氣相色譜內(nèi)標法測定松節(jié)中α-蒎烯的含量

1.貴州醫(yī)科大學民族藥與中藥開發(fā)應用教育部工程研究中心/藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州　貴陽　550004； 2.貴州醫(yī)科大學藥學院，貴州　貴陽　550025；3.貴州醫(yī)科大學組織工程與干細胞實驗中心，貴州　貴陽　550004； 4.貴州醫(yī)科大學貴州省藥物制劑重點實驗室，貴州　貴陽　550004

松節(jié)為松科植物云南松(PinusyunnanensisFranch.)、馬尾松(PinusmassonianaLamb.)的干燥瘤狀節(jié)，具有祛風燥濕，舒筋活絡(luò)，活血止痛之功效，可用于關(guān)節(jié)疼痛，筋骨攣急，腳痹痿軟，跌撲瘀諸病[1]。松節(jié)入藥始載于《名醫(yī)別錄》[2]，廣泛分布于四川、云南、貴州和廣西等地。收載于《貴州省中藥、民族藥材質(zhì)量標準》(2003版)，但該標準未明確規(guī)定其質(zhì)量控制方法，對不同來源的松節(jié)藥材中α-蒎烯含量進行含量測定，為松節(jié)藥材的質(zhì)量標準提升提供依據(jù)，有一定理論意義和實際應用價值。目前對于松樹藥用價值的研究，主要是針對松花粉、松針、松香和松節(jié)油，而對松節(jié)的研究較少[3]。α-蒎烯為松節(jié)中重要的組成成分之一，也是松節(jié)油中主要成分，可用于肌肉痛及關(guān)節(jié)痛，許多進口藥用油均以α-蒎烯含量作為質(zhì)量指標[4]。中藥材一般成分復雜，質(zhì)量難以把控，然而單一成分含量標準具有較好的可控性和易操作性，為現(xiàn)在最常用的方法之一。研究以α-蒎烯作為指標成分，使用環(huán)己酮作為內(nèi)標，運用氣相色譜法對其含量進行研究，為松節(jié)的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1　儀器與材料

1.1儀器GC 2010plus型氣相色譜儀(自動進樣器，氫火焰離子化檢測器，日本島津儀器有限公司)；安捷倫7890A型氣相色譜儀；KQ-300DE超聲機(昆山市超聲儀器有限公司)；XR 2O5SM-DR十萬分之一電子天平(瑞士Precisa)。

1.2材料α-蒎烯對照品(批號：110897-200001，中檢院)；11批松節(jié)樣品(詳見表6)由貴州醫(yī)科大學藥學院生藥學與藥用植物學教研室龍慶德副教授鑒定，正己酮(內(nèi)標)、無水乙醇均為色譜純。

2　方法與結(jié)果

2.1氣相色譜條件色譜柱：ZB-5毛細管柱(5%苯基95%二甲基聚硅氧烷，30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)；流速為1.0 mL/min；程序升溫：初始溫度60 ℃，保持2 min，以20 ℃/min速率升溫至160℃，再以120 ℃/min速率升溫至260 ℃，保持2 min；進樣口溫度200 ℃；FID檢測器溫度300 ℃；進樣量1 μL，10∶1分流比進樣。上述色譜條件的圖見圖1。

2.2內(nèi)標溶液的制備精密量取環(huán)己酮100.33 mg至5 mL量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，再精密吸取2.5 mL至500 mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，作為內(nèi)標溶液。

2.3對照品溶液的制備精密稱取α-蒎烯對照品26.22 mg至100 mL容量瓶中，用內(nèi)標液稀釋至刻度，再精密吸取2 mL至5 mL容量瓶中，用內(nèi)標液定容至刻度，作為對照品溶液。

2.4供試品溶液的制備取本品粉末(過三號篩)約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入內(nèi)標液25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率100 W，頻率50 kHz，水溫30 ℃)20 min，放冷，再稱定重量，用乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.5線性關(guān)系的考察精密稱取α-蒎烯對照品26.81 mg至50 mL容量瓶中，用內(nèi)標溶液稀釋至刻度，再分別吸取4、2、1、0.5、0.25、0.125 mL至5 mL量瓶中，用內(nèi)標溶液定容，分別吸取上述溶液1 μL進樣，記錄峰面積。以α-蒎烯的峰面積與內(nèi)標峰面積的比為縱坐標，濃度為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程：y=15.759x-0.0946，R=0.9996，表明α-蒎烯在0.125～4 mg濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6重復性實驗分別精密稱取同一松節(jié)藥材粉末1.5 g (3份)，2 g (3份)，2.5 g (3份)，共計9份，按供試品溶液制備方法及色譜條件，分別測定松節(jié)的含量，結(jié)果RSD為1.19%，表明儀器的重復性良好。

2.7中間精度實驗變更操作人員，變更日期，在同一實驗室，按上述方法分別制備3份供試品溶液，使用島津GC 2010氣相色譜儀連續(xù)進樣6次，進樣量1 μL。第一次測定α-蒎烯的含量平均值為1.176 mg/mL，RSD為0.73%；第二次測定結(jié)果的平均值為1.176 mg/mL，RSD為0.86%，說明方法的中間精密度良好。

2.8耐用性實驗

2.8.1穩(wěn)定性實驗取同一供試品，按“2.4”方法制備供試品溶液，取供試品溶液一份，吸取1 μL根據(jù)GC分析時間，在0/1/2/4/6/8小時分別進樣5次，記錄α-蒎烯峰面積，RSD為0.54%，表明供試品中α-蒎烯再8小時內(nèi)穩(wěn)定。結(jié)果見表1。

表1　穩(wěn)定性實驗結(jié)果

2.8.2不同色譜柱比較按照擬定的色譜條件分別以HP-5 (30 m × 0.32 mm × 0.25 μm)和ZB-5 (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)兩種石英毛細管柱對同一批號3份供試品溶液進行含量測定，結(jié)果兩種不同品牌色譜柱測定結(jié)果基本一致。結(jié)果見表2。

表2　不同色譜柱測試結(jié)果

2.8.3不同進樣口壓力比較將進樣口壓力變?yōu)?5.4、80.9和87.1 kPa，其余色譜條件不變，對同一批號3份供試品進行測定，結(jié)果表明改變進樣口壓力，含量測定結(jié)果基本一致。結(jié)果見表3。

表3　不同進樣口壓力測試結(jié)果

2.8.4不同儀器比較分別以安捷倫GC 7890A、島津GC-2010Plus，其余條件不變，對樣品進行測定，結(jié)果表明，兩種品牌兩種型號的氣相色譜儀測定結(jié)果基本一致。結(jié)果見表4。

表4　不同儀器比較

2.9回收率試驗取同一批含量為1.174 mg/g的松節(jié)藥材粉末9份，每份2 g，分別按樣品中α-蒎烯本底值加入50% (3份)、100% (3份)、150% (3份)的對照品，按“2.4”方法制備供試品溶液，按“2.3”方法制備對照品溶液，按照擬定的色譜條件測定。α-蒎烯平均回收率為103.81%，RSD為0.71%。結(jié)果見表5。

表5　加樣回收率實驗結(jié)果

2.10樣品測定取松節(jié)樣品11批，每份樣品精密稱取2份，每份2 g，按“2.4”方法制備供試品溶液，按“2.3”方法制備方法對照品溶液，按照擬定的色譜條件進行測定，計算α-蒎烯含量。結(jié)果見表6。

表6　不同來源松節(jié)α-蒎烯含量測定

續(xù)表

表6　不同來源松節(jié)α-蒎烯含量測定

3　討論

松節(jié)作為常見的中藥材，廣泛應用于中藥處方中，在《名醫(yī)別錄》和《本草匯言》等書中均有提及，但其質(zhì)量標準尚未明確。2015年版《中華人民共和國藥典》采用α-蒎烯作為油松節(jié)指標性成分[5]，鑒于油松節(jié)和松節(jié)藥效作用相似，研究使用α-蒎烯作對不同產(chǎn)地的松節(jié)進行含量測定，對松節(jié)的質(zhì)量控制，具有一定的實用意義。

內(nèi)標法具有測定結(jié)果較為準確的優(yōu)點，是氣相色譜中常用的定量方法。本研究采用氣相色譜內(nèi)標法測定松節(jié)中α-蒎烯的含量。內(nèi)標物的選擇方面，在確定α-蒎烯的保留時間后，考察了不同化合物(環(huán)己醇、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、環(huán)己酮等)與指標成分的分離，最終選擇可以與α-蒎烯保留時間相近且分離較好的環(huán)己酮作為內(nèi)標物。本實驗確定的色譜條件在不同儀器(日本島津GC-2010plus，安捷倫7890A型)，不同色譜柱(HP-5、ZB-5)以及不同進樣口壓力下均顯示出較好的耐用性。

綜上，本研究使用經(jīng)濟低毒的無水乙醇超聲提取松節(jié)簡單方便，采用氣相色譜內(nèi)標法測定松節(jié)中α-蒎烯含量，具有快速、簡便、準確的優(yōu)點。不同批次的松節(jié)中α-蒎烯相差較大，可能是松樹的生長環(huán)境、年限以及儲藏條件等原因造成的。

[1]貴州省藥品監(jiān)督管理局.貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標準[M].貴州:貴州科技出版社,2003:247.

[2]陳曦.HPLC測定松節(jié)、松針和松香中銀松素和甲基醚的含量[J].天津藥學，2014，26(5)：21-23.

[3]張林林，薛健，劉東靜，等.油松節(jié)藥材中α-蒎烯的測定方法研究[J].中草藥，2009，11：1817-1818.

[4]朱沛韶，陳浩桉，吳翔.松節(jié)油中α-蒎烯的測定[J].中藥材，1999，22(7)：362-363.

[5]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M] .北京:中國醫(yī)藥科技出版社, 2015:227.