小鼠肝臟特絡(luò)細(xì)胞的分離與鑒定

王 菲,宋美怡,夏 璐,張照杰

(同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院消化內(nèi)科,上海200065)

特絡(luò)細(xì)胞(telocytes,TCs)是一種新型間質(zhì)細(xì)胞,其形態(tài)與胃腸道Cajal間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cells of Cajal,ICC)相似,但二者具有截然不同的生理特性.TCs最初于2005年首次進(jìn)入科學(xué)家視野時(shí)曾被命名為Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cells of Cajal-like,ICLC)[1-2].隨著細(xì)胞膜電位技術(shù)和電子顯微鏡技術(shù)的發(fā)展,研究者發(fā)現(xiàn)特絡(luò)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)、細(xì)胞間隙連接以及免疫表型具有極強(qiáng)的特異性[3].在電子顯微鏡下可以清楚地觀察到,特絡(luò)細(xì)胞微小的胞體可以同時(shí)發(fā)射出3～5條長(zhǎng)達(dá)數(shù)百微米、呈現(xiàn)特殊串珠樣結(jié)構(gòu)的遠(yuǎn)足(telopod,TP),而特絡(luò)細(xì)胞也因此而得名[4-5].

特絡(luò)細(xì)胞在哺乳動(dòng)物體內(nèi)分布十分廣泛,幾乎可在各種器官及組織中檢測(cè)到特絡(luò)細(xì)胞的存在.已有研究顯示,骨骼肌及心肌的干細(xì)胞巢穴中常存在特絡(luò)細(xì)胞與干細(xì)胞共生并伴有干細(xì)胞標(biāo)志物C-kit的特異性表達(dá),由此推測(cè)特絡(luò)細(xì)胞可能屬于干細(xì)胞支持細(xì)胞的一種,參與調(diào)節(jié)體內(nèi)多種器官的損傷后修復(fù)及再生[5-8].同時(shí),特絡(luò)細(xì)胞的其他膜標(biāo)志物還包括CD34,PDGFR-α/β,Vimentin等,正是這些標(biāo)志性特征使得特絡(luò)細(xì)胞與其他間質(zhì)細(xì)胞(如肌成纖維細(xì)胞、星狀細(xì)胞等)有所區(qū)分[9-11].有關(guān)特絡(luò)細(xì)胞相關(guān)功能,已有研究結(jié)果顯示,分布于大鼠腸系膜的特絡(luò)細(xì)胞可通過(guò)形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)來(lái)抵抗腸道蠕動(dòng)的異?？哼M(jìn)[12];心臟內(nèi)特絡(luò)細(xì)胞可以促進(jìn)心外膜下的間質(zhì)細(xì)胞向皮層轉(zhuǎn)移,這一功能可能對(duì)間皮修復(fù)和組織更新具有促進(jìn)作用;在人類心外膜中,特絡(luò)細(xì)胞能形成類似的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),并與心肌特絡(luò)細(xì)胞的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)相互交匯,可能對(duì)心臟組織的更新、修復(fù)和再生具有積極意義,并能通過(guò)自身數(shù)量的減少對(duì)病理性改變起抑制作用[13-14].

越來(lái)越多的證據(jù)提示,特絡(luò)細(xì)胞在心臟、肌肉和皮膚組織再生和修復(fù)中是通過(guò)與相鄰細(xì)胞形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)并釋放囊泡和外泌體來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)而發(fā)揮潛在作用的[15].同時(shí),特絡(luò)細(xì)胞已被證實(shí)存在于哺乳動(dòng)物的肝臟中,并和肝臟組織的再生、修復(fù)存在密切的聯(lián)系,但目前對(duì)特絡(luò)細(xì)胞在肝臟的病理及生理過(guò)程中所發(fā)揮的作用仍知之甚少,相關(guān)研究仍有待進(jìn)一步深入[16-17].通過(guò)分離提純獲得肝臟特絡(luò)細(xì)胞,對(duì)于研究肝臟特絡(luò)細(xì)胞的功能具有決定性的意義.本工作基于已有的人和小鼠肺組織分離特絡(luò)細(xì)胞的方法,采取酶液短期多次消化離心法,成功建立了小鼠肝臟特絡(luò)細(xì)胞的高效分離體系;采用觀察細(xì)胞形態(tài)和免疫熒光技術(shù),鑒定了分離所得的細(xì)胞確為肝臟特絡(luò)細(xì)胞.該體系的建立為進(jìn)一步探討特絡(luò)細(xì)胞這一新型的間質(zhì)細(xì)胞與肝臟的關(guān)系奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ).

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)選用無(wú)特定病原體(specif i c pathogen free,SPF)級(jí)C57BL/6雄性野生型小鼠,大小為8～12周齡,以標(biāo)準(zhǔn)小鼠顆粒飼料及無(wú)菌水喂養(yǎng).

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

Hank’s平衡鹽溶液(GIBCO公司),胰酶消化液(GIBCO公司),Ⅱ型膠原酶(GIBCO公司),磷酸鹽緩沖液(phosphate buあer saline,PBS)(ShFeng公司),兔單克隆抗Vimentin抗體(Abcam公司),大鼠單克隆抗CD34抗體(Abcam公司),羊抗兔/鼠抗體(Oddfoni公司).

1.1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

共聚焦顯微鏡(Carl Zeiss公司),高速低溫離心機(jī)(Sigma公司),超凈工作臺(tái)(Nuair公司),CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司),高壓消毒鍋(TOMY公司),倒置顯微鏡(Olympus公司),冰箱(海爾公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 肝臟特絡(luò)細(xì)胞的分離

首先,選取周齡為8～10周的C57BL/6雄性野生型小鼠,實(shí)驗(yàn)前禁食12 h.向Hank’s平衡鹽溶液(Hank’s balanced salt solution,HBSS)中加入0.125%胰酶和0.025%Ⅱ型膠原酶,制備酶消化液,經(jīng)過(guò)0.22μm濾器過(guò)濾除菌后于4?C冰箱保存.小鼠采用10%水合氯醛麻醉后,用75%乙醇沖洗術(shù)區(qū),在無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi),完整取出小鼠肝臟,用PBS洗凈后浸泡在裝有PBS的培養(yǎng)皿中,用剪刀切割成大小約1 mm3的組織塊,轉(zhuǎn)移至無(wú)菌操作臺(tái)靜置.待組織沉降后吸取上清液,加入上述配制好的消化液20 mL,恒溫?fù)u床110 r/min震蕩10 min.震蕩結(jié)束后取出靜置,待組織沉降完全后吸取上清液,加入預(yù)冷的DMEM(Dulbecco’s modif i ed Eagle medium)培養(yǎng)基終止消化.取40μm濾器過(guò)濾1次,過(guò)濾液以1 000 r/min離心10 min,吸去上清液,加入適量以10%胎牛血清+DMEM培養(yǎng)基配制的完全培養(yǎng)基,輕柔重懸沉淀.將上述靜置—棄上清—靜置—取上清的操作重復(fù)5次,合并收集到的沉淀,放入離心機(jī)再次以1 000 r/min離心10 min,移去上清液.加入10 mL以10%胎牛血清+DMEM/F12培養(yǎng)基配制的培養(yǎng)液,輕柔重懸沉淀,取適量細(xì)胞懸液接種于10 cm培養(yǎng)皿中,畫“8”字法輕輕搖勻后置于37?C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

1.2.2 免疫熒光雙標(biāo)法

對(duì)分離所得原代特絡(luò)細(xì)胞/低傳代數(shù)的肝星狀細(xì)胞系(HSC-T6)進(jìn)行免疫熒光染色.以10%胎牛血清+DMEM高糖培養(yǎng)基配制細(xì)胞培養(yǎng)液,消化離心后以2×105個(gè)/mL的數(shù)量均勻鋪于24孔培養(yǎng)板內(nèi),待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后,進(jìn)行CD34+Vimentin或CD34+C-kit免疫熒光雙標(biāo)染色.染色操作如下:①?gòu)呐囵B(yǎng)箱中取出細(xì)胞,移除培養(yǎng)液,PBS常規(guī)清洗;②以500μL/孔加入4%多聚甲醛(paraformal dehyde,PFA)進(jìn)行固定,室溫靜置0.5 h后吸去固定液,PBS常規(guī)清洗;③加入0.5%Triton X-100+PBS配制的滲透劑進(jìn)行破膜處理,500μL/孔,處理15 min后吸去滲透液,PBS常規(guī)清洗;④以5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)常溫封閉1 h后吸去BSA,滴加一抗(CD34/Vimentin/C-kit∶一抗=1∶100)以覆蓋細(xì)胞,于4?C過(guò)夜,次日早晨取出,洗去一抗液后PBS常規(guī)清洗;⑤滴加相應(yīng)二抗(羊抗兔-Rhodamine/羊抗大鼠-FITC∶二抗=1∶200)以覆蓋細(xì)胞,室溫孵育2 h,洗去二抗液后PBS常規(guī)清洗;⑥每孔加入適量Golden-DAPI(Life Science公司),以覆蓋整個(gè)孔即可,置于Leica熒光顯微鏡拍攝,放大倍數(shù)為200倍.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

目前公認(rèn)常用的特絡(luò)細(xì)胞鑒定方法——透射電鏡觀察法和免疫熒光法,已證實(shí)了小鼠肝臟中特絡(luò)細(xì)胞的存在,本工作改進(jìn)了現(xiàn)有方法,成功分離出優(yōu)質(zhì)的特絡(luò)細(xì)胞,并在200倍顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),最后通過(guò)免疫熒光雙標(biāo)法對(duì)特絡(luò)細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞進(jìn)行鑒定和比對(duì).

2.1 肝臟特絡(luò)細(xì)胞形態(tài)觀察

通過(guò)1.2節(jié)實(shí)驗(yàn)方法從小鼠肝臟中分離出具有典型特絡(luò)細(xì)胞特征的細(xì)胞,在200倍顯微鏡下觀察到的細(xì)胞形態(tài)如下:每個(gè)細(xì)胞有2～3個(gè)細(xì)長(zhǎng)的突起,突起長(zhǎng)度可達(dá)數(shù)百微米,并呈現(xiàn)膨大部分與細(xì)長(zhǎng)部分交替出現(xiàn)的特殊形態(tài),這些突起可形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖1).這些特殊的顯微結(jié)構(gòu)初步提示本實(shí)驗(yàn)成功分離了小鼠肝臟的特絡(luò)細(xì)胞.

2.2 肝臟特絡(luò)細(xì)胞免疫表型的鑒別

作為一種新型的間質(zhì)細(xì)胞,特絡(luò)細(xì)胞在骨骼肌、心肌、腸系膜等組織中的細(xì)胞特征已經(jīng)初步明確.相較于其他間質(zhì)細(xì)胞,特絡(luò)細(xì)胞具有以下特征:①基因表達(dá)譜不同;②蛋白質(zhì)組分析不同;③免疫表型不同;④離子通道構(gòu)成不同等.在接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中,利用免疫熒光技術(shù)對(duì)比了肝臟中最常見(jiàn)的間質(zhì)細(xì)胞——肝星狀細(xì)胞系和特絡(luò)細(xì)胞免疫表型的區(qū)別.

圖1 顯微鏡下(200倍)由小鼠肝臟分離的特絡(luò)細(xì)胞Fig.1 Telocytes isolated from mouse liver by light microscopy(×200)

圖2 免疫熒光雙標(biāo)法鑒定分離所得肝臟原代特絡(luò)細(xì)胞Fig.2 Identif i cation of isolated hepatic primary telocytes by double immunof l uorescent staining

對(duì)分離獲得的原代特絡(luò)細(xì)胞使用CD34和Vimentin免疫熒光共染法進(jìn)行鑒定,發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟特絡(luò)細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)呈CD34及Vimentin雙陽(yáng)性(見(jiàn)圖2),與其他組織中的特絡(luò)細(xì)胞有類似的免疫表型,證實(shí)本實(shí)驗(yàn)成功分離了小鼠肝臟特絡(luò)細(xì)胞,也間接證實(shí)了肝臟中特絡(luò)細(xì)胞的存在.接下來(lái)使用同樣的方法比較了肝臟特絡(luò)細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞系的免疫表型,發(fā)現(xiàn)肝星狀細(xì)胞系呈CD34陰性及Vimentin陽(yáng)性(見(jiàn)圖3),進(jìn)一步從免疫表型的角度證實(shí)了二者的區(qū)別.

圖3 免疫熒光雙標(biāo)法鑒定肝星狀細(xì)胞系CD34+Vimentin Fig.3 Identif i cation of hepatic stellate cells by double immunof l uorescent staining

3 討論

特絡(luò)細(xì)胞已被證實(shí)在心臟、心包、胸膜、肝臟、肺靜脈、膽囊、腸系膜等多種組織的細(xì)胞間隙中普遍存在,并具有獨(dú)特的超微結(jié)構(gòu)、細(xì)胞間隙連接和特異性表面抗原.特絡(luò)細(xì)胞在三維空間中有特殊構(gòu)象——由胞體發(fā)射出數(shù)倍甚至數(shù)十倍于自身胞體橫徑的遠(yuǎn)足.早期因特絡(luò)細(xì)胞在空間上的不規(guī)則延伸特性及受限于顯微技術(shù),使特絡(luò)細(xì)胞一直隱藏在研究者所能探究的范圍之外.而隨著電子顯微鏡技術(shù)的日益成熟,才使得研究者逐漸揭開(kāi)了這巨大冰山的一角.研究者們利用透射電子顯微鏡技術(shù)觀察發(fā)現(xiàn),特絡(luò)細(xì)胞存在于肝臟的竇周間隙中,并且具有典型的超微結(jié)構(gòu).不僅如此,在特絡(luò)細(xì)胞的附近,還發(fā)現(xiàn)了共生的肝臟干細(xì)胞,這一結(jié)果提示特絡(luò)細(xì)胞和肝臟干細(xì)胞很可能存在密切聯(lián)系.除了透射電子顯微鏡下所觀察到的特異構(gòu)象外,特絡(luò)細(xì)胞還具有獨(dú)特的細(xì)胞膜免疫表型、跨膜離子通道.基于這些特征,特絡(luò)細(xì)胞的鑒定已經(jīng)初步建立了一套完善的體系.

本工作基于已有的人及小鼠肺組織特絡(luò)細(xì)胞分離方法,構(gòu)建了分離肝臟特絡(luò)細(xì)胞的新體系,以低速多次離心和短期多次酶液消化的方式,既保護(hù)了細(xì)胞的活性,避免酶液的過(guò)度消化,也能得到更多的特絡(luò)細(xì)胞沉淀.采用分離方法可以獲得更多數(shù)量的特絡(luò)細(xì)胞,并且細(xì)胞狀態(tài)更佳.最后采用免疫熒光雙標(biāo)法對(duì)肝臟中存在的特絡(luò)細(xì)胞進(jìn)行鑒定,與肝臟中最常見(jiàn)的間質(zhì)細(xì)胞——肝星狀細(xì)胞的免疫表型進(jìn)行對(duì)比,側(cè)面證實(shí)了與肝星狀細(xì)胞相比,特絡(luò)細(xì)胞具有特異性免疫表型.至此,本工作成功建立了高效的小鼠肝臟特絡(luò)細(xì)胞體外分離方法和培養(yǎng)方法,為今后揭示特絡(luò)細(xì)胞更多功能及作用提供了細(xì)胞學(xué)支持.

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