醋酸棉酚誘導三株宮頸癌細胞DNA雙鏈斷裂研究

何人可， 湯小玲，　冉晨曦，　鐘建斌，　馬 影，　聶 聰， 趙 晉，　郭 忠

（西北民族大學 醫(yī)學院，甘肅 蘭州730030）

棉酚（gossypol）是一種天然黃色多酚羥基雙萘醛類化合物，主要存在于錦葵科植物棉花的根、莖和種子中。目前棉酚制劑主要有3種：醋酸棉酚、精制棉酚及甲酸棉酚[1]。棉酚最初作為男性避孕藥廣泛運用于臨床。而近年來研究表明，醋酸棉酚（gossypol acetic acid，GAA）具有很顯著的抗腫瘤活性，對多種腫瘤細胞系如宮頸癌、結(jié)腸癌、淋巴癌等產(chǎn)生抑制腫瘤細胞增殖并引起DNA損傷?？鼓[瘤藥物可以引起DNA損傷，其中，DNA雙鏈斷裂（double strand break，DSB）是最嚴重的，常常導致染色體畸變和細胞死亡[2]。本課題組的前期研究成果也證實了醋酸棉酚能夠誘導人粘液表皮樣癌MEC-1細胞DNA雙鏈斷裂[8]。

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤，據(jù)2012年報道，全球女性有宮頸癌52.8萬病例，26.6萬例死亡。尤其是發(fā)展中國家，宮頸癌發(fā)病率呈上升和年輕化趨勢，占全球?qū)m頸癌發(fā)病的80%，嚴重威脅著廣大育齡婦女的健康和生命。人乳頭瘤病毒（HPV）是宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）和宮頸癌的病原體，是最常見的性傳播全球病毒感染[3-4]。

本研究中根據(jù)細胞種類和感染HPV（人乳頭瘤病毒）16和HPV18的情況，分為宮頸腺癌Hela（HPV16-/HPV18+）、宮頸鱗癌 Siha（HPV16+/HPV18-）和 C-33A（HPV16-/HPV18-）[5]。本實驗將不同濃度的GAA作用于這3株宮頸癌細胞，初步探討其殺傷腫瘤細胞的DNA雙鏈損傷機制，為GAA臨床用于化學治療宮頸癌提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

宮頸癌細胞系Hela、Siha、C-33A，購自中國科學院上海生科院細胞資源中心。GAA，陜西宏達植物化工有限公司產(chǎn)品；DMEM，美國Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清，蘭州民海生物工程有限公司產(chǎn)品；MTT，美國Sigma公司產(chǎn)品；二甲基亞砜（DMSO），天津市德恩化學試劑有限公司產(chǎn)品；DAPI，美國Molecular probes公司產(chǎn)品；PI，美國lsbio公司產(chǎn)品；鼠抗γH2AX單克隆抗體，美國Upstate Technology公司產(chǎn)品；FITC標記山羊抗小鼠IgG，北京中山金橋生物技術有限公司產(chǎn)品，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。Olympus AX70熒光顯微鏡，日本Olympus公司產(chǎn)品；酶聯(lián)免疫分析儀，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；DYY-6C型電泳儀，北京市六一儀器廠制造。

1.2　方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及藥物配制Hela、Siha、C-33A細胞在體積分數(shù)5%CO2、37℃的孵育箱中貼壁培養(yǎng)。培養(yǎng)基為含有體積分數(shù)10%滅活胎牛血清、抗生素（100 μg/L 青霉素和 100 μg/L 鏈霉素）的 DMEM。每3～4天傳代一次，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。觀察終濃度為 2.5、5、10、20、40、80、160 μmo1/L 的 GAA對宮頸癌細胞Hela、Siha、C-33A的作用。以未加藥物組（control）作為對照。

1.2.2MTT細胞活性測定細胞培養(yǎng)同1.2.1方法，調(diào)整細胞濃度為2×108個/L，接種至6孔板中，每孔2 mL，置37℃孵箱孵育。培養(yǎng)24 h后，吸棄上清液，加入含 GAA（20 μmol/L）的新培養(yǎng)基，37 ℃、體積分數(shù)5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)，在不同時間點取出。在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

取對數(shù)生長期的Hela、Siha、C-33A細胞，將細胞制成單細胞懸液后，調(diào)節(jié)細胞濃度至7×107個/L，按每孔100 μL接種到96孔板，每組設6個復孔。間隔8～12 h后，吸棄培養(yǎng)液，用含2.5～160 μmol/L GAA的新培養(yǎng)液處理細胞，同時設立空白對照和DMSO溶劑對照，37℃、體積分數(shù)5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h和72 h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，37℃繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)。小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。酶標儀上測定各孔490 nm的吸光度值（A490）。本實驗重復3次。按下式計算出

細胞生長抑制率（%）=（1-M1/M0）×100%（1）式（1）中，M0為對照組吸光值平均值；M1為實驗組吸光值平均值。

以Excel Forcast函數(shù)計算半數(shù)抑制濃度（IC50值）。

1.2.3中性單細胞凝膠電泳實驗收集不同濃度GAA處理24 h以及用20 μmo1/LGAA處理不同時間的Hela、Siha、C-33A細胞進行中性單細胞凝膠電泳。

細胞計數(shù)：制成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為4×107個/L。

制片：將50 μL 1 g/dL的低熔點瓊脂糖凝膠（Agarose typeⅦ）均勻鋪開于毛玻片上，室溫下放置備用。將400 μL的細胞和1.2 mL 1 g/dL低熔點瓊脂糖凝膠40℃下預熱，混勻后迅速鋪到第一層凝膠上（約1.4 mL），冰上固化3 min。

裂解：將載玻片浸沒于新配制的預冷裂解液中（含0.4～0.5 mg/mL蛋白酶K，使用前加入），4℃裂解l h，小心移入37℃孵箱孵育18～20 h。

解旋：TBE漂洗載玻片3次，每次30 min。將載玻片靜置于電泳槽中30 min。注意液面高于載玻片2 mm，避光。

電泳：調(diào)整緩沖液液面高度，使電壓為16～18 V，電流約 7 mA，電泳 25 min。

染色：體積分數(shù)1%H2O2固定玻片10 min，雙蒸水充分洗滌。PI（終質(zhì)量濃度為5 μg/mL）染色30 min，置于密閉濕盒中，4℃保存。（在24 h內(nèi)觀察，以防止熒光淬滅）

觀察：在熒光顯微鏡（10×40 倍）紫外光（UV）的激發(fā)下，DNA圖像呈橘紅色。每個載玻片拍攝至少50個細胞，每個藥物劑量3張片子。本實驗重復3次。圖片用CASP軟件分析。計算尾長（Tail length）、頭部DNA百分含量（Head DNA%），尾部DNA百分含量（Tail DNA）、尾矩（TM）和 Olive尾矩（OTM）等指標。TM定義為：遷移的平均距離與彗尾部DNA的分數(shù)的乘積。OTM計算方法：尾部光密度重心與頭光密度重心之間的距離×尾部DNA百分含量[6]。

1.2.4免疫熒光染色

1） 細胞培養(yǎng)及處理：Hela、Siha、C-33A 細胞培養(yǎng)同1.2.1方法，調(diào)整細胞濃度為2×108個/L，各取35 mm×10 mm培養(yǎng)皿6個，取100 μL細胞懸液接種至已放有蓋玻片上的 （蓋玻片硫酸浸泡過夜，清潔后用體積分數(shù)95%乙醇浸泡后過火，預先放入培養(yǎng)皿中），置37℃孵箱孵育2 h。每個皿加入DMEM培養(yǎng)基2 mL，培養(yǎng)24 h后，吸去上清液，加入含GAA（20 μmol/L）的新培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。 37 ℃、體積分數(shù)5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)，在不同時間點取出。另外，用不同濃度GAA處理Hela、Siha、C-33A細胞24 h后取出。

2）免疫熒光染色檢測γH2AX焦點：免疫熒光檢測參照Macphail等[7]的方法，并稍作改動[8]。被處理的細胞到達時間點后，預冷的TBS洗滌2次；

固定：4 g/dL多聚甲醛固定20 min；TBS洗滌，5 min×3次；

破膜：體積分數(shù)0.2%Triton-X 100破膜，15 min；TBS 洗滌，5 min×3 次；

封閉：TTN 浸泡 10 min；PBS洗滌，5 min×3次；

孵一抗：TTN稀釋鼠γH2AX單克隆一抗，體積比為 1∶500， 孵育過夜，TBS 洗滌，1 min×2 次；TTN洗滌1 min；

孵二抗：TTN稀釋山羊抗鼠FITC-IgG，體積比為 1∶200，孵育 1 h，TBS 洗滌，5 min×3 次，避光；

染核：DAPI終質(zhì)量濃度為 0.05 μg/mL，5 min，TBS 洗滌，5 min×3 次，注意避光；

封片：水性封片液封片，Olympus IX51熒光顯微鏡下觀察；

γH2AX焦點定量按Daniel等的方法[9]，用Image Pro Plus軟件進行，γH2AX焦點定量計數(shù)，γH2AX焦點＞5為陽性細胞。每張片子至少統(tǒng)計800個細胞。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計：數(shù)據(jù)進行Fish student t檢驗。t檢驗，p＜0.05，差異具有顯著性。

1.2.5統(tǒng)計分析方法實驗數(shù)據(jù)用mean±SEM表示，采用SPSS 19.0分析數(shù)據(jù)，單因素方差分析檢驗多組平均數(shù)之間的差別，P＜0.05時認為差別具有統(tǒng)計學意義。

2　實驗結(jié)果

2.1　GAA對C-33A、Siha、Hela細胞增殖的影響

通過體外GAA藥敏試驗對腫瘤細胞進行加藥培養(yǎng)，然后觀察細胞形態(tài)的變化并用MTT法檢測GAA對3種細胞的增殖抑制作用，并用抑制率（%）和IC50來表示。IC50是衡量細胞化療敏感性的指標之一。它是指細胞存活率為50%時的藥物濃度，IC50越大，化療敏感性越低。2.5～160 μmol/L的濃度范圍內(nèi)GAA對Hela、Siha、C-33A細胞的生長呈明顯的抑制作用，呈時間-濃度依賴性。GAA對Hela、Siha、C-33A細胞作用 24 h的 IC50分別為 60.64、48.37、43.27 μmol/L，48 h 的 IC50分 別 為 49.59、39.61、37.25 μmol/L，72 h 的 IC50分 別 為 43.29、37.40、32.68 μmol/L。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GAA能夠明顯抑制3種細胞的生長，IC50大小為C-33A

表1　GAA對C-33A細胞增殖的抑制作用Table 1　Inhibitory effect of GAA on the growth of C-33A cells

表2　GAA對Siha細胞增殖的抑制作用Table 2　Inhibitory effect of GAA on the growth of Siha cells

表3　GAA對Hela細胞增殖的抑制作用Table 3　Inhibitory effect of GAA on the growth of Hela cells

圖1　GAA對C-33A、Siha、Hela細胞增殖抑制作用的差異性比較Fig.1　Difference comparison of inhibitory proliferation effect of GAA on C-33A、Siha and Hela cells

基于3株細胞IC50的數(shù)值，確定最佳藥物干預濃度為20 μmol/L。選取20 μmol/L GAA處理后不同時間，觀察細胞形態(tài)變化的時間依賴性。隨著藥物作用時間延長，越來越多的細胞皺縮、變圓、脫落。至48 h，細胞體積變小，大面積脫落，見圖2。

圖2　20 μmol/L GAA作用Hela細胞不同時間點形態(tài)學變化Fig.2　Effect of 20 μmol/L GAA on cellular morphology of Hela cells at different time

2.2　中性單細胞凝膠電泳檢測DSB

隨著GAA濃度的增加 （作用24 h），Hela細胞頭部DNA百分含量 （Head DNA%）降低，而尾長（Tail length）逐漸變長。 2.5～40 μmol/L 的 GAA 作用細胞24 h，或 20 μmol/LGAA分別作用 0～48 h，Hela、Siha、C-33A彗星細胞的頭部DNA百分含量（Head DNA%）減少，尾長（Tail length）、彗星長度（LComet）、尾部 DNA 百分含量（Tail DNA%）、尾矩（TM）和 Olive尾矩（OTM）增加，說明 GAA對細胞DNA雙鏈損傷程度呈濃度時間-依賴性 （圖3，表4—表9）。其中，GAA對C-33A產(chǎn)生的DSB損傷最為嚴重，Siha次之，Hela最弱，但均明顯（圖4）。

2.3　GAA 誘導 Hela、Siha、C-33A 細胞 γH2AX焦點的形成

觀察免疫組織化學法結(jié)果，20 μmol/L的GAA作用3 h，細胞內(nèi)即出現(xiàn)大量的綠色熒光焦點，且隨著時間延長，焦點數(shù)越多，亮度也增強，48 h時達峰值（圖 5）。 0～40 μmol/L 的 GAA 誘導 Hela、Siha、C-33A內(nèi)H2AX發(fā)生磷酸化，形成焦點，且呈劑量-效應關系（P<0.05）。我們發(fā)現(xiàn)，在同一濃度、同一時間下，C-33A產(chǎn)生的焦點最多，而Hela是最少的（圖6—圖 8，P<0.05）。

3　討論

宮頸癌是唯一病因明確、可以早期進行預防的癌癥，但宮頸癌迄今仍是嚴重威脅婦女健康的常見惡性腫瘤之一，全球范圍內(nèi)其發(fā)病率居惡性腫瘤的發(fā)病率第三位，僅次于大腸癌和乳腺癌，其死亡率位居惡性腫瘤死亡率的第四位，僅次于大腸癌、肺癌和乳腺癌[9]。我國宮頸癌導致的患者死亡率從25歲開始呈持續(xù)上升趨勢，在85歲達到頂峰。性生活混亂、早孕、多育、人口流動性增大，使婦女罹患宮頸癌的危險性隨之增大[10]。

圖3　GAA處理Hela細胞24 h的中性彗星圖像Fig.3　Representative images from the neutral comet assay showing the effects of different concentrations of GAA on Hela cells at 24 h

表4　GAA誘導C-33A細胞DNA斷裂的濃度效應（24 h）Table 4　GAA induces DSB in C-33A cells in a dose-dependent manner（24 h）

表5　GAA誘導Siha細胞DNA斷裂的濃度效應（24 h）Table 5　GAA induced Siha cells DSB in a dose-dependent manner（24 h）

表6　GAA誘導Hela細胞DNA斷裂的濃度效應（24 h）Table 6　GAA induced Hela cells DSB in a dose-dependent manner（24 h）

表7　GAA誘導C-33A細胞DNA斷裂的時間效應（20 μmol/L）Table 7　GAA induced C-33A cells DSB in a time-dependent manner（20 μmol/L）

表8　GAA誘導Siha細胞DNA斷裂的時間效應（20 μmol/L）Table 8　GAA induced Siha cells DSB in a time-dependent manner（20 μmol/L）

表9　GAA誘導Hela細胞DNA斷裂的時間效應（20 μmol/L）Table 9　GAA induced Hela cells DSB in a time-dependent manner（20 μmol/L）

圖4　GAA誘導C-33A、Siha、Hela細胞DNA斷裂的濃度、時間效應的差異性比較（以Tail length為例）Fig.4　DNA damage difference comparison of dose and time effect of GAA on C-33A、Siha and Hela cells （Taking Tail length as an example）

圖5　20 μmol/L GAA處理不同時間誘導Hela細胞γH2AX焦點形成Fig.5　Immunofluorescence staining of γH2AX foci in Hela cells treated with 20 μmol/L GAA for different time

圖6　GAA誘導Hela、Siha、C-33A 細胞生成　γH2AX的濃度效應（24 h）Fig.6　GAA induces γH2AX foci in Hela、Siha、C-33A cells in a dose-dependent manner

圖 7　GAA（20 μmol/L）誘導 Hela、Siha、C-33A 細胞生成γH2AX的時間效應Fig.7　GAA （20 μmol/L）induces γH2AX foci in Hela、Siha、C-33A cells in a time-dependent manner

圖8　GAA誘導Hela、Siha、C-33A細胞γH2AX焦點的形成差異性比較Fig.8　Difference comparison of foci formation of GAA on C-33A、Siha and Hela cells

無論是外源性的物理因素 （電離輻射、紫外線）、化學因素（化療藥物），還是內(nèi)源性的代謝產(chǎn)物，都能引起DNA雙鏈斷裂損傷，且這些損傷均能引起組蛋白H2AX發(fā)生磷酸化。當輕微損傷時，細胞的細胞周期檢查點發(fā)生停滯，DNA會對損傷進行有效的修復；當損傷過度時，則會激發(fā)細胞啟動凋亡程序，造成細胞凋亡。而其中，DNA斷裂是損傷最嚴重的一種[11]。

本研究中采用3株同源細胞株：Hela、Siha、C-33A為研究對象，用MTT（Methyl Thiazolyl Tetrazolium）比色法和單細胞凝膠電泳（SCGE）分別對3株宮頸癌細胞的化療敏感性與DNA損傷進行評估，并將SCGE與以γH2AX為指標的免疫組織化學染色的結(jié)果進行比較，探討將γH2AX做為一個潛在的分子靶點，增加腫瘤細胞對化療的敏感性，提高化療治癌療效的可能性。

我們知道，棉酚作為一種多酚類化合物，體外實驗證實其具有抑制腫瘤細胞增殖及誘導細胞凋亡的作用[11]。它可以通過多種方式和分子靶向?qū)δ[瘤細胞進行抑制增殖和（或）誘導凋亡，包括通過直接損傷線粒體抑制細胞能量代謝，調(diào)低細胞周期調(diào)節(jié)蛋白Rb和cyclinD1蛋白的表達，抑制蛋白激酶C活性，調(diào)節(jié)多元耐藥基因的表達等[12]。本研究通過MTT法檢測表明，在2.5～160 μmol/L濃度范圍內(nèi)，GAA對宮頸癌細胞的生長具有明顯的抑制作用，在對 C-33A，Siha，Hela 3 株細胞的作用中，對 HPV（-）的C33A細胞的生長抑制作用最為明顯。在HPV（+）的2種細胞中，對Siha的抑制作用較Hela細胞明顯，這可能與GAA對宮頸鱗癌的抑制作用強于宮頸腺癌有關。

檢測DNA損傷的方法有很多，比如熒光原位雜交、彗星試驗、高效毛細管電泳、序列凝膠電泳等[7]。但為了更準確地通過DNA損傷程度來反應腫瘤內(nèi)在敏感性，選取2個或多個生物標志物聯(lián)合測定是明智的[13]。本研究借助中性彗星電泳和免疫細胞化學法同時檢測DSB。γH2AX焦點與DSB的數(shù)量關系呈一一對應關系，γH2AX抗體熒光染色是檢測DSB存在的金標準[14]。H2AX磷酸化形成γH2AX其實是一種保護機制，其主要功能是維持DNA損傷修復應答分子持續(xù)地聚集在損傷位點周圍，從而間接修復DNA損傷[15]。所以，γH2AX可作為一個非常敏感的指標來評價各種原因所致的DNA損傷程度。相比于傳統(tǒng)的DSBs的檢測方法，細胞免疫化學法不僅能夠判斷DNA雙鏈的斷裂，還可以直觀計數(shù)γH2AX的表達和斑點數(shù)，操作簡便，而且靈敏度高，是可行、可靠、經(jīng)濟的檢測DSBs的方法[16]。SCGE結(jié)果表明，GAA造成Hela、Siha、C-33A各細胞DNA雙鏈斷裂具有時間和濃度效應（P<0.05）。本實驗采用 的 Tail length（μm）、Comet length （μm）、Head DNA （%）、Tail DNA （%）、Tail moment（TM）、Olive tail moment（OTM）等多項指標，能夠?qū)NA的損傷情況有較為全面的觀察。實驗結(jié)果與MTT實驗相符，3株細胞對化學藥物的敏感性越強，所需干預濃度越低，而產(chǎn)生的DNA損傷效果越強。SCGE方法發(fā)現(xiàn)3株細胞在藥物處理48 h（20 μmol/L）或濃度40 μmol/L（24 h）后 DNA 斷裂最明顯，差異有統(tǒng)計學意義。同時，我們引入γH2AX這個分子靶點進行DSB分析。免疫組織化學法結(jié)果與SAGE一致，即GAA有效地誘導了3株細胞DNA雙鏈斷裂，在同一濃度、同一時間下，C-33A產(chǎn)生的焦點最多，而Hela是最少的。另外我們知道，E6、E7是存在于高危型HPV16/18病毒DNA上的決定性基因片段，2個經(jīng)典腫瘤抑制蛋白E6和E7通過與宿主細胞蛋白相互作用參與處理基因組穩(wěn)定，細胞黏附，細胞增殖、凋亡，細胞周期，DNA修復，代謝，翻譯和轉(zhuǎn)錄信號[17]。當GAA造成細胞DSBs時，可能破壞或刪除了E6和E7基因且阻遏了E1和E2區(qū)域，導致其表達喪失，導致E6和E7表達水平增加[18-19]，導致細胞周期、有絲分裂異常。另外，有研究將HPV16 E6抗核酶導入宮頸癌細胞可顯著降低細胞的端粒酶活性，從而提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，說明抑制HPV DNA的表達，可提高腫瘤的化療敏感性[20]。同理，GAA可以通過抑制端粒酶活性和損傷DNA，提高兩種HPV陽性細胞Siha和Hela的化療敏感性，故二者在相同濃度或相同時間作用下，產(chǎn)生的γH2AX比HPV陰性的C-33A更少。而宮頸鱗癌對GAA的敏感性強于宮頸腺癌，故Siha γH2AX陽性率高于Hela。

在藥物損傷DNA后，若不能及時修復，DNA轉(zhuǎn)錄、復制無法進行，細胞從而走向凋亡。DNA斷裂修復分為以ATM重組為主的同源性重組和以DNAPK（Ku70/Ku80 異二聚體、DNA-PKcs）為主的非同源重組（NHEJ）2 條途徑[21]。 其中，NHEJ修復是人類最主要的途徑，低濃度GAA具有抑制DNA雙鏈斷裂的修復和具有增強化療敏感性的作用。有報道GAA誘導的MEC-1細胞 DNA雙鏈斷裂機制，有可能與NHEJ修復途徑中的DNA-PKcs有關，其過程大概是Ku70與Ku80形成異二聚體，再附于受損的DNA末端，共同激活DNA-PKcs，最后完成修復[22]。

4　結(jié)　語

綜上所述，近年來，棉酚作為一種抗腫瘤藥物受到越來越多的關注，棉酚的抗腫瘤研究展現(xiàn)了其藥用價值和臨床應用的可能性，它引起的Hela、Siha、C-33A細胞DNA的斷裂為它成為有效的抗癌藥物提供了重要的理論依據(jù)。然而，引起雙鏈斷裂的機制并不是完全清楚。目前，有研究表明PI3K家族，包括DNA-PK，ATM和ATR參與了H2AX磷酸化的形成[23]。另外有研究表明，使用PI3K抑制劑渥曼青霉素作用細胞，再用IR處理后，γH2AX焦點形成急劇減少，提示H2AX的磷酸化是PI3K家族成員催化的[24]。隨著對棉酚的DSB機制的不斷研究和完善，為臨床應用治療腫瘤打下堅實的基礎。

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