelobacter sp.）R48中被證實發(fā)現(xiàn)[17]，隨后在棲熱水生菌（Thermus aquaticus）[18]、恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis）[19]、施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）[20]、解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）[21]玫瑰鏈霉菌（Streptosporangium roseum）[22]和玫瑰微球菌（Micrococcus roseus）[23]等各種微生物中被相繼發(fā)現(xiàn)，而自嗜熱菌中分離得到的海藻糖合酶往往反應溫度較高，如在水生棲熱菌中純化得到的海藻糖合酶，其在pH5.5～9.5均能保持穩(wěn)定并且在80℃條件下保溫60 min也不失活[24]，具有廣泛的應用潛力，但有關海藻糖合酶蛋白的晶體學研究成果直到2013年以后才逐漸明朗。

1 海藻糖合酶的結構

海藻糖合酶是一個α-轉移葡萄糖苷酶，屬于糖苷水解酶第13家族成員（簡稱GH13家族），與蔗糖水解酶、淀粉蔗糖酶和蔗糖異構酶等在結構上具有很高的同源性[25-26]。目前所發(fā)現(xiàn)的絕大多數(shù)海藻糖合酶都具有該家族蛋白質所含有的4個保守區(qū)[27]。超速離心分析發(fā)現(xiàn)[28]，海藻糖合酶在液態(tài)和固態(tài)晶體中多以二聚體的形式存在；每個不對稱單元在空間群為P212121的斜方晶系中形成二聚體結構，在空間群為P21的單斜晶系中形成海藻糖合酶四聚體；無論是二聚體結構還是四聚體結構，組成這些低聚物的每條單體結構上幾乎完全相同，二者都具有熱力學穩(wěn)定性，相互之間存在著動態(tài)平衡。

海藻糖合酶的單體結構與GH13家族的大多數(shù)單體酶一樣主要有三大結構域：A區(qū)、B區(qū)和C區(qū)（見圖1）。A區(qū)即N-端結構域，是TreS的催化核心區(qū)域，由（β/α）8三磷酸異構酶筒狀蛋白組成，即8個α-螺旋圍繞8個平行的β-片層所形成的結構蛋白（以下簡稱（β/α）8核心蛋白），酶的活性中心就位于該區(qū)域，其內(nèi)部含有一個催化裂縫，由酸性三聯(lián)體Asp-Glu-Asp和各種保守的底物結合殘基構成[29]。B區(qū)域嵌入了（β/α）8核心蛋白中的第三組β-折疊和α-螺旋，通過16個氫鍵和58個氨基酸殘基組成的疏水性區(qū)域與（β/α）8蛋白緊密互作，其共包含1個α-螺旋、三個反向平行的β-折疊和一個Ca2+結合位點，該離子結合位點可維持A區(qū)和B區(qū)交界面的穩(wěn)定[30]。C區(qū)由兩片反相平行的β-折疊組成，這兩個β-折疊片層分別包含該區(qū)的β1-β3、β5和β7共五條β折疊股以及β4和β6兩條β折疊股。該區(qū)域借助9個氫鍵和47個氨基酸殘基組成的疏水性區(qū)域與A區(qū)緊密相連。TreS的C區(qū)結構與GH13家族成員的區(qū)域結構差別較大，不同物種中的海藻糖合酶其C區(qū)序列也多種多樣，這可能是導致各成員間功能多樣性、差異化的主要原因[28]。TreS還有兩個特有的亞域區(qū)域，將二者分別命名為S7、S8。S7（氨基酸序列從315-361）亞域內(nèi)含有一個短片段的α-7'-螺旋，和B區(qū)一起作為門戶開關負責活性位點的打開和閉合；亞域S8（氨基酸序列從384-449）則沒有表現(xiàn)出規(guī)律性的二級結構，其與C區(qū)共同形成二聚體的交界面[28，31-32]。

圖1 海藻糖合酶二聚體(a)和單體(b)結構帶狀示意圖[28]Fig.1 Banding schematic diagram of the trehalose synthase dimer(a)and monomer(b)structure

GH13家族成員的蛋白結構中還會有金屬離子，它們負責維持蛋白結構的完整性（見圖2）。TreS單體結構中也有5個非常明確的離子結合位點。第一個是Ca2+結合位點，位于結構域A、B交界面活性位點1.3 nm處。該離子周圍結合了Asn132、Asp200、Tyr234、Leu235、Glu237和兩個水分子等共七個配位殘基。第二，一個六配位的Mg2+結合位點，位于A區(qū)內(nèi)的一個溶劑可及環(huán)當中，與催化中心相距2.5nm，Asp51、Asn53、Asp55、Ile57、Asp59和一個水分子與Mg2+六配位相互結合，二者均為TreS蛋白結構中必不可少的金屬離子[33]。

另外還監(jiān)測到4個氯離子結合位點（見圖2）。1號Cl-位于離催化中心0.8 nm的位置，與其配位的是活性位點上的Arg228、Glu343、Arg339和一個水分子。另外兩個Cl-分別位于延伸環(huán)L7和L1附近，分別距離活性中心1.3 nm、1.6 nm。L7中的2號Cl-與His341、Arg374、His341、Asn340、Arg375和一個水分子配位。3號Cl-位于L1中，與Arg47、Leu46和三個水分子相互配位。4號Cl-則偶爾出現(xiàn)于溶劑容易接觸的位置，可能是由于晶體封裝互作而形成[30]。

圖2 海藻糖合酶金屬離子結合位點[29]Fig.2 Metal ion binding site in the structure of trehalose synthase

活性位點是海藻糖合酶的核心結構。由高度保守的酸性三聯(lián)體：Asp-Glu-Asp組成。這三個氨基酸殘基與（β/α）8蛋白的核心碳原子分別相距0.03 nm、0.113 nm和0.127 nm，首位的Asp用于親核反應，Glu起到酸堿催化的作用，末位的Asp用來與底物結合。該活性位點位于一個狹長且封閉的空間內(nèi)，這種構造可保證海藻糖合酶嚴格控制底物較多發(fā)生分子內(nèi)異構化，盡可能減少水解反應。

2 海藻糖合酶的催化作用機制

海藻糖合酶催化麥芽糖和海藻糖相互轉化的可逆反應，麥芽糖和海藻糖都可以作為海藻糖合酶的底物。類似于麥芽寡糖基海藻糖合成酶，海藻糖合酶作為GH13家族中的一個轉葡糖苷酶也是一種分子異構酶，借助230位的Asp攻擊-1亞位點處的底物異頭中心產(chǎn)生共價β-葡糖基酶中間體，使位于+1位割裂的葡萄糖分子在密閉的活性結構內(nèi)旋轉并重新定位，重新攻擊共價中間體，與葡萄糖分子的1-OH或4-OH相連，以分子內(nèi)方式完成異構化反應。兩個芳香殘基Phe256和Phe280在酶活性位點的入口處形成發(fā)夾結構，任意一個突變或者兩個同時突變會導致酶的水解作用極大增強[34]。以海藻糖生成反應為例具體闡述海藻糖合酶的催化機制（見圖3）。首先，海藻糖合酶230位的Asp攻擊麥芽糖異頭中心發(fā)生糖基化，使麥芽糖中位于-1亞位點的葡萄糖分子與海藻糖合酶共價連結形成β-糖基酶中間體。此時，位于海藻糖合酶活性中心+1亞位點游離的葡萄糖分子在封閉的活性中心內(nèi)發(fā)生旋轉，隨酶構象的改變而重新定位。隨后，旋轉后的葡萄糖分子再攻擊β-糖基酶復合物，使其去糖基化，海藻糖合酶與葡萄糖分子分離變回原始構象，兩個葡萄糖分子再以α-1,1-糖苷鍵重新結合生成海藻糖。整個反應體系的熱平衡常數(shù)為4.1∶1，由一對耦合的水解反應維系平衡，海藻糖合酶依賴這種熱力學平衡能夠很容易地催化雙向反應。雖然這種異構化過程發(fā)生在密閉區(qū)域內(nèi)，但依然會伴隨10%的水解副反應，而海藻糖合酶的構象改變過程也成為該變構反應的限速步驟，這種構象的改變與海藻糖合酶特有的亞域B和亞域S7結構相關。類似的麥芽寡糖基海藻糖合酶（TreY）也要通過分子內(nèi)重排異構化進行催化反應，只是反應底物更多、過程更復雜且分子內(nèi)的重排范圍較小[29，35]。

圖3 海藻糖合酶催化機制[29]Fig.3 Catalytic mechanism of trehalose synthase

表1展示了海藻糖合酶在分別以麥芽糖和海藻糖為底物時發(fā)生催化反應的部分動力學參數(shù)。以麥芽糖為底物時，該酶促反應的米氏常數(shù)Km=（8.0±0.9）mmol/L[32]，遠小于以海藻糖為底物時的Km值，說明海藻糖合酶與麥芽糖的親和力高于海藻糖；但海藻糖合酶催化海藻糖的速率要遠遠高于麥芽糖，提示在工業(yè)生產(chǎn)過程中要盡早、及時地分離海藻糖與海藻糖合酶混合物；在以麥芽糖為底物發(fā)生酶促反應時，整個過程的催化效率Kcat/Km是以海藻糖做底物發(fā)生反應的3.2倍，說明海藻糖合酶催化麥芽糖的效率更高，反應有利于向生成海藻糖的方向進行。由此可見，雖然海藻糖合酶生產(chǎn)海藻糖的過程是一個可逆反應，但海藻糖合酶在催化時具有偏向性，而且是偏向于催化麥芽糖、生成海藻糖的方向進行反應。因此，選擇海藻糖合酶大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)海藻糖具有一定的參考性和可行性。

表1 海藻糖合酶催化不同底物時的酶動力學參數(shù)[32]Table 1 Enzyme kinetic parameters of trehalose synthase catalyzing different substrates

3 現(xiàn)狀與展望

海藻糖是一種可替代蔗糖并且口感較好的健康雙糖，適宜高血糖病人食用，但受限于其產(chǎn)量少、成本高，難以在消費市場廣泛普及。目前利用海藻糖合酶TreS途徑開展的海藻糖大規(guī)模生產(chǎn)依然處于實驗室研發(fā)階段。臺灣大葉大學通過制備生物反應器設備率先實現(xiàn)利用人工合成的海藻糖合酶在5 L發(fā)酵罐中成功生產(chǎn)、分離純化出海藻糖，其轉化率達到（64.63±4.05）%，晶體純度為（92.6±0.02）%，回收率為94.2%，并且有效解決了海藻糖合酶催化過程中副產(chǎn)物葡萄糖、殘余麥芽糖的分離問題[36-37]，其轉變的高附加值產(chǎn)品葡糖酸和生物乙醇也進一步增加了該途徑的市場競爭力，這是目前已發(fā)現(xiàn)的利用該酶研發(fā)生產(chǎn)海藻糖較為高效的技術設備和方法。而有關海藻糖合酶的水解副反應和低轉化率等相關問題，有學者在司徒氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）CJ38中分離得到一種新型海藻糖合酶，該酶在催化麥芽糖與海藻糖相互轉化的過程中沒有副產(chǎn)物葡萄糖生成，這為利用海藻糖合酶生產(chǎn)海藻糖提供了一定基礎；更多學者則傾向于改造海藻糖合酶蛋白的分子結構，通過定點突變[38-39]、基因交換[40]等理性蛋白設計，易錯聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）[41]、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）改組[42]等非理性蛋白設計以及化學修飾[43]等改造大分子蛋白質，以提高甚至創(chuàng)新酶的催化活性和物理性質[44]，如WANG JH等[40]將嗜熱棲熱菌海藻糖合酶的C端與對耐輻射球菌（Deinococcusradiodurans）海藻糖合酶融合，構建的新的雜合蛋白熱穩(wěn)定性比原耐輻射球菌海藻糖合酶有了明顯提高，而最適反應溫度也由20℃提高至40℃；而WANGJH等[45]將海藻糖合酶與β-淀粉酶相互融合，構建的融合蛋白能夠直接利用淀粉為底物生產(chǎn)海藻糖，比兩種酶分別作用的效率提高了2～3倍；CHOU H H等[46]通過定點突變技術將Asn530突變成為Pro，使得嗜苦古菌海藻糖合酶熱穩(wěn)定性略有上升，同時當它以甜薯淀粉為底物時，在50℃反應4 h后，海藻糖產(chǎn)量是野生型的1.3倍；王青艷等[47]通過定點突變發(fā)現(xiàn)褐色高溫單孢菌海藻糖合酶等通過定點突變發(fā)現(xiàn)褐色高溫單孢菌海藻糖合酶E352R突變子活力是野生型的1.25倍。也有通過構建、篩選多種表達載體、改造大腸桿菌工程菌等方式以實現(xiàn)海藻糖的高效合成[30，48-49]，但這些研究目前還處于實驗室研發(fā)起步階段，較難突破工業(yè)化生產(chǎn)采用的TreY-TreZ途徑。本文近年來綜述了海藻糖合酶的蛋白結構與催化機制的新成果和新進展，有助于國內(nèi)相關從業(yè)者更新認知、加快關于利用海藻糖合酶生產(chǎn)海藻糖的相關技術研發(fā)，早日實現(xiàn)利用海藻糖合酶規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)海藻糖。

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