耕作方式與綠肥種植對土壤微生物組成和多樣性的影響

李麗娜，席運官，陳 鄂，和麗萍，王 磊，肖興基，田 偉①

(1.云南省環(huán)境科學研究院，云南 昆明 650034；2.環(huán)境保護部南京環(huán)境科學研究所，江蘇 南京 210042；3.甘肅省環(huán)境監(jiān)測中心站，甘肅 蘭州 730020)

過去十幾年,土壤質量退化和農業(yè)環(huán)境污染問題日益加劇[1]。有機農業(yè)作為一種提高土壤肥力、控制農業(yè)面源污染、增加食品安全性的有效方式,在世界范圍內得到了廣泛認可。然而,我國的有機生產過程仍存在有機肥過量施用的狀況。近年來,一些研究表明,連續(xù)施用有機肥,尤其是以畜禽糞便為主要來源的有機肥,可能引起土壤重金屬累積、磷素淋溶風險增加、土壤微生物多樣性下降等環(huán)境風險[2-4]。

免耕與綠肥種植被認為是改善土壤肥力的重要措施。多年的研究表明,長期免耕或綠肥翻壓可以改善土壤團粒結構,增加土壤有機碳和氮含量,促進土壤難溶物質轉化等[5-7];同時,土壤理化性質的改變能夠在一定程度上影響土壤微生物數量、活性和群落結構[8]。MDER等通過長達10 a的定位試驗發(fā)現(xiàn)免耕或者少耕能夠顯著增加表層(0～10 cm)土壤微生物數量和微生物活性[9],SUN等[10]認為免耕增加了土壤細菌含量,促進了真菌類微生物對土壤有機質的降解,而對土壤放線菌沒有任何影響。高嵩涓等[11]以種植31 a雙季稻-冬綠肥的紅壤性水稻土為研究對象,發(fā)現(xiàn)豆科綠肥紫云英對土壤微生物生物量碳、氮的提高作用最顯著。因此,在有機農業(yè)生產過程中免耕與綠肥技術可以與有機肥配合使用以培肥土壤,降低有機肥施用量,減少連續(xù)過量施用有機肥引起的環(huán)境風險。

然而,以往研究人員更多關注耕作方式的差異或者綠肥種類對土壤微生物生物量、土壤酶活性或土壤微生物呼吸作用的影響[5-11],關于同時采用免耕和綠肥種植技術對土壤微生物群落結構影響的研究則鮮有報道。筆者假設同時采用免耕和綠肥種植技術較使用單一技術更能夠有效增加微生物數量,改善微生物區(qū)系特征,并通過開展田間試驗的方式進行驗證,以期為有機農業(yè)生產過程中土壤質量的改善提供技術指導。

1 材料與方法

1.1 試驗地點

田間試驗在江蘇省儀征市江揚農業(yè)生態(tài)有限公司四莊基地展開。試驗樣地土壤基本理化性質如下:pH值為6.20,w(有機質)為9.02 g·kg-1,w(全氮)為0.36 g·kg-1,w(全磷)為0.17 g·kg-1,w(速效磷)為24.32 mg·kg-1,w(全鉀)為0.72 mg·kg-1,w(速效鉀)為73.27 mg·kg-1,土壤容重為1.30 g·cm-3。儀征市位于江蘇省中部,長江下游沿岸,地理位置為北緯32°14′～32°36′,東經119°02′～119°22′,屬于北亞熱帶沿江季風氣候區(qū),光能資源豐富,雨量較充沛,年均降水量為1 015 mm,年均日照時數為2 226.5 h,年均氣溫為15 ℃。

1.2 試驗處理設置

以有機農業(yè)習慣施肥和耕作方式常規(guī)耕作+施用有機肥(CC)為參照,設計免耕+不種綠肥(ZT)、免耕+種植綠肥(ZG)、常規(guī)耕作+不種綠肥(CT)和常規(guī)耕作+種植綠肥(CG)4個處理,每個處理設置3個重復,共15個小區(qū),小區(qū)規(guī)格為4 m×5 m,采用豆科綠肥/玉米的輪作方式。2013—2014年度種植綠肥作物為綠豆,2014—2015和2015—2016年度種植綠肥作物為箭舌豌豆。綠豆種植時間為2014年4月中旬,采收時間為2014年5月中旬,兩季豌豆種植時間為每年的10月中旬,采收時間為第2年4月中旬。玉米種植時間為每年的5月上旬,收獲時間為每年的9月下旬,品種為蘇玉19,行株距為50 cm×40 cm,每個小區(qū)種植玉米100株。

對于ZG處理采用鐮刀將綠肥齊地刈割,稱重,點種玉米后覆于作物表面;對于CG處理同樣用鐮刀將綠肥齊地刈割,稱重,然后人工翻壓至土壤約20 cm深處,翻壓2周后點種玉米;對于CC處理按照15.0 t·hm-2施用量撒施牛糞有機肥于土壤表面,采用與CG處理相同的方式翻壓,翻壓2周后點種玉米,玉米長至3～5葉期進行人工定苗。在玉米生長過程中,完全按有機農業(yè)方式進行管理,實施人工除草,施用噴灑生物源、植物源和礦物源農藥進行病蟲害防治。除CC處理外,其余4個處理均未施用外源有機肥或化學肥料。

1.3 樣品采集與分析

1.3.1 樣品采集

第3季玉米收獲后進行土壤樣品采集。在小區(qū)內隨機選擇3個樣點,用采樣器采集0～20 cm的土體土壤樣品,均勻混合后保存于-80 ℃冰箱。

1.3.2 土壤DNA提取

土壤DNA提取采用PowerSoil DNA提取試劑盒(Mo Bio Laboratories Inc.,Carlsbad,CA,USA),提取詳細步驟見試劑盒說明書(http:∥www.anbiosci.com/protocols/12888.pdf)。每個樣品提取3個重復,每個重復由3份DNA混合而成。DNA質量由NanoDrop ND-1000分光光度計(NanoDrop,ND2000,ThermoScientific,111 Wilmington,DE)測定260/280和260/230 nm處比值確定。

1.3.3 土壤微生物拷貝數分析

采用熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)方法對各處理土壤中細菌、真菌和放線菌的拷貝數進行定量。引物341F(5′-TACGGGAGGCAGCAG-3′)和534R用于細菌16S rRNA基因V3區(qū)擴增,引物517F(5′-CCAGCAGCCGCGGTAAT-3′)和Act704R(5′-TCTGCGCATTTCACCGCTAC-3′)用于放線菌16S rRNA基因V3區(qū)擴增[12],具體反應體系和反應條件參照TIAN等[13]的描述。真菌定量擴增采用引物5.8s(5′-CGCTGCGTTCTTCATCG-3′)和ITS1f(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′),具體反應體系和反應條件參照沈宗專等[14]的描述。

1.3.4 土壤細菌多樣性測定

采用引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′)和907R(5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′),針對樣品細菌16S rDNA的V4～V5區(qū)進行PCR擴增。委托上海美吉諾生物科技有限公司采用Illumina Miseq測序平臺上機測序。擴增體系、反應條件和數據處理方法參見SUN等[15]的描述。

1.4 統(tǒng)計與分析

采用Excel 2007進行統(tǒng)計并用SPSS 21.0(IBM SPSS Statistical 21,SPSS Inc. Chicago,Illinois)進行方差分析和顯著性水平檢驗(P<0.05)。高通量數據的生物信息學分析采用Qiime(Quantitative Insights into Microbial Ecology)軟件(Version 1.8.0)進行。根據序列的相似度,將序列歸為多個操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU),統(tǒng)計各個樣品含有OTU情況及每個OTU含有序列的數量,通過尋找最近親緣物種的方法,得到每個OTU的分類學信息[16]。采用Mothur軟件(Version 1.27.1)計算豐富度指數Chao1、ACE,覆蓋度(Coverage)及多樣性指數(Simpson指數和Shannon指數)。用于土壤微生物與土壤理化性質相關性分析的土壤理化指標數據來源于文獻[17]。

2 結果與分析

2.1 耕作方式與綠肥種植對土壤微生物基因拷貝數的影響

采用熒光定量PCR方法對不同處理土壤中細菌、真菌和放線菌的拷貝數進行分析的結果(表1)顯示,ZG處理細菌、真菌和放線菌的拷貝數分別為6.03×108、2.40×105和1.21×107,顯著高于ZT和CT處理,但顯著低于CC處理;ZG處理細菌拷貝數/真菌拷貝數比值為2.51×103,盡管與CG和CC處理差異不顯著,但顯著高于ZT和CT處理。

2.2 耕作方式與綠肥種植對土壤細菌多樣性的影響

5個處理15個土壤樣品共獲得203 090條優(yōu)質序列,以優(yōu)質序列條數最少的樣品為基準,每個樣品隨機選擇12 206條優(yōu)質序列進行分析(表2)。不同處理的覆蓋度(Coverage)在0.967～0.987之間,差異并不顯著;不同處理OTU數在1 899～1 987之間,也沒有顯著差異;另外,耕作方式的差異與是否種植綠肥也未對土壤細菌的豐富度(ACE指數和Chao 1指數)和多樣性(Shannon指數和Simpson指數)產生顯著影響。

表1 不同處理土壤微生物基因拷貝數差異 Table 1 Number of gene copies of soil microbes relative to treatment

表2 不同處理土壤樣品覆蓋度、豐富度指數和多樣性指數差異 Table 2 Comparison between treatments in estimated richness and diversity indices of the 16S rRNA gene libraries for clustering at 97% identity

2.3 耕作方式與綠肥種植對土壤門水平細菌相對含量的影響

不同處理土壤微生物在門水平的組成見圖1。圖1顯示,82.88%～86.22%的序列可歸入變形菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和浮霉菌門(Planctomycetes),而8.58%～10.70%的序列可歸入裝甲菌門(Armatimonadetes)、藍細菌門(Cyanobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)和疣微菌門(Verrucomicrobia),另外,2.55%～6.67%的序列為相對含量較少和不能歸入已知門類的微生物。不同處理之間微生物門水平的組成沒有明顯差異,但耕作方式和綠肥種植可影響不同門類微生物的相對含量。

總體來看,耕作方式的差異對土壤微生物的組成影響并不顯著。例如,ZT處理優(yōu)勢微生物變形菌門、綠彎菌門和酸桿菌門的相對含量分別為29.01%、19.54%和11.53%,而CT處理則分別為29.37%、18.08%和11.39%,統(tǒng)計分析顯示并無顯著差異(P<0.05)。ZT和CT處理綠彎菌門的相對含量分別為19.54%和18.08%,放線菌門的相對含量分別為9.18%和10.49%,均顯著高于其他3個處理,而各處理之間酸桿菌門并無顯著差異。

ZT—免耕+不種綠肥;CT—常規(guī)耕作+不種綠肥;ZG—免耕+綠肥;CG—常規(guī)耕作+綠肥;CC—常規(guī)耕作+有機肥。

ZG處理微生物的組成與CG處理之間明顯不同。例如,ZG處理變形菌門的相對含量為34.98%,顯著高于CG處理(29.13%),而CG處理疣微菌門的相對含量為3.19%,顯著高于ZG處理(2.08%)。另外,CG、ZG和CC處理擬桿菌門微生物的相對含量均在一定程度上有所增加,而種植綠肥有利于藍細菌門和硝化螺旋菌門的生長。

2.4 不同處理基于加權的UniFrac分析

各處理基于加權的UniFrac分析結果(圖2)顯示,5個處理形成了5個不同的聚類簇,表明5個處理均在一定程度上影響土壤微生物的組成,而同一個處理的3個不同重復聚集在同一個聚類簇,驗證了該試驗操作的可重復性和試驗結果的可靠性。

ZT—免耕+不種綠肥;CT—常規(guī)耕作+不種綠肥;ZG—免耕+綠肥;CG—常規(guī)耕作+綠肥;CC—常規(guī)耕作+有機肥。

2.5 土壤微生物與土壤理化性質的相關性分析

如表3所示,總體上看,大部分微生物類群與土壤容重、土壤pH值、有機質含量和全氮含量等理化指標均呈現(xiàn)或正或負的相關性,說明土壤理化性質的差異是影響土壤微生物組成的重要因素。只有放線菌門與任一理化指標間均無顯著相關性。

表3 土壤理化性質與主要微生物類群的相關系數 Table 3 Correlation analysis between abundances of main microbial groups and soil properties

變形菌門與土壤有機質含量、全氮含量和全磷含量均呈顯著正相關,擬桿菌門與土壤有機質含量、全氮含量和全磷含量均呈顯著正相關,同時與土壤容重呈顯著負相關。而綠彎菌門和厚壁菌門與土壤有機質含量呈顯著或極顯著負相關。與氮素循環(huán)相關的微生物藍細菌門和硝化螺旋菌門分別與土壤全氮含量和pH值呈顯著負相關。另外,pH值僅與酸桿菌門、硝化螺旋菌門和疣微菌門呈顯著或極顯著相關性。

3 討論

3.1 耕作方式和綠肥種植與土壤微生物多樣性

土壤細菌豐富度和多樣性是土壤生態(tài)功能的重要指標[18]。群落多樣性和豐富度變化會影響土壤功能。WEI等[19]報道土壤微生物多樣性越豐富,農作物抵御病蟲害的能力就越強,反之則越弱。筆者試驗發(fā)現(xiàn),3 a的耕作方式和綠肥種植及有機肥施用對各處理的細菌豐富度和多樣性均沒有顯著影響,這可能與該試驗的周期較短有關。研究表明土壤微生物對環(huán)境的改變有一定的抵抗和恢復能力,尤其是土壤群落豐富度和多樣性水平的變化,需要經過一定的周期[20]。INNEREBNER等[21]發(fā)現(xiàn),有機肥并不能改變土壤微生物多樣性,而POULSEN等[22]甚至認為是土壤的類型和顆粒組成而不是施用何種類型肥料決定了土壤微生物的多樣性和豐富度。

KUNTZ等[23]通過磷脂脂肪酸分析(PLFA)技術分析了耕作方式對有機農場細菌、真菌和原生動物的影響,結果表明耕作方式只是在種的水平上改變了上述3種土壤生物的絕對數量,而對多樣性沒有顯著影響;ELFSTRAND等[24]同樣采用PLFA技術研究了綠肥種植對土壤微生物結構的影響,發(fā)現(xiàn)土壤細菌和真菌的數量較未添加有機物處理顯著增加,且PLFA圖譜表明,土壤微生物組成較其他有機物處理有明顯不同,但是并未對不同處理微生物多樣性的差異是否顯著進行評估。近年來采用高通量技術研究耕作方式和綠肥種植對土壤微生物組成和多樣性影響的報道相對較少。

3.2 耕作方式和綠肥種植與土壤微生物組成

近年來,隨著測序技術的不斷發(fā)展,由耕作方式或綠肥種植引起的土壤微生物群落結構的演變逐漸引起重視。TODA等[25]通過9 a的定位試驗發(fā)現(xiàn)豆科綠肥毛苕子能夠顯著增加土壤中酸桿菌門、芽單胞菌門和變形菌門的相對含量;YIN等[26]比較了小麥生產系統(tǒng)耕作方式對土體與根際土壤微生物組成的影響,發(fā)現(xiàn)免耕增加了根際土壤中變形菌門的相對含量,也增加了土體土壤中酸桿菌門和芽單胞菌門的相對含量。

筆者3 a的定位試驗表明,對于不種植綠肥的處理(ZT和CT),其綠彎菌門和放線菌門的相對含量明顯高于其他3個處理。盡管綠彎菌門是土壤中的優(yōu)勢種群,但是由于大部分不可培養(yǎng),因此,對此類微生物功能的了解非常有限[27]。但一些前期研究表明,綠彎菌門的微生物,例如Gp6、Gp16和Gp4等與土壤中有機碳含量呈顯著負相關[28],這可能是該試驗中不種植綠肥處理綠彎菌門相對含量較高的原因。同樣,放線菌門在營養(yǎng)物質更豐富的土壤中較其他微生物類群更缺乏競爭力[29]。

ZG處理變形菌門相對含量明顯高于CG處理,可能是由于綠肥的覆蓋能夠為此類微生物提供更好的生存環(huán)境。更深入的研究發(fā)現(xiàn),α-變形菌、β-變形菌、γ-變形菌和δ-變形菌4個亞門的微生物在2個處理中均有發(fā)現(xiàn),但ZG處理除對δ-變形菌沒有影響外,其他3個亞門均有一定增加,這與以前的研究結果有一定的相似性。ROUSK等[30]發(fā)現(xiàn)α-變形菌和γ-變形菌亞門與土壤pH值呈正相關,筆者經過3 a的定位試驗發(fā)現(xiàn)ZG處理土壤pH值與CG處理有明顯差異[17]。而對于β-變形菌亞門,豐富的營養(yǎng)物質更有利于此類微生物的生長。綠肥的翻壓、覆蓋或有機肥的添加均有利于擬桿菌門的生長,此與ZHAO等[29]的研究結果一致,此類微生物與有機物質的降解密切相關?？赡苁怯捎谕寥赖氐娜狈途G肥分泌物的激發(fā),綠肥種植處理促進了藍細菌門和硝化螺旋菌門等與氮素循環(huán)相關微生物類群的生長。

3.3 土壤微生物組成與土壤理化性質的相關性

研究表明,相同的土壤經過長期不同施肥管理后會形成不同的土壤理化性質,不同的土壤理化性質能夠引起細菌群落結構的變化[31]。GRIFFITHS等[32]通過將砂壤和黏土滅菌后交換接種2種土壤菌懸液的試驗,證明在細菌群落演變過程中是土壤類型而不是接種物決定最終的群落結構,筆者試驗的研究結論與其有一定的一致性。筆者通過試驗發(fā)現(xiàn)大部分微生物類群與土壤理化指標均呈或正或負的相關性。前期研究認為,土壤pH值是決定土壤中細菌組成的重要因素,但是,筆者試驗中并未發(fā)現(xiàn)其在決定土壤微生物組成上與土壤有機質含量、全氮含量和全磷含量等指標有明顯差異,因為pH值也僅與酸桿菌門、硝化螺旋菌門和疣微菌門具有顯著或極顯著相關性。ROUSK等[30]同樣認為土壤pH值與其他理化指標共同作用決定土壤微生物的組成。

變形菌門相對含量與土壤有機質含量、全氮含量和全磷含量均呈顯著正相關,這也在一定程度上解釋了ZG和CC處理此類微生物明顯高于其他處理的原因。FIERER等[33]同樣發(fā)現(xiàn)變形菌門微生物與土壤有機質含量呈顯著正相關。許多研究表明,綠彎菌門相對含量隨著土壤pH值的降低而增加,筆者同樣發(fā)現(xiàn)此類微生物與土壤pH值之間呈負相關。綠彎菌門和厚壁菌門與土壤有機質含量呈顯著或極顯著負相關,說明此類微生物在營養(yǎng)物質相對豐富的土壤環(huán)境中缺乏競爭力。ZHAO等[29]同樣發(fā)現(xiàn)放線菌門相對含量與土壤任一理化指標間均無顯著相關性,筆者試驗研究的結論與其一致?？傮w來說,土壤結構、土壤營養(yǎng)物質含量和土壤pH值均在一定程度上決定了土壤微生物的組成。因此,采取合理的土壤培肥措施維持土壤肥力和改善土壤結構是促進農業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關鍵因素。

4 結論

3 a的定位試驗表明,不同處理細菌相對含量及組成產生了一定變化,但土壤細菌群落多樣性和豐富度差異不顯著。相關性分析表明土壤結構、土壤營養(yǎng)物質含量與土壤pH值均在一定程度上決定了土壤微生物的組成。

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