不同來源的乙酰膽堿酯酶對農(nóng)藥靈敏度的影響

李綺敏 鄭澤洋 林丹 楊安源

摘 要：通過提取蒼蠅、雞肝、蚯蚓血清、牛肉和馬鮫魚中的乙酰膽堿酯酶，配合農(nóng)藥殘留檢測儀，比較5種不同來源的乙酰膽堿酯酶對農(nóng)藥殘留快速檢測靈敏度的影響。結(jié)果表明：5種不同來源的乙酰膽堿酯酶對農(nóng)藥的靈敏度存在較大差異，蚯蚓血清中的乙酰膽堿酯酶對農(nóng)藥的靈敏度較強(qiáng)，對辛硫磷的靈敏度達(dá)0.2mg/kg，對敵百蟲的靈敏度達(dá)0.1mg/kg。

關(guān)鍵詞：農(nóng)藥殘留;乙酰膽堿酯酶;酶抑制率法

中圖分類號 Q814.4;S481+.8 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 1007-7731（2021）16-0020-03

Effects of Acetylcholinesterase from the Different Sources on Pesticide Sensitivity

LI Qimin1，2 et al.

（1Guangdong Food Industry Institute Co.，Ltd，Guangzhou 511442， China; 2Guangdong Provincial Public Laboratory of Food Industry， Guangzhou 511442， China）

Abstract： The effects of five different sources of acetylcholinesterase on rapid detection sensitivity of pesticide residues were obtained by extracting acetylcholinesterase from fly， the liver of chicken，the serum of earthworm ， beef and mackerel.The results showed that the sensitivity of five different sources of acetylcholinesterase to pesticides was different， the sensitivity of acetylcholinesterase to pesticides in the serum of earthworm was strong， and The sensitivity of phoxim can reach 0.2mg/kg，0.1mg/kg for trichlorfon.

Key words： Pesticide residue; Acetylcholinesterase; The method of enzyme inhibition

果蔬中農(nóng)藥殘留超標(biāo)的情況一直存在，究其原因：一是農(nóng)戶不按規(guī)定的用藥量、次數(shù)、方法或安全間隔期施藥，或施用不允許在果蔬上使用的劇毒、高度農(nóng)藥;二是現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)施行的農(nóng)藥殘留測定需要用大型分析儀器對有機(jī)溶劑進(jìn)行提取、凈化，無法對廉價的果蔬進(jìn)行快速檢測而導(dǎo)致監(jiān)管不到位。而傳統(tǒng)的農(nóng)藥殘留分析方法需要昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人才，并且受到場地的限制。隨著農(nóng)藥殘留快速檢測技術(shù)的出現(xiàn)，這些技術(shù)限制被打破。酶抑制率法在果蔬的農(nóng)藥殘留快速檢測中得到廣泛應(yīng)用，乙酰膽堿酯酶是酶抑制率法的重要組成部分。在國標(biāo)GB/T 5009.199-2003的酶抑制率法中講述了乙酰膽堿酯酶顯色反應(yīng)的原理，通過測定乙酰膽堿酯酶被抑制的程度來判斷農(nóng)藥殘留是否超標(biāo)[1-2]。乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE），又稱真性膽堿酯酶，是一種膜結(jié)合蛋白，主要定位于細(xì)胞膜和突觸前后膜，在生物神經(jīng)傳導(dǎo)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，能夠高效水解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿（ACh），保證神經(jīng)沖動在突觸間的正常傳導(dǎo)，故也稱其為乙酰膽堿水解酶[3]。

乙酰膽堿酯酶廣泛存在于各種動物組織中，如腦、脊髓、肌肉和紅細(xì)胞。本研究選擇蒼蠅、雞肝、蚯蚓血清、牛肉和馬鮫魚5種不同來源的乙酰膽堿酯酶，考察其對12種有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥靈敏度的差異，為農(nóng)藥殘留速測法酶源的選擇提供參考[4-6]。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料 農(nóng)藥殘留檢測儀（廣州萬聯(lián)生物科技有限公司），檢測波長412nm;電子天平[梅特勒-托利多（上海）有限公司];恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）;移液器0.1～10mL;實驗室用水為Milli-Q Tntegral超純水;勻漿機(jī)（德國IKA公司）;渦旋振蕩器（德國IKA公司）;3K15高速離心機(jī)（廣州市科訊實驗器材有限公司）。磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、碳酸氫鈉硫代乙酰膽堿、二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）、12種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品（購自廣州分析測試中心），其余試劑為國產(chǎn)分析純或生化試劑規(guī)格。蒼蠅和蚯蚓線上購買，雞肝、牛肉和馬鮫魚購于農(nóng)貿(mào)市場。

1.2 溶液配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 12種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品（100μg/mL）：3種氨基甲酸酯類（克百威、呋喃丹、滅多威）、9種有機(jī)磷類（樂果、氧化樂果、敵百蟲、甲基異硫磷、敵敵畏、辛硫磷、對硫磷、甲胺磷、馬拉硫磷），分別根據(jù)所需濃度用甲醇稀釋成工作液。

1.2.2 磷酸鹽緩沖溶液 分別取11.9g無水磷酸氫二鉀與3.2g磷酸二氫鉀，用1000mL蒸餾水溶解。

1.2.3 顯色劑 分別取160mg二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）和15.6mg碳酸氫鈉，用20mL緩沖溶液溶解，于4℃冰箱中保存。

1.2.4 底物 取25.0mg硫代乙酰膽堿，加3.0mL蒸餾水溶解，搖勻后置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 原材料處理

1.3.1 蒼蠅乙酰膽堿酯酶 取羽化3d的家蠅，以1∶7的長度比例剪取蒼蠅頭部，用緩沖溶液冰浴勻漿，得乙酰膽堿酯酶粗酶液;粗酶液通過Cleanert-TPT SPE小柱除去色素，得到澄清的乙酰膽堿酯酶液[7] 。

1.3.2 雞肝乙酰膽堿酯酶 去除雞肝中的脂肪，預(yù)冷用1.2.2制得的緩沖溶液，將處理好的雞肝以料液比1∶1進(jìn)行勻漿;在含5%的甘油磷酸鹽緩沖溶液中加入非離子型表面活性劑得到混合液，稱取上述步驟中的勻漿液，以料液比1∶4與混合液進(jìn)行混合，得到以雞肝為來源的乙酰膽堿酯酶液[8-9] 。

1.3.3 蚯蚓乙酰膽堿酯酶 將蚯蚓洗凈后放入清水中24h，排凈其體內(nèi)糞便，按照勻漿液比為1∶1（蚯蚓質(zhì)量（g）/磷酸緩沖液體積（mL））制成勻漿液，離心后棄去上清液，得到粗酶提取液;在10mL的離心管中加入1mL蚯蚓血清的粗酶提取液，再加入表面活性劑Triton X-114和緩沖溶液，用二級水定容至10mL;離心5min后分層將其上層溶液傾倒出去，下層溶液即為乙酰膽堿酯酶液[10]。

1.3.4 牛肉乙酰膽堿酯酶 去除牛肉中的脂肪，預(yù)冷磷酸鹽緩沖溶液，將處理好牛肉以料液比1∶1進(jìn)行勻漿;在含5%的甘油磷酸鹽緩沖溶液中加入非離子型表面活性劑得到混合液，稱取上述步驟中的勻漿液，以料液比1∶4與混合液進(jìn)行混合，得到以牛肉為來源的乙酰膽堿酯酶液[11]。

1.3.5 馬鮫魚乙酰膽堿酯酶 將馬鮫魚去骨、去皮，得到其肌肉組織，預(yù)冷磷酸鹽緩沖溶液，以料液比1∶1進(jìn)行勻漿;在含5%的甘油磷酸鹽緩沖溶液中加入非離子型表面活性劑TritonX-114（0.1%，w/v）得到混合液，稱取上述步驟中的勻漿液，以料液比1∶4與混合液進(jìn)行混合，得到以馬鮫魚為來源的乙酰膽堿酯酶液[12]。

1.4 農(nóng)藥靈敏度的測定

1.4.1 空白溶液測試 先于試管中加入2.5mL磷酸鹽緩沖溶液，再加入0.1mL酶液、0.1mL顯色劑，搖勻后于37℃放置15min以上，每組測試時間保持一致。加入0.1mL底物搖勻，此時溶液開始顯色反應(yīng)，立即放入農(nóng)藥殘留檢測儀中，記錄在波長412nm處反應(yīng)3min的吸光度變化值?A0。

1.4.2 待測溶液測試 先于試管中加入農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)工作液，其他操作與空白溶液測試相同，記錄在波長412nm處反應(yīng)3min的吸光度變化值?At，重復(fù)2次取平均值，計算抑制率。當(dāng)抑制率≥50%時，表明蔬菜中存在一定濃度的有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥。

抑制率（%）=[（?A0-?At）/?A0]×100

2 結(jié)果與分析

2.1 蒼蠅乙酰膽堿酯酶對12種有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的靈敏度 由表1可知，以蒼蠅為酶源的乙酰膽堿酯酶對3種氨基甲酸酯類農(nóng)藥表現(xiàn)出較強(qiáng)的靈敏度，但在有機(jī)磷農(nóng)藥方面表現(xiàn)較差。當(dāng)以1.3.1的方法提取蒼蠅中的乙酰膽堿酯酶時，所得的酶液中干擾物質(zhì)較多，也未進(jìn)行純化步驟，故對部分農(nóng)藥的靈敏度較弱。

2.2 雞肝乙酰膽堿酯酶對12種有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的靈敏度 由表2可知，以雞肝為酶源的乙酰膽堿酯酶對12種農(nóng)藥的表現(xiàn)欠佳，在國標(biāo)GB/T 5009.199—2003給出的參考檢出限下，只對對硫磷和敵百蟲等表現(xiàn)出較強(qiáng)的靈敏度。

2.3 牛肉乙酰膽堿酯酶對12種有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的靈敏度 由表3可知，以牛肉為酶源的乙酰膽堿酯酶對12種農(nóng)藥的靈敏度較差，在國標(biāo)GB/T 5009.199—2003給出的參考檢出限下，僅對敵敵畏和呋喃丹表現(xiàn)出相應(yīng)的靈敏度。

2.4 蚯蚓血清乙酰膽堿酯酶對12種有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的靈敏度 由表4可知，以蚯蚓血清為酶源的乙酰膽堿酯酶對比其他4種酶源，對12種農(nóng)藥均表現(xiàn)出較強(qiáng)的的靈敏度，其中，對敵敵畏、氧化樂果的靈敏度達(dá)到了國標(biāo)GB/T 5009.199—2003中的參考檢出限，對甲胺磷、克百威和呋喃丹的靈敏度高于GB/T 5009.199—2003中的參考檢出限。

2.5 馬鮫魚乙酰膽堿酯酶對12種有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的靈敏度 由表5可知，以馬鮫魚肌肉組織為酶源的乙酰膽堿酯酶對12種農(nóng)藥表現(xiàn)出相對較強(qiáng)的靈敏度，其中敵敵畏和辛硫磷達(dá)到了國標(biāo)GB/T 5009.199—2003中的參考檢出限，對氨基甲酸酯類農(nóng)藥滅多威、克百威和呋喃丹均表現(xiàn)較強(qiáng)的靈敏度。

3 結(jié)論

試驗結(jié)果表明，從具有代表性的昆蟲或動物組織中分離得到的乙酰膽堿酯酶，均對有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥存在一定的靈敏度，但不同的酶源對12種農(nóng)藥的靈敏度存在較大差異，因此酶抑制率法農(nóng)藥殘留快速檢測與所用的酶源有密切的關(guān)系，在對乙酰膽堿酯酶的研究中可拓寬酶源的選擇范圍，篩選出對有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥靈敏度更強(qiáng)的農(nóng)藥。在制備酶液時，加入穩(wěn)定劑甘油和非離子型表面活性劑TritonX-114，能較好地增強(qiáng)酶活，提高乙酰膽堿酯酶對有機(jī)磷和氨基甲酸酯類的靈敏度。

酶抑制率法作為一種快速篩選方法，能快速確定農(nóng)產(chǎn)品中是否存在農(nóng)藥殘留。由于對部分農(nóng)藥的檢測靈敏度較差，以單一酶源建立酶抑制率法測定農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留，必然會造成部分殘留農(nóng)藥不能檢出，因而導(dǎo)致漏檢或錯篩。自制酶提取簡便、價格低廉，但酶液不易保存，可以考慮在酶液中加入一定劑量的防腐劑，縮小不同批次酶液之間穩(wěn)定性的差異。最好采用氣相色譜等實驗室檢測手段，綜合比較試驗結(jié)果，對有懷疑的樣品進(jìn)一步用儀器法確證。

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（責(zé)編：徐世紅）