微/納多級(jí)結(jié)構(gòu)TiO2涂層的制備及生物學(xué)性能

顧靜萍, 謝有桃, 黃利平, 賀延昌, 趙 君,鄭學(xué)斌,李 紅,孫晉良

(1.上海大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院,上海200444;

2.中國科學(xué)院上海硅酸鹽研究所特種無機(jī)涂層重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海200050)

鈦及鈦合金具有與人體骨骼相接近的彈性模量、較低的密度、優(yōu)良的抗腐蝕性能和生物相容性,常用于骨科植入器械的制造.鈦基植入體由于本身具有生物惰性,會(huì)延長其與宿主骨之間的骨整合時(shí)間,易產(chǎn)生松動(dòng),甚至導(dǎo)致種植失敗.因此,如何使植入材料與宿主骨之間快速形成穩(wěn)定持久的連接是骨植入體研究的重要方向之一[1].

植入體材料表面的宏觀、介觀及微觀結(jié)構(gòu)構(gòu)成了不同的局部微環(huán)境,這些微環(huán)境決定了細(xì)胞的生物學(xué)行為[2-3].植入材料表面微環(huán)境的構(gòu)建及其對(duì)成骨相關(guān)細(xì)胞行為影響的研究備受關(guān)注.從仿生角度考慮,理想的骨植入體材料表面應(yīng)包含微/納多級(jí)結(jié)構(gòu).相對(duì)于單一包含微米結(jié)構(gòu)或納米結(jié)構(gòu)的植入體材料,表面具有微/納多級(jí)結(jié)構(gòu)的涂層會(huì)表現(xiàn)出兩種結(jié)構(gòu)的協(xié)同效應(yīng),能有效改善植入體早期骨整合效果和長期穩(wěn)定性[4-7].

探索在植入體表面構(gòu)建具微/納多級(jí)結(jié)構(gòu)的有效方法是目前相關(guān)研究的熱點(diǎn)[8-10].等離子噴涂技術(shù)是制備醫(yī)用生物涂層的常用方法[11],能在植入體表面沉積大孔微米結(jié)構(gòu)涂層,但難以直接獲得納米結(jié)構(gòu).液相感應(yīng)等離子噴涂(induction suspension plasma spraying,ISPS)技術(shù)是一種制備涂層的新方法.該方法采用液相進(jìn)料,解決了直接輸送納米粉體的難題,能快速制備具有微/納多級(jí)結(jié)構(gòu)的涂層[12-16].

本工作采用ISPS方法,通過調(diào)整噴涂參數(shù),在鈦基體表面制備微/納多級(jí)結(jié)構(gòu)的生物醫(yī)用TiO2涂層;通過X射線衍射(X-ray diあraction,XRD)、掃描透射電子顯微鏡(scanning transmission electron microscopy,SEM)等對(duì)涂層的相組成及顯微結(jié)構(gòu)等進(jìn)行分析,并對(duì)不同形貌的涂層進(jìn)行了體外細(xì)胞相容性檢測(cè).

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 材料及設(shè)備

噴涂試驗(yàn)采用額定功率為40 kW的液相感應(yīng)等離子噴涂設(shè)備(Tekna Plasma Systems,Canada).以工業(yè)純鈦(TA2)作基體,尺寸為?10 mm×2 mm.試驗(yàn)選用粒徑為10～30 nm的純銳鈦礦型TiO2粉體(P25,Degussa,Germany).圖1和2分別為粉體的SEM形貌和XRD圖譜.

1.2 涂層制備工藝

懸浮液配制:將納米粉體分散于去離子水中,在室溫下進(jìn)行磁力攪拌,后進(jìn)行超聲分散,使得溶劑中無團(tuán)聚的TiO2粉末,配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%的懸浮液.

預(yù)處理:對(duì)鈦基體表面進(jìn)行噴砂處理.

ISPS制備涂層的示意圖如圖3所示.納米TiO2懸浮液經(jīng)霧化后,均勻送入等離子體射流中心部位,在鈦基體表面形成涂層.本試驗(yàn)中,液料輸送方向與等離子體噴涂方向一致,并采用槍內(nèi)進(jìn)料的方式,減少了重力對(duì)霧化液滴的擾動(dòng),提高了等離子體的穩(wěn)定性,使得液料霧化后橫向散開的絕大多數(shù)液滴盡可能地進(jìn)入等離子體焰流中心,從而提高涂層質(zhì)量和沉積效率[13].

圖1 原料粉體的SEM形貌Fig.1 SEM morphology of the powder

圖2 原料粉體的XRD圖譜Fig.2 XRD pattern of the powder

圖3 液相感應(yīng)等離子噴涂制備涂層示意圖Fig.3 Schematic diagram of induction suspension plasma spraying

主要噴涂工藝參數(shù)如表1所示,分別以4,8,12 mL/min的進(jìn)料速率進(jìn)行噴涂試驗(yàn),試樣編號(hào)依次為FR-4,FR-8和FR-12.對(duì)照組分別為光滑鈦片(smooth pretreated Ti,PT)和大氣等離子噴涂(atmosphere plasma spraying,APS)制備的涂層.前者由鈦基體經(jīng)1#～7#砂紙拋光處理得到;后者由Sulzer Metro AG公司(瑞士)的A-2000自動(dòng)大氣等離子體噴涂系統(tǒng)制備,噴涂粉體為上述納米粉體經(jīng)燒結(jié)破碎制得,粉體中位粒徑為31.98μm.

表1 液相感應(yīng)等離子噴涂工藝參數(shù)Table 1 ISPS parameters

1.3 涂層結(jié)構(gòu)表征

采用X射線衍射儀(RAX-10,Rigaku,Japan)分析涂層的相組成;采用SEM(S4800,Hitachi,Japan)觀察涂層的表面和截面形貌;采用圖像分析法測(cè)定涂層的孔隙率.所用圖片為掃描電鏡拍攝的涂層截面照片,所用分析軟件為Q Win(Leica Q Win,Germany).銳鈦礦相的體積分?jǐn)?shù)可以通過Berger-Keller公式[17]進(jìn)行簡單計(jì)算得出:

式中,CA為銳鈦礦相的體積分?jǐn)?shù),IA和IR分別是銳鈦礦(101)在2θ=25.4?和金紅石相(110)在2θ=27.4?的峰強(qiáng).

1.4 涂層生物性能檢測(cè)

1.4.1 總蛋白吸附試驗(yàn)

采用二辛可寧酸(bicinchoninic acid,BCA)法檢測(cè)材料表面吸附的總蛋白.將裝有待測(cè)樣品和生長培養(yǎng)液的24孔板放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h,棄培養(yǎng)液,用磷酸緩沖液(phosphate buあer solution,PBS)沖洗3遍,并將樣品轉(zhuǎn)移至新的24孔板中;每孔加入500μL 1%的十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)溶液,在室溫下?lián)u床1 h,利用BCA法檢測(cè)SDS溶液中的蛋白含量.

1.4.2 細(xì)胞黏附形態(tài)觀察

選用MC3T3-E1細(xì)胞進(jìn)行體外細(xì)胞試驗(yàn).將細(xì)胞以3×104個(gè)/孔的密度接種于試樣表面,并培養(yǎng)24 h.取出后,用PBS沖洗2遍,2.5%戊二醛固定,經(jīng)梯度脫水,干燥,真空表面噴鉑.通過SEM觀察細(xì)胞在涂層表面的貼壁形貌.

1.4.3 堿性磷酸酶活性定量測(cè)定

將MC3T3-E1細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種于試樣表面,在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d.采用堿性磷酸酶(alkaline phosphates,ALP)測(cè)試盒(建成,南京)對(duì)ALP活性進(jìn)行定量測(cè)定:PBS沖洗2遍,在0.2%Triton-X-100溶液中裂解細(xì)胞;在4?C,10 000 r/min離心5 min后取上清液;取30μL細(xì)胞裂解上清液,按試劑盒說明書加液體,37?C水浴孵育15 min;加入150μL顯色劑,搖勻后在520 nm處測(cè)定吸光度值.

樣品總蛋白含量的測(cè)定采用BCA法:A液200μL與B液4μL充分混勻加入96孔酶標(biāo)板,細(xì)胞裂解液20μL/孔,37?C孵育30 min,于562 nm處測(cè)定吸光度值,并根據(jù)牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品蛋白含量;試樣ALP活性以各自的蛋白含量作標(biāo)準(zhǔn)化處理.

1.4.4 細(xì)胞外基質(zhì)礦化

將MC3T3-E1細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種于試樣表面,在培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)14,21 d.采用茜素紅染色對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)礦化進(jìn)行定量檢測(cè):經(jīng)PBS沖洗后,采用多聚甲醛室溫固定15 min,去離子水沖洗2遍,每孔加入1 mL茜素紅染色液染色,10 min后吸掉染色液,再用去離子水漂洗4次,每次振蕩5 min;每孔加入500μL 10%的氯化十六烷基砒啶,室溫?fù)u床振蕩15 min,使茜素紅染色劑釋放,在590 nm處測(cè)定吸光度值.

2 試驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 涂層物相分析

圖4為不同進(jìn)料速率條件下制備的TiO2涂層的XRD圖譜.從圖中可見,涂層晶型結(jié)構(gòu)以金紅石相為主,亦存在粉體中原有的銳鈦礦相(見圖2),表明在噴涂過程中TiO2發(fā)生相變.表2為3種涂層的銳鈦礦相體積分?jǐn)?shù),由結(jié)果可知,銳鈦礦相含量隨懸浮液進(jìn)料速率的增大而升高.TiO2熔點(diǎn)為1 850?C左右,噴涂過程中的等離子體火焰焰心溫度達(dá)10 000?C,因此溶劑蒸發(fā)后雖然粉體在火焰中停留時(shí)間較短,但亦能瞬間熔化.由于金紅石相是TiO2的高溫相,粉體在高溫熔化后,首先形成大量的金紅石相;另外,銳鈦礦相作為低溫相,在溫度為500～600?C時(shí)可轉(zhuǎn)化為金紅石相[18].隨進(jìn)料速率的增大,溶劑蒸發(fā)消耗能量增加,等離子體火焰溫度降低,熔融粒子比例下降,銳鈦礦相向金紅石相的轉(zhuǎn)變減少,最終涂層中銳鈦礦相體積分?jǐn)?shù)增加.

圖4 不同進(jìn)料速率下涂層的XRD圖譜Fig.4 XRD patterns of the coatings sprayed under diあerent feed rate

表2 銳鈦礦相體積分?jǐn)?shù)Table 2 Volume fraction of anatase phase

2.2 涂層表面和截面形貌分析

圖5為進(jìn)料速率依次增大時(shí)TiO2涂層表面的SEM圖.結(jié)果表明,3種涂層均為微米級(jí)粗糙多孔的結(jié)構(gòu).高倍照片顯示,涂層具有不同的微觀結(jié)構(gòu).當(dāng)進(jìn)料速率為4 mL/min時(shí),顯微結(jié)構(gòu)為排列緊密的納米及亞微米柱狀結(jié)構(gòu)(見圖5(b));當(dāng)進(jìn)料速率為8 mL/min時(shí),為均勻分布的熔融納米球狀顆粒,顆粒尺寸為50～200 nm(見圖5(d));當(dāng)進(jìn)料速率為12 mL/min時(shí),為高密度的未熔融或半熔融納米球狀顆粒,顆粒尺寸為10～30 nm(見圖5(f)).

圖5 ISPS涂層表面形貌的低、高倍SEM圖Fig.5 SEM images of the ISPS surface topography at low and high magnif i cation

當(dāng)進(jìn)料速率較小時(shí),由于溶劑蒸發(fā)消耗熱量少,感應(yīng)等離子體與固體顆粒間的熱傳導(dǎo)效率較高,在持續(xù)熱流作用下,TiO2晶體沿?zé)崃鞣较蜷L大成柱狀晶體[19];同時(shí)樣品臺(tái)在噴涂過程中不斷轉(zhuǎn)動(dòng)和移動(dòng),形成了如圖5(b)所示沿各個(gè)方向生長的納米及亞微米柱狀晶體.而隨著進(jìn)料速率的增大,削弱了等離子體火焰與固體顆粒間的能量傳遞[20],抑制了晶粒的長大,甚至出現(xiàn)未熔融的納米顆粒.

涂層截面形貌如圖6所示,3種涂層均未觀察到層狀組織,涂層與基體結(jié)合良好,界面處及涂層中均未觀察到明顯裂紋.進(jìn)料速率為4 mL/min的涂層均勻致密,隨進(jìn)料速率的增大,涂層中孔隙明顯增多.截面氣孔率測(cè)定結(jié)果如圖7所示,氣孔率隨進(jìn)料速率的增大而增大.當(dāng)進(jìn)料速率較大時(shí),等離子體火焰溫度較低,且較大的噴槍口徑(35 mm)使ISPS等離子體速率降低,粒子與基體撞擊時(shí)快速冷卻凝固;因粒子形變小,在基體表面呈球狀堆積,形成較多孔隙,導(dǎo)致涂層氣孔率增大.當(dāng)進(jìn)料速率較小時(shí),等離子體火焰溫度較高,涂層表面受熱熔化,孔隙得以填充,因而獲得了與基體結(jié)合良好且致密的涂層.涂層厚度和噴涂后增重(見表3)均隨進(jìn)料速率的增大而增加,這可能與單位時(shí)間進(jìn)入火焰的TiO2質(zhì)量增加有關(guān).

圖6 涂層截面的SEM圖Fig.6 Cross-sectional SEM images of the coatings

圖7 進(jìn)料速率對(duì)涂層氣孔率的影響Fig.7 Inf l uence of feed rate on the prosity of coatings

2.3 體外細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果分析

生物試驗(yàn)選取光滑鈦片(PT)以及大氣等離子噴涂(APS)制備的TiO2涂層作為對(duì)照組.圖8為PT,APS對(duì)照組的表面SEM圖.

表3 噴涂前后的質(zhì)量增加量Table 3 Increase in quality before and after spraying

圖8 對(duì)照組低、高倍表面形貌的SEM圖Fig.8 SEM images of the control surface topography at low and high magnif i cation

蛋白吸附4 h試驗(yàn)結(jié)果如圖9所示.3種微/納多級(jí)結(jié)構(gòu)涂層表面蛋白吸附水平最高,其次是APS表面,PT表面最低.這是由于TiO2納米結(jié)構(gòu)具有高比表面積和表面能等固有特征,能提高其表面蛋白質(zhì)吸附能力.蛋白質(zhì)在植入體表面的吸附狀態(tài)直接影響成骨細(xì)胞在材料表面的反應(yīng),如后期的細(xì)胞黏附、聚集和分化,且對(duì)基質(zhì)成熟和礦化產(chǎn)生較大影響[21].

圖10為成骨細(xì)胞在光滑鈦片(PT),APS,FR-4,FR-8,FR-12表面貼壁24 h后的SEM圖.結(jié)果表明:PT表面細(xì)胞鋪展?fàn)顟B(tài)較差,大多呈紡錘狀,細(xì)胞邊緣光滑無觸角;APS表面細(xì)胞骨架鋪展良好,有少量偽足;3種微/納多級(jí)結(jié)構(gòu)涂層表面細(xì)胞均鋪展良好,呈多邊形并向四周伸展,有較多偽足.圖10(f)為FR-12高倍電鏡照片,可以觀察到細(xì)胞邊緣與材料接觸的位置有較多的絲狀和板狀偽足形成.因微/納多級(jí)結(jié)構(gòu)涂層表面具有較高的蛋白吸附,能加快黏著斑的形成、分解和重建,使得細(xì)胞更好地鋪展[22],有利于進(jìn)一步分泌細(xì)胞外基質(zhì),合成相關(guān)蛋白.

圖9 不同試樣表面總蛋白吸附定量結(jié)果Fig.9 Quantitative results of the total protein adsorption on diあerent samples

圖10 MC3T3-E1細(xì)胞在不同表面的細(xì)胞SEM形貌Fig.10 SEM morphologies of MC3T3-E1 cells cultured on diあerent samples

堿性磷酸酶(ALP)活性水平代表了成骨細(xì)胞的分化程度,是成骨細(xì)胞分化和功能成熟的早期標(biāo)志.因此,細(xì)胞層內(nèi)高水平的ALP活性能夠促進(jìn)礦化組織的形成,加快骨形成.對(duì)上述5種材料在成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)第7 d時(shí)進(jìn)行ALP活性定量檢測(cè),結(jié)果如圖11所示.由圖可見,ISPS制備的3種微/納多級(jí)結(jié)構(gòu)涂層表面細(xì)胞的ALP表達(dá)相比APS和PT表面均有顯著提高.試驗(yàn)結(jié)果與蛋白吸附結(jié)果趨勢(shì)一致,進(jìn)一步證明了表面微/納多級(jí)結(jié)構(gòu)能夠誘導(dǎo)成骨分化,并有效提高材料表面的生物活性.

圖11 MC3T3-E1細(xì)胞在不同試樣表面培養(yǎng)7 d后ALP活性定量測(cè)定Fig.11 Relative ALP activity of MC3T3-E1 cells on diあerent samples cultured for 7 d by quantitative analysis

細(xì)胞外基質(zhì)礦化的測(cè)定采用茜素紅染色定量檢測(cè),結(jié)果如圖12所示,其中OD代表光密度(optical density).礦化結(jié)果的整體趨勢(shì)與蛋白吸附以及ALP活性一致.3種微/納多級(jí)結(jié)構(gòu)涂層之間的礦化水平有微小差別,這與各自不同的表面微觀結(jié)構(gòu)有關(guān),需作進(jìn)一步研究[23].

圖12 MC3T3-E1細(xì)胞在不同試樣表面茜素紅染色定量測(cè)定Fig.12 Calcium deposition essay of MC3T3-E1 cells on diあerent samples by quantitative analysis of alizarin red staining

3 結(jié)論

(1)采用液相感應(yīng)等離子噴涂成功制備了表面具有微/納多級(jí)結(jié)構(gòu)的TiO2涂層.所制備的涂層表面均勻覆蓋致密的納米結(jié)構(gòu)(柱狀或球狀).

(2)懸浮液進(jìn)料速率的不同會(huì)形成不同形貌的微/納多級(jí)結(jié)構(gòu)表面,以及可控的相組成和氣孔率.涂層中晶粒保持在納米級(jí)尺度.

(3)體外細(xì)胞相容性檢測(cè)發(fā)現(xiàn),ISPS制備的微/納多級(jí)結(jié)構(gòu)TiO2涂層具有較高的蛋白吸附,成骨細(xì)胞在其表面均有較好鋪展,ALP活性、礦化等基因表達(dá)均有較高水平.

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