平歐回交榛快繁體系建立研究初探

周建宇，賈鵬博，姜秀煜

(黑龍江省帶嶺林業(yè)科學(xué)研究所，黑龍江 伊春 153106)

平歐回交榛，是以平歐雜種榛為母本，平榛(CorylusheterophyllaFisch)為父本進行回交選育出的優(yōu)良抗寒品種，平歐雜種榛是以中國平榛為父本，與引入我國的歐洲榛(C.avellanaL.)為母本種間遠緣雜交選育出的品種。由于選育出的優(yōu)良回交榛數(shù)量少，用常規(guī)手段大量繁育無性系苗木是十分困難的，因此，為了得到大量的優(yōu)質(zhì)的平歐回交榛幼苗必須依靠無性繁殖技術(shù)，植物組織培養(yǎng)已經(jīng)逐漸成為一些經(jīng)濟作物、果樹的主要繁殖方式，因此本實驗選取優(yōu)良平歐回交榛萌條為外植體，探索建立平歐回交榛快繁體系的適宜條件，為其組培苗的工廠化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

5月中旬在試驗地采集優(yōu)良平歐回交榛萌條，每個萌條帶腋芽10余個，長度為30～40cm，進行水培，3～6天葉芽膨大，篩選合適的外植體進行組培。

1.2 方法

1.2.1 材料表面消毒處理。采用3種消毒處理方法，將外植體先用軟毛刷輕輕刷洗，流水下沖洗1h，轉(zhuǎn)移到無菌操作臺上，用75%酒精浸泡30s，然后用無菌水沖洗3～5次，再分別在5%NaClO和0.1%HgCl2中浸泡8～10min(見表1)，不斷攪拌，用無菌水沖洗3次，每次持續(xù)90s，將消毒后的莖段置于無菌濾紙上，吸干水分，接種到培養(yǎng)基上，每個處理接種10個外植體，每瓶接種1個外植體，重復(fù)3次，第7天觀察污染率和發(fā)芽率。第30d統(tǒng)計成活率。污染率=(被污染的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù))×100%；發(fā)芽率=(未污染外植體芽萌發(fā)個數(shù)/接種的外植體總數(shù))×100%；成活率=(存活外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù))×100%。

表1 不同滅菌處理

1.2.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基篩選。以MS培養(yǎng)基、DKW培養(yǎng)基、WPM培養(yǎng)基3種培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別在培養(yǎng)基中加入2mg/L 6-BA，0.0015mg/L NAA，0.3mg/L GA3，將已經(jīng)滅菌的莖段剪成1～2cm，每個莖段上帶一個葉芽，接種到上述三種基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基中含瓊脂0.6%，蔗糖含量3.0%，pH5.5。每個處理接種10個外植體，每瓶接種1個外植體，重復(fù)3次，每天記錄外植體生長情況，連續(xù)觀察30d。誘導(dǎo)率=(有不定芽產(chǎn)生的接種外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù))×100%。

1.2.3 增殖培養(yǎng)基的篩選。將在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出新的芽苗分別接種到DKW+1.5mg/L 6-BA+0.01/L IBA+0.1%PVP和DKW+3mg/L 6-BA+0.05 mg/L IBA+0.1% PVP培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)，30d后觀察榛子組培苗的增殖情況。每個處理接種10個外植體，每瓶接種1個外植體，重復(fù)3次，增殖率=(增殖后芽苗的個數(shù)/接種芽苗的個數(shù))×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體滅菌

表2 不同滅菌處理對莖段污染率、發(fā)芽率和成活率的影響

結(jié)果表明(見表2)，不同滅菌劑和滅菌時間處理對平歐回交榛滅菌效果的影響存在很大差別。說明平歐回交榛的外植體滅菌應(yīng)綜合考慮滅菌劑和滅菌時間，才有助于提高外植體的成活率。其污染率(%)的結(jié)果如下，處理1>處理2>處理3，對發(fā)芽率(%)及成活率(%)的影響結(jié)果為：處理3>處理2>處理1。用0.1%HgCl2消毒5min，用無菌水沖洗3次，繼續(xù)用0.1%HgCl2消毒3min時的平均發(fā)芽率以及平均成活率最高，且平均污染率最低。故本實驗條件下滅菌效果最好的處理是3號，其外植體污染率為50%，發(fā)芽率為69%，成活率為45%。

2.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的篩選

在建立平歐回交榛組培快繁體系時，選擇合適的培養(yǎng)基是組織培養(yǎng)成功的前提。本次試驗選擇MS培養(yǎng)基、DKW培養(yǎng)基、WPM培養(yǎng)基3種培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，觀察平歐回交榛在3種基礎(chǔ)培養(yǎng)基上的生長情況。根據(jù)試驗結(jié)果(見表3)，平歐回交榛在DKW培養(yǎng)基中的誘導(dǎo)率與WPM及MS培養(yǎng)基上比較差異較大，大于WPM培養(yǎng)基和MS培養(yǎng)基，其誘導(dǎo)率達到60%。

表3 不同培養(yǎng)基對芽生長的影響

2.3 增殖培養(yǎng)基的篩選

在基本培養(yǎng)基確定的前提下，篩選合適的激素種類和激素配比是組培成功與否的重要因素。試驗結(jié)果表明(見表4)，在DKW+3mg/L 6-BA+0.05mg/L IBA+0.1%PVP培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)的芽苗增殖率達到210%，葉大而綠，增殖的苗莖粗壯，生長情況良好。

表4 不同濃度激素組合對芽增殖的影響

3 討論

本實驗采用平歐回交榛萌條莖段作為外植體，為了獲得無菌材料，在接種之前必須經(jīng)過滅菌處理。不同滅菌劑和滅菌時間的差別是很大的，選擇合適的滅菌劑和處理時間可以降低外植體的污染率，提高外植體的成活率。本試驗用0.1%HgCl2消毒5min，用無菌水沖洗3次，繼續(xù)用0.1%HgCl2消毒3min，其外植體污染率為50%，發(fā)芽率為69%，成活率為45%。

培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，通過對基礎(chǔ)培養(yǎng)基的選擇試驗發(fā)現(xiàn)，采用DKW+2mg/L 6-BA+0.0015mg/L NAA +0.3mg/L GA3培養(yǎng)基對平歐回交榛的誘導(dǎo)率達到60%；除了基礎(chǔ)培養(yǎng)基外，激素的種類和質(zhì)量濃度搭配也是很關(guān)鍵的因素，本試驗中，在DKW+3mg/L 6-BA+0.05mg/L IBA+0.1%PVP培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)的芽苗增殖率達到210%，葉大而綠，增殖的苗莖粗壯。

但平歐回交榛組培苗在生長30d后生長跡象出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，考慮榛屬植物中酚類物質(zhì)含量較高，易出現(xiàn)外植體和培養(yǎng)物的褐化、枯死現(xiàn)象，它對其快繁體系建立能否成功起到?jīng)Q定性的作用，因此榛屬植物組織培養(yǎng)體系的建立比較困難，在今后的試驗中，在培養(yǎng)基中加入抗酚類氧化的藥劑，繼續(xù)探索平歐回交榛的組培擴繁生根試驗，將榛子的組培繁苗生根試驗進一步完善。

圖1 平歐回交榛初代培養(yǎng)

圖2 平歐回交榛的初代培養(yǎng)

圖3 平歐回交榛的繼代培養(yǎng)