梅毒螺旋體黏附素Tp0751核酸菌影的構(gòu)建及免疫原性研究*

張佳俐 曹二龍 曹龍古 趙飛駿 余 堅 唐一之 符 波 段 武 曾鐵兵

(南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所，衡陽 421001)

梅毒是由梅毒螺旋體(Treponemapallidum，Tp)感染引起的一種嚴(yán)重危害成人和新生兒健康[1]的性傳播疾病，并促進(jìn)艾滋病傳播[2]。梅毒全球流行，近年來疫情呈上升趨勢[3]，尤其在男-男同性性行為者[4]和孕婦[5]中，亟待疫苗的研發(fā)。目前尚無疫苗防控梅毒，阻礙疫苗研究的因素主要包括：Tp不可人工培養(yǎng)；Tp外膜蛋白(Outer membrane protein，OMP)稀少[6]；梅毒疫苗方法學(xué)相對其他病原體疫苗方法學(xué)落后；研究者較少[7，8]。

Tp的OMP(免疫應(yīng)答主要靶位)稀少、缺乏脂多糖，也不產(chǎn)生明顯外毒素，但具有強(qiáng)大侵襲力，能通過生殖道黏膜入侵并經(jīng)血流播散，因此抗黏附作用一直成為梅毒疫苗的研究焦點(diǎn)[7，9]。Tp0751是目前研究最多和最重要的Tp黏附素[7-9]，能吸附血管內(nèi)皮細(xì)胞[10]和細(xì)胞外基質(zhì)(Extracecellular matrix，ECM)[11]并降解后者[12]，導(dǎo)致Tp播散[10,12]；最近觀察到，以重組Tp0751蛋白免疫新西蘭兔后宿主器官的Tp負(fù)荷明顯降低[13]，而且Tp0751在各臨床株間高度保守[13]，以上表明Tp0751是很有希望的梅毒疫苗候選分子。

目前普遍認(rèn)為，理想的梅毒疫苗應(yīng)該能持久誘發(fā)系統(tǒng)和局部黏膜的Th1和Th2混合型應(yīng)答[7-9]。而作為第三代疫苗的核酸疫苗，在應(yīng)用適當(dāng)佐劑/DNA遞送系統(tǒng)條件下可誘導(dǎo)上述特點(diǎn)的免疫應(yīng)答。為此，本研究構(gòu)建Tp0751的核酸疫苗，并以新型菌影(Bacterial ghost，BG)作為天然佐劑和DNA遞送系統(tǒng)，應(yīng)用DNA初免-蛋白加免的異源加免(Heterologous prime-boost) 策略，觀察其誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力，為發(fā)展梅毒新型疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1質(zhì)粒、菌株、細(xì)胞株與實(shí)驗(yàn)動物 質(zhì)粒pcDNA3.1(+)、Tp(Nichols株)、空大腸埃希菌菌影(空EBG)、E.coliJM109菌株、鼠源性巨噬細(xì)胞Raw264.7均為本研究所保存[14]。雌性BALB/c小鼠購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司。

1.1.2主要試劑 Tp感染兔血清、重組Tp0751蛋白(rTp0751)為本研究所保存；Taq DNA聚合酶、BamHⅠ、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購自美國NEB公司；Tp DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，質(zhì)粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒為美國Omega生物技術(shù)公司產(chǎn)品；HRP-羊抗兔IgG、HRP-羊抗鼠IgG與SIgA為美國Proteintech公司產(chǎn)品；CCK-8淋巴細(xì)胞增殖試劑盒購自海門碧云天生物技術(shù)研究所，IFN-γ ELISA試劑盒為美國eBioscience公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1pcD/Tp0751真核表達(dá)載體構(gòu)建 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫，設(shè)計去除信號肽序列的Tp0751擴(kuò)增引物，P1:5′CGCGGATCCCGGGACACCGCCGCA 3′(劃線為BamHⅠ酶切位點(diǎn));引物 P2:5′CCGCTC-GAGTTAGGGCGAAGGAGCACTAGCC 3′(劃線為XhoⅠ酶切位點(diǎn))，引物由上海生工公司合成。以Tp DNA為模板(本所保存)，PCR擴(kuò)增Tp0751基因，將其克隆入pcDNA3.1(+)質(zhì)粒，構(gòu)建成真核表達(dá)重組體pcD/Tp0751，酶切及測序鑒定(廣州英濰捷基公司測序)。

1.2.2pcD/Tp0751裝載菌影 在制備的100 μl pcD/Tp0751中，依次加入用溫控法預(yù)先制備的100 μlE.coliJM109空菌影(50 mg/ml)、250 μl CaCl2(0.1 mol/L)，最后加PBS(0.01 mol/L,pH7.4)至總體積1.0 ml，同時用核酸蛋白儀測定質(zhì)粒濃度(C裝載前)，混勻后24℃孵育30 min，然后12 000 r/min離心5 min，取上清測定質(zhì)粒濃度(C裝載后)，計算質(zhì)粒裝載率：η′=(1-C裝載后/C裝載前)×100%。

1.2.3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞與表達(dá)蛋白鑒定 取裝載pcD/Tp0751的菌影100 μl轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，培養(yǎng)24 h。提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞蛋白，電泳轉(zhuǎn)膜，以Tp感染兔血清(1∶100稀釋)為一抗，HRP-羊抗兔IgG(1∶2 000稀釋)為二抗，Western blot鑒定目的蛋白表達(dá)。

1.2.4動物免疫與血清收集 選用6～7周齡的BALB/c雌性小鼠48只，隨機(jī)分為6組，每組8只，雙側(cè)股四頭肌等量肌注，每次100 μl，間隔兩周免疫一次，共三次。A、B、C組為對照組，分別注射PBS、空EBG[1 mg/(只·次)]、空質(zhì)粒pcD[20 μg/(只·次)]，D、E、F組為實(shí)驗(yàn)組，分別注射裸pcD/Tp0751[20 μg/(只·次)]、pcD/Tp0751-BG[1 mg/(只·次)，約含20 μg DNA]、pcD/Tp0751-BG[免疫2次，1 mg/(只·次)]+rTp0751[加免1次，0.3 mg/(只·次)]。首次免疫后第2、4、6、12周，采集小鼠尾靜脈血分離血清，同時收集生殖道沖洗液，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5特異性血清IgG與生殖道SIgA檢測 用rTp0751(10 μg/ml)以每孔100 μl包被96孔酶標(biāo)板，以HRP-羊抗鼠IgG/SIgA(1∶10 000稀釋)為二抗，間接ELISA分別檢測待測血清(1∶100稀釋)和生殖道沖洗液(1∶50稀釋)中特異性IgG和SIgA的A450值。測定F組在末次加免后IgG和SIgA效價。

1.2.6淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn) 首次免疫后第12周處死小鼠，無菌取小鼠脾臟，制備淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×104/孔，陽性對照每孔以100 μg ConA、陰性對照組加PBS、實(shí)驗(yàn)組每孔以10 μg rTp0751刺激培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加入CCK-8溶液10 μl(5 mg/ml)，培養(yǎng)至結(jié)束，酶標(biāo)儀測定A450值，計算刺激指數(shù)(SI)=刺激組A450值/無刺激陰性對照組A450值。

1.2.7IFN-γ分泌水平檢測 調(diào)整淋巴細(xì)胞數(shù)至1×105/孔，每孔以10 μg rTp0751刺激培養(yǎng)48 h，離心細(xì)胞，收集上清液，用ELISA試劑盒檢測IFN-γ水平，測定A450值，以標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算IFN-γ含量。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，每組標(biāo)本取平均值，應(yīng)用t-Test檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1真核表達(dá)載體構(gòu)建鑒定與菌影裝載率 真核重組表達(dá)質(zhì)粒pcD/Tp0751經(jīng)雙酶切得到大小與預(yù)期位置相符的5 400 bp和555 bp兩個片段(圖1)，測序結(jié)果與公布Tp0751序列完全一致，表明真核重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒對空菌影的裝載率η′=(1-15.6/65.4)×100%=76.1%。

2.2pcDNA3.1(+)/Tp0751真核重組蛋白鑒定 WB結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒裝載的菌影作用RAW264.7細(xì)胞24 h后，細(xì)胞表達(dá)的目的蛋白與Tp感染兔血清出現(xiàn)了明顯的特異性反應(yīng)(圖2)，表明重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后成功表達(dá)目的蛋白。

2.3特異性抗體水平 D、E、F實(shí)驗(yàn)組小鼠特異性血清 IgG與生殖道SIgA水平均隨免疫次數(shù)增加而增加，各時間點(diǎn)均顯著高于三個對照組(P<0.01)，于末次加免后第8周(初免后第12周)達(dá)到峰值，此時F組IgG與SIgA效價分別為1∶102 400與1∶12 800；首次加免2周(初免后第4周)及以后，E、F組均顯著高于D組(P<0.01)；末次加免2周(初免后第6周)及以后，F(xiàn)組顯著高于E組(P<0.01)(圖3A、B)。

2.4小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖 首次免疫后第12周(末次加免后第8周)，D、E、F組的SI均顯著高于A、B和C組(P<0.01)，E、F組均顯著高于D組(P<0.01)，F(xiàn)組高于E組(P<0.05)(表1)。

2.5鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ水平 首次免疫后第12周(末次加免后第8周)，D、E、F組的IFN-γ水平均顯著高于A、B和C組(P<0.01)，E、F組均顯著高于D組(P<0.01)，F(xiàn)組高于E組(P<0.05)(圖4)。

圖1 pcDNA3.1/Tp0751重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.1 Identification of recombinant pcDNA3.1/Tp0751 digested with BamHⅠ and Xho ⅠNote: M.DNA marker;1.Negtive control;2.Empty pcDNA3.1;3.Recombinant pcDNA3.1/Tp075.

圖2 Tp0751真核重組蛋白的Western blot鑒定Fig.2 Identification of eukaryotic expression of recombi-nant Tp0751 by Western blotNote: 1.RAW264.7 cells untreated with pcD/Tp0751-BG;2,3.RAW264.7 cells treated with pcD/Tp0751-BG;4.RAW264.7 cells treated with empty pcDNA3.1.

圖3 不同時間點(diǎn)各免疫組小鼠特異性血清IgG(A)及生殖道SIgA(B)Fig.3 IgG and SIgA against Tp0751 in vaccinated mice at different time pointNote: Vs groups A,B,C,*.P<0.01;vs group D,#.P<0.01;vs group E,△.P<0.01.

表1小鼠脾淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)(SI)

Tab.1StimulationIndexofspleenlymphocytesofimmun-izedmice

GroupsSIA:PBS1.019±0.135B:EBG1.079±0.025C:pcDNA1.032±0.031D:pcD/Tp07511.447±0.1111)E:pcD/Tp0751-BG9.896±0.2591)2)F:pcD/Tp0751-BG+rTp075111.985±0.3191)2)3)G:ConA2.318±0.145

Note：Vs groups A,B,C,1)P<0.01;vs group D,2)P<0.01;vs group E,3)P<0.05.

圖4 小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ水平(pg/ml)Fig.4 Levels of IFN-γ produced by spleen lymphocytes in vaccinated mice(pg/ml)Note: Vs groups A,B,C,*.P<0.01;vs group D,#.P<0.01;vs group E,△.P<0.05

3 討論

重組蛋白疫苗是目前國外唯一應(yīng)用的梅毒疫苗類型，但存在一些不足[7]，如通過E.coli高水平表達(dá)時可能難以準(zhǔn)確保持天然蛋白的構(gòu)象；易降解，純化技術(shù)要求高；以常規(guī)佐劑免疫難以誘導(dǎo)局部黏膜的免疫應(yīng)答等，因此需發(fā)展其他類型的疫苗[7-9]。核酸疫苗是近20年來發(fā)展起來的第三代疫苗。與傳統(tǒng)疫苗相比，核酸疫苗具有明顯的優(yōu)勢[15,16]：能模擬病原體自然感染，在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)近乎天然構(gòu)象的目的蛋白，不僅能持久誘導(dǎo)體液免疫，而且能產(chǎn)生強(qiáng)有力的細(xì)胞免疫。此外，DNA疫苗還具有制備簡單、使用安全等諸多優(yōu)點(diǎn)成為近年研究的熱點(diǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。

核酸疫苗在真核細(xì)胞中的有效轉(zhuǎn)染和表達(dá)目的蛋白是誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的前提。本研究中 pcD/Tp0751真核質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞RAW264.7中能有效表達(dá)目的蛋白，為下一步研究提供了基礎(chǔ)。

目前普遍認(rèn)為，Th1型免疫應(yīng)答是早期清除Tp的主要機(jī)制[7-9]，通過CD4+Th1細(xì)胞等分泌IFN-γ為主[17]的Th1型細(xì)胞因子活化巨噬細(xì)胞，促進(jìn)其吞噬殺傷Tp[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，pcD/Tp0751-BG同源加免和異源加免均在末次加免后8周仍能誘導(dǎo)非常明顯的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖和IFN-γ分泌，表明Tp0751的核酸菌影能有效誘導(dǎo)小鼠系統(tǒng)性細(xì)胞免疫應(yīng)答。

體液免疫應(yīng)答也是必不可少的[7-9]，局部黏膜特異性抗黏附素的SIgA能早期阻止Tp從生殖道黏膜吸附上皮細(xì)胞而入侵[8]，而血清中特異性IgG等能防止Tp黏附血管內(nèi)皮細(xì)胞從而向遠(yuǎn)處組織播散，還能特異性介導(dǎo)巨噬細(xì)胞靶向吞噬殺傷Tp(調(diào)理吞噬)[19]，與細(xì)胞免疫應(yīng)答協(xié)同作用最終清除Tp[7-9]。本研究發(fā)現(xiàn)，pcD/Tp0751-BG同源加免和異源加免誘導(dǎo)IgG與SIgA水平均隨著免疫次數(shù)的增加而上升，于末次加免后8周到達(dá)峰值，水平最高的異源加免組效價能分別達(dá)到1∶102 400和1∶12 800，表明Tp0751的核酸菌影能有效誘導(dǎo)小鼠系統(tǒng)性與黏膜的體液免疫應(yīng)答。

質(zhì)粒DNA本身免疫原性低，選擇合適的DNA遞送系統(tǒng)和佐劑對有效誘導(dǎo)應(yīng)答十分關(guān)鍵。近年，菌影(BG)作為理想的天然抗原(DNA或蛋白)遞送系統(tǒng)和佐劑引起極大關(guān)注，目前已被廣泛地用于沙眼衣原體、幽門螺桿菌、HIV等許多病原體的疫苗[20,21]。BG是革蘭陰性細(xì)菌被溫控法或化學(xué)法裂解后失去胞漿成分而保留完整細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和天然形態(tài)的細(xì)菌空殼。除了裝載重組蛋白外，BG還具有強(qiáng)大的外源DNA裝載能力，每個BG可在裂解通道中裝載數(shù)千個DNA拷貝，而且裝載簡單高效[20]，在本研究中，BG裝載重組DNA質(zhì)粒的裝載率達(dá)到了76%，顯示出高效的裝載能力；同時，BG保留了顆粒狀活菌天然的表面抗原結(jié)構(gòu)(脂多糖、肽聚糖、菌毛等)，APC表面的模式識別受體很容易將其識別和靶向性攝入而被充分活化，繼而激活T細(xì)胞啟動適應(yīng)性免疫應(yīng)答[20]。因此，BG 也是良好的天然免疫佐劑。菌影這些特性使其能增強(qiáng)DNA/重組蛋白疫苗誘導(dǎo)系統(tǒng)和局部的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答水平，且能維持持久免疫記憶[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，pcD/Tp0751-BG同源加免和異源加免誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫的水平均明顯高于不加佐劑的裸pcD/Tp0751，而且在末次免疫后8周能達(dá)到最高水平，表明能維持較好的免疫記憶。

為進(jìn)一步提供DNA疫苗誘導(dǎo)免疫應(yīng)答水平，本研究設(shè)立了DNA初免兩次、繼以重組Tp0751蛋白加免一次的異源加免(prime-boost)組。結(jié)果顯示，與三次DNA同源加免組相比，異源加免誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答均更高。當(dāng)前DNA初免-蛋白加免(異源加免)被認(rèn)為是理想的免疫策略，比同一蛋白或DNA的同源加免能誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫應(yīng)答，但機(jī)制不甚明確，可能是DNA疫苗與蛋白疫苗以不同的機(jī)制刺激特異性應(yīng)答。DNA疫苗能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，同時也高效誘導(dǎo)記憶性B細(xì)胞產(chǎn)生，當(dāng)以蛋白抗原加免時，直接活化記憶性B細(xì)胞[23]。

本實(shí)驗(yàn)首次構(gòu)建Tp0751的真核重組菌影，有效誘導(dǎo)了小鼠系統(tǒng)和黏膜體液免疫應(yīng)答及細(xì)胞免疫應(yīng)答，下一步擬對免疫鼠進(jìn)行抗Tp攻擊感染實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證其免疫保護(hù)性，為進(jìn)一步研發(fā)新型梅毒疫苗奠定基礎(chǔ)。

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