IL-34對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎髓系樹突狀細(xì)胞表型的影響*

張 振 孫曉彤 鄔秀娣 黃 華 李 霞 王 冰

(寧波市第一醫(yī)院， 寧波 315010)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)的主要病理特征為滑膜炎癥、滑膜增生，最終破壞軟骨及骨組織，其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜。目前認(rèn)為自身抗體產(chǎn)生與細(xì)胞因子異常表達(dá)都與RA的發(fā)病密切相關(guān)。RA自身抗體的產(chǎn)生往往與外周輔助性T細(xì)胞的過度活化有關(guān)，該輔助性T細(xì)胞可促進(jìn)B細(xì)胞活化從而產(chǎn)生自身抗體[1]。而髓樣樹突狀細(xì)胞(Myeloid dendritic cells,mDC)是體內(nèi)抗原提呈能力最強(qiáng)的細(xì)胞，mDC可通過直接接觸及分泌細(xì)胞因子誘導(dǎo)外周輔助性T細(xì)胞的生成[2]。因此mDC在自身抗體產(chǎn)生環(huán)節(jié)中發(fā)揮了重要作用。

近年發(fā)現(xiàn)IL-34參與RA的發(fā)病，但具體機(jī)制不詳[3]。生理狀態(tài)下IL-34含量很低，主要是參與維系髓系細(xì)胞的生存，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的分化[4]，但對DC的形成目前鮮有報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)通過檢測IL-34誘導(dǎo)下，其對RA單核細(xì)胞、單核細(xì)胞衍生的不成熟DC及成熟DC的表型表達(dá)的影響，初步探討IL-34對RA DC分化的作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料 PBMC取材于2017年5月至2017年7月在浙江省寧波市第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科住院RA患者，共30例，診斷均符合1987年美國風(fēng)濕病學(xué)會(ACR)修訂的RA分類標(biāo)準(zhǔn)[5]，并均排除妊娠、其他自身免疫性疾病和其他急、慢性疾病。本研究中標(biāo)本的采集均經(jīng)過寧波市第一醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號：2017-05)，并取得患者的知情同意。

1.1.2試劑 RPMI1640、胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)購自美國Gibco公司，淋巴細(xì)胞分離液Ficoll購自天津?yàn)畵P(yáng)生物制品科技有限責(zé)任公司，rhIL-4、rhGM-CSF、rhTNF-α購自PeproTech 公司，rhIL-34購自Miltenyi公司，PE-anti-CD83、anti-CD14,APC-anti-CD86單抗、鼠APC IgG 同型對照、鼠PE IgG 同型對照均購自eBioscience公司。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo公司)，流式細(xì)胞儀(BD 公司)。

1.2方法

1.2.1RA PBMC的分離培養(yǎng) 將每2 ml EDTA抗凝血于300 g離心5 min，吸取血漿保存。每管中加入2 ml PBS混勻。向15 ml管中加入4 ml Ficoll溶液，沿管壁將PBS混合血緩慢加入。500 g離心20 min，吸取中間白膜層(1～2 ml)置于另15 ml管中，加入PBS至12 ml離心：250 g，10 min。置24孔板中，10% FBS RPMI培養(yǎng)。

1.2.2DC細(xì)胞的誘導(dǎo) 將取出的PBMC按照密度1×106/ml/孔接種到24孔板中，靜置4 h后吸棄懸浮細(xì)胞。檢測IL-34對不成熟DC誘導(dǎo)表型的影響：將貼壁細(xì)胞分成3組，每組細(xì)胞分別加入GM-CSF(100 ng/ml)+IL-4(50 ng/ml)、IL-4(50 ng/ml)、IL-4(50 ng/ml)+IL-34(50 ng/ml)刺激3 d后分別加入對應(yīng)的新鮮細(xì)胞因子繼續(xù)刺激2 d，收集細(xì)胞進(jìn)行表型鑒定。檢測IL-34對成熟DC誘導(dǎo)表型的影響：將貼壁細(xì)胞分成3組，每組細(xì)胞分別加入GM-CSF(100 ng/ml)+IL-4(50 ng/ml)，刺激3 d后換新鮮的細(xì)胞因子繼續(xù)刺激2 d，然后再分別加入TNF-α(1 000 U/ml)、IL-34(50 ng/ml)、TNF-α(1 000 U/ml)+IL-34(50 ng/ml)刺激2 d，收集細(xì)胞進(jìn)行表型鑒定。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測表型 將PBMC中貼壁的單核細(xì)胞、誘導(dǎo)的各階段DC分別加入Anti-CD83-PE、Anti-CD86-APC和(或)Anti-CD14-PE，4℃避光孵育30 min，PBS(含0.5%BSA)洗滌，流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞表面CD83、CD86和(或)CD14平均熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1IL-34聯(lián)合IL-4在誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化過程中可促進(jìn)其表達(dá)CD83、CD86 見圖1。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示：與未誘導(dǎo)組相比，IL-34+IL-4誘導(dǎo)的DC表面CD83和CD86分子明顯升高，而CD14表達(dá)下降(P<0.005)。不同誘導(dǎo)組間對比，IL-34+IL-4組較GM-CSF+IL-4組CD83表達(dá)無差異(P>0.05)，CD86及CD14表達(dá)均下降(P<0.05)；IL-34+IL-4組較單純IL-4組DC的CD83及CD86表達(dá)均增加(P<0.05)，CD14表達(dá)無差異(P>0.05)。

2.2IL-34 在誘導(dǎo)不成熟DC分化過程中不能促進(jìn)其表達(dá)CD83、CD86 見圖2。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示：IL-34+GM-CSF+IL-4誘導(dǎo)的DC表面CD83和CD86與GM-CSF+IL-4組相比，表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與GM-CSF+IL-4+TNF-α組相比，CD83、CD86表達(dá)均下降(P<0.05)。

2.3IL-34 不能進(jìn)一步促進(jìn)成熟DC表達(dá)CD83、CD86 見圖3。流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示：IL-34在加入誘導(dǎo)的成熟DC體系后，細(xì)胞表面CD83水平較加入前表達(dá)下降(P<0.05)， CD86及CD14表達(dá)無明顯差異(P>0.05)。

圖1 不同細(xì)胞因子誘導(dǎo)單核細(xì)胞向不成熟DC分化表面CD83、CD86及CD14表達(dá)情況Fig.1 Expression of CD83,CD86 and CD14 was detected by FACS on immature cells induced by different cytokinesNote:*.P<0.05;**.P<0.005;***.P<0.000 5.ns.No significant.

圖2 不同細(xì)胞因子誘導(dǎo)不同階段DC表面CD83、CD86表達(dá)情況Fig.2 Expression of CD83 and CD86 on DC surface was induced by different cytokinesNote:*.P<0.05;**.P<0.005;ns.No significant.

圖3 IL-34對成熟DC誘導(dǎo)前后細(xì)胞表面CD83、CD86及CD14表達(dá)情況Fig.3 Expression of CD83,CD86 and CD14 on mature DC induced with or without IL-34Note:*.P<0.05;ns.No significant.

3 討論

RA是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎癥為主要表現(xiàn)的自身免疫病，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。研究表明，炎性細(xì)胞因子的釋放、淋巴細(xì)胞過度活化和自身抗體生成是RA發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)。T淋巴細(xì)胞活化需要抗原提呈細(xì)胞輔助，當(dāng)T淋巴細(xì)胞被激活后，可分泌大量細(xì)胞因子并促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，導(dǎo)致關(guān)節(jié)滑膜增生及炎性細(xì)胞浸潤，進(jìn)而破壞關(guān)節(jié)的正常結(jié)構(gòu)乃至引起系統(tǒng)性病變。本研究體外檢測IL-34對RA單核細(xì)胞向樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中對其表型的影響，從而尋找IL-34參與RA發(fā)病的依據(jù)。

IL-34是白介素家族成員之一，是髓系細(xì)胞生存、增殖和分化的重要調(diào)節(jié)因子，尤其對單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和破骨細(xì)胞的生存發(fā)育作用顯著[6]。IL-34與M-CSF可共用相同的受體CSF-1R，但兩者與受體結(jié)合的特點(diǎn)、信號通路模式仍存在差別[7]。除此之外IL-34在體內(nèi)的表達(dá)具有組織特異性，皮膚角質(zhì)細(xì)胞和處于靜息狀態(tài)的神經(jīng)元可分泌IL-34，對朗格漢斯細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的維持和發(fā)育發(fā)揮關(guān)鍵作用。相關(guān)研究表明體內(nèi)某些細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下可以分泌IL-34，這一過程受NF-κB信號通路調(diào)節(jié)[8,9]。這表明IL-34參與某些疾病的病理過程，其中包括RA。IL-34在RA患者血清及關(guān)節(jié)滑液中增高并與疾病活動(dòng)度指標(biāo)呈正相關(guān)[10]，此外IL-34還可刺激成纖維樣滑膜細(xì)胞及單核細(xì)胞分泌炎性因子，進(jìn)而影響T細(xì)胞亞群的數(shù)量[11,12]。

DC主要由骨髓中髓樣祖細(xì)胞和淋巴樣祖細(xì)胞衍生而來，根據(jù)來源表型及功能的差異，DC又分為髓樣DC、漿細(xì)胞樣DC及來源于間充質(zhì)干細(xì)胞的濾泡DC。其中髓樣DC是體內(nèi)抗原提呈能力最強(qiáng)的細(xì)胞，未成熟狀態(tài)主要具有遷移、抗原加工處理等功能，成熟后能有效激活初始T細(xì)胞。由單核細(xì)胞衍生的成熟髓系DC高表達(dá)CD83、CD86，低表達(dá)CD14[13]。本研究檢測了IL-34誘導(dǎo)不同階段DC對其表型的影響，如結(jié)果所示，IL-34聯(lián)合IL-4可誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化為不成熟DC，細(xì)胞表面CD83、CD86水平均上升，CD14表達(dá)下降，優(yōu)于單獨(dú)使用IL-4，但較傳統(tǒng)GM-CSF聯(lián)合IL-4的作用略低；而IL-34誘導(dǎo)成熟DC分化的作用很弱，在使用GM-CSF、IL-4誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化為不成熟DC后，再加入IL-34，發(fā)現(xiàn)CD83、CD86表達(dá)并沒有明顯變化，且在傳統(tǒng)誘導(dǎo)劑TNF-α誘導(dǎo)成熟DC分化過程中加入IL-34，前后對比發(fā)現(xiàn)CD86和CD14表達(dá)水平無差異，而CD83表達(dá)水平反而下降。該研究表明IL-34在單核細(xì)胞誘導(dǎo)分化為不成熟DC過程中發(fā)揮作用，雖然作用略弱于GM-CSF且對誘導(dǎo)成熟DC分化并不顯著，但仍可推測IL-34促進(jìn)不成熟DC分化進(jìn)而影響其抗原加工處理能力。

綜上所述，本研究通過揭示IL-34對不成熟DC的維系及分化具有較重要的作用，為IL-34參與RA的發(fā)病機(jī)制提供了新的線索，但具體機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究探討。

參考文獻(xiàn)：

[1] Rao DA,Gurish MF,Marshall JL,etal.Pathologically expanded peripheral T helper cell subset drives B cells in rheumatoid arthritis [J]. Nature,2017,542(7639):110-114.

[2] Ueno H,Schmitt N,Palucka AK,etal.Dendritic cells and humoral immunity in humans [J]. Immunol Cell Biol,2010,88(4):376-380.

[3] Baghdadi M,Endo H,Tanaka Y,etal.Interleukin 34,from pathogenesis to clinical applications [J].Cytokine,2017,99:139-147.

[4] Foucher ED,Blanchard S,Preisser L,etal.IL-34-and M-CSF-induced macrophages switch memory T cells into Th17 cells via membrane IL-1α [J]. Eur J Immunol,2015,45(4):1092-1102.

[5] Arentt FC,Edworthy SM,Bloch DA,etal.The ARA 1987 revised criteria for classification on rheumatoid arthritis [J].Arthritis Rheum,1988,31:315-324.

[6] Foucher E,Blanchard S,Preisser L,etal.IL-34 induces the differentiation of human monocytes into immunosuppressive macrophages;antagonistic effects of GM-CSF and IFNγ [J].PLoS One,2013,8(2):e56045.

[7] Wei S,Nandi S,Chitu V,etal.Functional overlap but differential expression of CSF-1 and IL-34 intheir CSF-1 receptor-mediated regulation of myeloid cells [J]. J Leukoc Biol,2010,88(3):495-505.

[8] Yu Y,Yang D,Qiu L,etal.Tumor necrosis factor-α induces interleukin-34 expression through nuclear factor-κB activation in MC3T3-E1 osteoblastic cells [J].Mol Med Rep,2014,10:1371-1376.

[9] Eda H,Shimada H,Beidler D,etal.Proinflammatory cytokines,IL-1β and TNF-α,induce expression of interleukin-34 mRNA via JNK-and p44/42 MAPK-NF-κB pathway but not p38 pathway in osteoblasts [J].Rheumatol Int，2011，31(2011):1525-1530.

[10] Chemel M,Goff B,Brion R,etal.Interleukin 34 expression is associated with synovitis severity in rheumatoid arthritis patients [J].Ann Rheum Dis,2012,71:150-154.

[11] Wang B,Ma Z,Wang M,etal.IL-34 upregulated Th17 production through increased IL-6 expression by rheumatoid fibroblast-like synoviocytes [J].Mediators Inflamm,2017.doi:10.1155

[12] Wang B,Tang Y,Sun X.etal.Increased IL-6 expression on THP-1 by IL-34 stimulation up-regulated rheumatoid arthritis Th17 cells [J].Clin Rheumatol,2017.doi:10.1007.

[13] 朱 娜,王海桃,李 昌,等.未成熟樹突狀細(xì)胞快速分離與體外誘導(dǎo)培養(yǎng)及其鑒定研究[J].中國免疫學(xué)雜志,2017,33(7):1043-1047.

Zhu N,Wang HT,Li C,etal.Isolation,induced culture and identification of immature dendritic cells[J].Chin J Immunol,2017,33(7):1043-1047.