棉鈴抗氧化酶活性影響棉纖維長(zhǎng)度發(fā)育的研究

杜海燁，康娜娜，成莎，渠云芳，黃晉玲

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

棉花是一種栽培歷史悠久且經(jīng)濟(jì)回報(bào)高的作物。我國(guó)是世界上最大的棉花生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)，提高棉花產(chǎn)量與品質(zhì)面臨重大問(wèn)題。植物抗氧化酶系統(tǒng)中最重要的3種酶SOD、POD和CAT在細(xì)胞內(nèi)抗氧化功能各不相同[1](圖1)，且其作為清除細(xì)胞活性氧自由基(ROS)進(jìn)而影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因素之一[2]，近年來(lái)被很多人作為切入點(diǎn)研究棉花受水澇干旱脅迫[3]、鹽脅迫[4]病害脅迫[5]等的抗逆性。此外抗氧化酶還影響著棉纖維初生壁非纖維素多糖類(lèi)物質(zhì)合成[6]。而MDA作為細(xì)胞呼吸導(dǎo)致的膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物，從側(cè)面反映著細(xì)胞的呼吸活性與抗逆性[7]。

圖1 抗氧化酶系統(tǒng)清除ROS過(guò)程Fig.1 The cleanning process from the antioxidant enzyme system to ROS

棉鈴作為一個(gè)有機(jī)整體，在鈴殼、棉籽和纖維的各器官中進(jìn)行著物質(zhì)及信號(hào)分子的運(yùn)輸，對(duì)整體研究棉花纖維發(fā)育具有重要作用[8]。棉纖維的伸長(zhǎng)與棉鈴的增大相吻合。從開(kāi)花起，經(jīng)20～30 d棉花纖維伸長(zhǎng)接近最大長(zhǎng)度，其中花后5～20 d是纖維伸長(zhǎng)的關(guān)鍵階段，直接影響棉纖維的長(zhǎng)度。本文以葉色不同的一對(duì)棉花近等基因系為研究材料，以棉鈴各器官為研究對(duì)象，對(duì)其棉纖維伸長(zhǎng)階段抗氧化酶活性以及MDA含量變化進(jìn)行研究，以期為棉花纖維品質(zhì)改良提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究選用的材料為葉色不同的一對(duì)棉花近等基因系：綠葉、無(wú)毛、白絮、棕籽(簡(jiǎn)稱(chēng)綠葉棉)和紅葉、無(wú)毛、白絮、棕籽(簡(jiǎn)稱(chēng)紅葉棉)。該對(duì)近等基因系來(lái)自于亞洲棉(Gossypiumarboreum)×比克氏棉(G.bickii)×陸地棉(G.hirsutum) 3種雜種后代，由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花育種實(shí)驗(yàn)室提供。

參試材料于2016年4月在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)作站種植。每個(gè)材料種植2行，采用常規(guī)的栽培管理措施進(jìn)行管理。在棉花開(kāi)花盛期(7月25號(hào))對(duì)參試材料同一果枝同一節(jié)位當(dāng)天所開(kāi)花進(jìn)行掛牌標(biāo)記，并于花后10 d與20 d取2種參試材料不同棉株相同部位棉鈴各30個(gè)，每10個(gè)為一次重復(fù)，重復(fù)3次。每一棉鈴分為鈴殼、棉籽、棉纖維3部分，液氮速凍后儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱。

1.2 試驗(yàn)方法

采用NBT(氮藍(lán)四唑)光還原法測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)活性[9]，在560 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行比色測(cè)定；采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過(guò)氧化物酶(POD)活性[9]，在波長(zhǎng)470 nm處進(jìn)行測(cè)定，記錄吸光度值。酶活性大小以每分鐘OD的變化值來(lái)表示，其單位為△OD470·g-1FW·min-1；采用高錳酸鉀滴定法測(cè)定過(guò)氧化氫酶(CAT)活性[10]，酶活性用每克樣品鮮重1 min內(nèi)分解H2O2的毫克數(shù)表示；采用硫代巴比妥法測(cè)定丙二醛(MDA)含量[9]，在450 nm、532 nm和600 nm處測(cè)定其吸光度值，參比為0.5%的硫代巴比妥。

采用分梳法，隨機(jī)取10粒籽棉將纖維梳直，測(cè)定棉纖維長(zhǎng)度；取100粒籽棉分別將纖維和棉籽稱(chēng)重計(jì)算衣分衣指。

1.3 數(shù)據(jù)處理

測(cè)定數(shù)據(jù)均采用3次重復(fù)均值，使用Excel對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)方差分析；使用SPSS對(duì)纖維發(fā)育指標(biāo)與測(cè)定的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行Pearson雙尾檢測(cè)相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SOD酶活性

棉纖維快速伸長(zhǎng)階段，綠葉棉棉鈴各器官中SOD酶活性呈現(xiàn)顯著上升趨勢(shì)，且在鈴殼和棉纖維中分別上升了50.6%和287%，達(dá)到了極顯著差異水平；紅葉棉的鈴殼和棉籽中SOD酶活性也呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，但在棉纖維中SOD酶活性下降了32%，呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)(圖2)。隨著棉纖維的伸長(zhǎng)發(fā)育，棉鈴各器官氧化呼吸作用增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的ROS。因此，棉鈴的正常發(fā)育需要更高的SOD酶活性。

圖2 纖維伸長(zhǎng)期2種參試材料棉鈴各組織SOD酶活性Fig.2 SOD activity of two materials during fiber elongation periods注：圖中小寫(xiě)字母表示在5%水平上差異；大寫(xiě)字母表示1%水平上差異，下同Note:Lowercase letters in the figure indicate differences at the 5% level; capital letters represent 1% level difference，The same below

花后10 d，綠葉棉鈴殼中SOD酶活性高于紅葉棉且未達(dá)到差異水平(P>0.05)；棉籽和棉纖維中SOD酶活性低于紅葉棉，且纖維中酶含量差異顯著?；ê?0 d，綠葉棉鈴殼和纖維中SOD酶活性極顯著高于紅葉棉，棉籽中紅葉棉極顯著高于綠葉棉(圖3)。從花后10 d到20 d，隨著棉纖維的快速伸長(zhǎng)，綠葉棉的鈴殼和纖維中SOD酶活性顯著高于紅葉棉，這可能是綠葉棉鈴殼和纖維的細(xì)胞具有比紅葉棉更為活躍的呼吸氧化活動(dòng)。

圖3 纖維伸長(zhǎng)期棉鈴各組織SOD活性的變化Fig.3 Changes of SOD activity in different tissues of cotton bolls during fiber elongation

2.2 POD酶活性

棉纖維快速伸長(zhǎng)階段，2種參試材料棉鈴各器官中(除紅葉棉纖維外)POD酶活性逐漸上升，且在紅葉棉的鈴殼中上升了263%，差異極顯著(圖4)。在棉鈴發(fā)育的相應(yīng)時(shí)期，SOD酶活性升高導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子增加，相應(yīng)升高的POD酶活性提高了對(duì)細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子的清除能力。

圖4 纖維伸長(zhǎng)期2種參試材料棉鈴各組織POD酶活性Fig.4 POD activity of two materials during fiber elongation periods

棉花開(kāi)花后10 d和20 d兩個(gè)階段，綠葉棉棉鈴各器官中POD酶活性均高于紅葉棉同一器官，且鈴殼中POD酶活性在花后10 d達(dá)到極顯著差異，在花后20 d達(dá)到顯著差異水平；棉纖維中POD酶活性僅在花后20 d達(dá)到極顯著差異水平；而棉籽中POD酶活性差異在兩個(gè)時(shí)期均沒(méi)有達(dá)到顯著水平(圖5)。POD參與植物體內(nèi)多種生理活動(dòng)，是H2O2的分解劑和解毒物，防止植物細(xì)胞受到氧脅迫，綠葉棉中較高的POD酶活性可能與綠葉棉較高的抗逆性有關(guān)。

圖5 纖維伸長(zhǎng)期棉鈴各組織POD活性的變化Fig.5 Changes of POD activity in different tissues of cotton bolls during fiber elongation

2.3 CAT酶活性

棉纖維快速伸長(zhǎng)階段，兩種參試材料棉纖維中CAT酶活性均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，且在紅葉棉纖維中下降了36%，差異極顯著；在鈴殼和棉籽中變化趨勢(shì)不同：綠葉棉鈴殼與紅葉棉的棉籽呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；綠葉棉的棉籽與紅葉棉的鈴殼中呈現(xiàn)上升趨勢(shì)(圖6)。

圖6 纖維伸長(zhǎng)期2種參試材料棉鈴各組織CAT酶活性Fig.6 CAT activity of two materials during fiber elongation periods

花后10 d，綠葉棉的鈴殼與纖維中的CAT酶活性均顯著高于紅葉棉且在鈴殼中達(dá)到極顯著差異水平，棉籽中紅葉棉CAT酶活性極顯著高與綠葉棉；花后20 d，綠葉棉的棉籽與纖維中CAT酶活性顯著高于紅葉棉，且棉籽中達(dá)到極顯著差異水平，鈴殼中紅葉棉CAT酶活性極顯著高與綠葉棉(圖7)。

圖7 纖維伸長(zhǎng)期棉鈴各組織CAT活性的變化Fig.7 Changes of SOD activity in different tissues of cotton bolls during fiber elongation

2.4 MDA含量

與花后10 d相比，花后20 d綠葉棉鈴殼和纖維中MDA含量分別下降了26%和53%，呈現(xiàn)顯著降低，而棉籽中MDA含量則略有升高。棉纖維伸長(zhǎng)時(shí)期，紅葉棉棉鈴?fù)黄鞴僦蠱DA含量變化趨勢(shì)與綠葉棉相同，但紅葉棉纖維顯著降低，而棉籽中MDA含量顯著升高(圖8)。棉籽中升高的MDA含量推測(cè)與棉籽發(fā)育過(guò)程中較強(qiáng)烈的氧化呼吸作用導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化程度升高有關(guān)聯(lián)。

圖8 纖維伸長(zhǎng)期2種參試材料棉鈴各組織MDA含量Fig.8 MDA content in two different materials during fiber elongation periods

棉纖維伸長(zhǎng)發(fā)育的不同階段，綠葉棉棉鈴各器官M(fèi)DA含量均低于紅葉棉同一階段的相同器官的含量。 2種材料除花后10 d的鈴殼與纖維中MDA含量差異顯著外，其他器官之間MDA含量差異均沒(méi)有顯著差異，且MDA含量在鈴殼和棉籽中含量較高，纖維中含量較低(圖9)。MDA含量是植物細(xì)胞膜脂過(guò)氧化程度的直接反映，棉纖維伸長(zhǎng)的不同階段，紅葉棉棉鈴各器官中MDA含量高于綠葉棉，由此可推測(cè)紅葉棉的膜脂過(guò)氧化強(qiáng)度較高。

圖9 纖維伸長(zhǎng)期棉鈴各組織MDA含量的變化Fig.9 Changes of MDA content in different tissues of cotton bolls during fiber elongation

2.5 2種參試材料的品質(zhì)考察

參試的2種棉花，除百粒籽重外，綠葉棉的百粒籽重、衣指、衣分、纖維的均長(zhǎng)均高于紅葉棉(表1)。

表1 棉花品質(zhì)測(cè)定Table 1 Determination of cotton quality

2.6 棉鈴各項(xiàng)酶活指標(biāo)與纖維發(fā)育相關(guān)性分析

對(duì)棉鈴不同發(fā)育階段各器官的酶活性與纖維發(fā)育指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析(表2)，結(jié)果表明棉纖維伸長(zhǎng)發(fā)育與SOD、POD和CAT酶活性以及MDA含量具有顯著的相關(guān)性，但棉鈴不同器官以及棉纖維發(fā)育的不同時(shí)期各器官的酶活指標(biāo)與纖維發(fā)育的相關(guān)性大小不同。鈴殼與棉纖維中各項(xiàng)酶活指標(biāo)與棉纖維的伸長(zhǎng)發(fā)育顯著相關(guān)，且鈴殼中花10 d的SOD酶活性和花后20 d的CAT酶活性以及花后10 d棉纖維中的SOD酶活性與棉纖維的伸長(zhǎng)發(fā)育呈顯著負(fù)相關(guān)；花后20 d棉籽中的SOD酶活性和CAT酶活性與纖維發(fā)育顯著相關(guān)，且CAT酶活性與纖維發(fā)育呈顯著負(fù)相關(guān)；棉鈴各器官中MDA含量與棉纖維發(fā)育均呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，且花鈴期纖維中達(dá)顯著水平。

表2 各項(xiàng)指標(biāo)與纖維發(fā)育相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis between fiber quality and each index of cotton

注：表中*表示在5%水平上差異；**表示1%水平上差異。

Note：* Indicates a difference at the 5% level;**indicates a 1% level difference.

3 討論

3.1 抗氧化酶活性與棉纖維發(fā)育相關(guān)性分析

氧作為植物體內(nèi)重要的電子受體參與植物多種生命活動(dòng)，但其接受來(lái)自葉綠體和線粒體電子傳遞鏈泄露的電子則會(huì)形成ROS[11]?；钚匝踝杂苫兄妊醺鼮榛顫姷幕瘜W(xué)反應(yīng)性，會(huì)對(duì)植物細(xì)胞產(chǎn)生氧化脅迫性[12]。長(zhǎng)期以來(lái)，ROS被視為脅迫代謝的有害產(chǎn)物[13]。但是近年來(lái)眾多研究發(fā)現(xiàn)ROS還能作為信號(hào)分子行使調(diào)控作用[14]，尤其是H2O2可以輕易穿越細(xì)胞膜且半衰期較長(zhǎng)的特性，使得H2O2在植物發(fā)育的許多過(guò)程中充當(dāng)信號(hào)分子[15,16]。植物體內(nèi)，在ROS清除的過(guò)程中SOD酶將超氧陰離子(O2-)還原成過(guò)氧化氫(H2O2)；POD和CAT在細(xì)胞內(nèi)分別將過(guò)氧化氫還原成羥基自由基和水，這說(shuō)明POD和CAT競(jìng)爭(zhēng)共同底物過(guò)氧化氫，并且ROS在引起生物毒性的同時(shí)也促進(jìn)著多糖的代謝[17]。而羥基自由基被認(rèn)為可以增加細(xì)胞壁延伸性，使細(xì)胞伸長(zhǎng)生長(zhǎng)[18]；同時(shí)羥基自由基也介導(dǎo)生長(zhǎng)素的產(chǎn)生，間接促進(jìn)細(xì)胞伸長(zhǎng)生長(zhǎng)[19]。

本研究中，在棉纖維伸長(zhǎng)發(fā)育階段，一方面，綠葉棉纖維中具有POD活性上升，CAT活性下降的趨勢(shì)；紅葉棉纖維中則呈現(xiàn)POD酶活性和CAT酶活性共同緩慢下降趨勢(shì)。綠葉棉纖維中較高的POD酶活性有利于羥基自由基的積累，而較高的羥基自由基含量對(duì)于纖維細(xì)胞的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，從而影響棉纖維長(zhǎng)度。另一方面棉纖維的發(fā)育是鈴殼、棉籽和纖維協(xié)同發(fā)育的共同結(jié)果。鈴殼中POD酶活性與棉纖維長(zhǎng)度呈現(xiàn)顯著正相關(guān)[8]。2種參試材料鈴殼中SOD與POD酶活性的上升，而CAT變化趨勢(shì)的不同，這可能導(dǎo)致綠葉棉羥基自由基在棉鈴中更多的積累。而由考種數(shù)據(jù)可知，與紅葉棉相比，綠葉棉的纖維較長(zhǎng)，這可能與其在棉纖維伸長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期較高的羥基自由基含量有關(guān)。對(duì)棉鈴中活性氧代謝產(chǎn)物含量變化的后續(xù)研究，將為闡明抗氧化酶對(duì)棉花纖維長(zhǎng)度的影響機(jī)制提供依據(jù)。

3.2 MDA含量與棉鈴發(fā)育相關(guān)性分析

活性氧不僅是有氧代謝的副產(chǎn)物，而且在環(huán)境脅迫下也能大量形成[20]。植株在逆境脅迫下產(chǎn)生大量活性氧，導(dǎo)致各種生物大分子遭到破壞，改變膜的通透性和流動(dòng)性，引發(fā)膜脂的過(guò)氧化反應(yīng)，影響植物正常的代謝。MDA是膜脂過(guò)氧化反應(yīng)的產(chǎn)物之一，對(duì)膜和一些生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸等有較強(qiáng)的破壞性。植物體內(nèi)的MDA的含量能夠反應(yīng)植物抵御逆境的能力以及細(xì)胞膜脂的過(guò)氧化程度[21]。

本研究中，在棉纖維伸長(zhǎng)發(fā)育階段，綠葉棉棉鈴各器官中MDA含量均低于紅葉棉，由此推測(cè)綠葉棉細(xì)胞膜的膜質(zhì)過(guò)氧化程度較低。綠葉棉較高的抗氧化酶系統(tǒng)活性，降低了細(xì)胞中MDA含量，促進(jìn)了纖維素的積累[8]。因而，綠葉棉的衣指與衣分均高于紅葉棉。

4 結(jié)論

通過(guò)一對(duì)棉花近等基因系棉鈴抗氧化酶活性研究結(jié)果表明，棉纖維快速伸長(zhǎng)階段棉鈴抗氧化酶活性與棉纖維的伸長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)。綠葉棉中較高的抗氧化酶活性促進(jìn)棉纖維的伸長(zhǎng)發(fā)育，特別是相對(duì)紅葉棉較高的POD酶活性有利于羥基自由基的形成，促進(jìn)棉纖維的伸長(zhǎng)發(fā)育。

[1]Székely G. Oxidative stress in plants[J]. Studia Universitatis Babes-Bolyai, Biologia, 2009, 10(11):19.

[2]張晉龍. 棉花細(xì)胞質(zhì)雄性不育系晉A與亞棉A活性氧代謝研究[D].太谷:山西農(nóng)業(yè)大學(xué),2016.

[3]田又升,王志軍,于航,等. 干旱脅迫對(duì)不同抗旱性棉花品種抗氧化酶活性及基因表達(dá)的影響[J]. 西北植物學(xué)報(bào),2015,35(12):2483-2490.

[4]李向前. 棉花耐鹽與抗氧化的相關(guān)性及H2O2對(duì)抗氧化系統(tǒng)的調(diào)控[D].烏魯木齊:新疆大學(xué),2010.

[5]郭海軍, 董志強(qiáng), 林永增,等. 黃萎病對(duì)棉花葉片SOD、POD酶活性和光合特性的影響[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 1995, 28(6):40-45.

[6]杜雄明, 潘家駒, 汪若海. 棉纖維細(xì)胞分化和發(fā)育[J]. 棉花學(xué)報(bào), 2000, 12(4):212-217.

[7]高京草, 王慧霞, 李西選. 可溶性蛋白、丙二醛含量與棗樹(shù)枝條抗寒性的關(guān)系研究[J]. 北方園藝, 2010(23):18-20.

[8]宋世佳,孫紅春,張永江,等. 彩色棉抗氧化系統(tǒng)生理特征及纖維素累積對(duì)纖維品質(zhì)的影響[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,48(19):3811-3820.

[9]高俊鳳. 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 北京: 高等教育出版社, 2006: 58-66.

[10]葉寶興，朱新產(chǎn). 作物科學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)[M]. 北京: 高等教育出版社，2007: 447.

[11]del Río L A, Pastori G M, Palma J M, et al. The activated oxygen role of peroxisomes in senescence[J]. Plant Physiology, 1998, 116(4): 1195-2000.

[12]陳俊. 堿地膚幼苗抗氧化酶系統(tǒng)對(duì)鹽堿混合脅迫的生理響應(yīng)特點(diǎn)[D].長(zhǎng)春:東北師范大學(xué),2006.

[13]Miller G, Shulaev V, Mittler R. Reactive oxygen signaling and abiotic stress[J]. Physiologia Plantarum, 2008, 133(3):481-89.

[14]Mittler R, Vanderauwera S, Gollery M, et al. Reactive oxygen gene network of plants[J]. Trends in Plant Science, 2004, 9(10):490-498.

[15]Bienert G P, Schjoerring J K, Jahn T P. Membrane transport of hydrogen peroxide[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes, 2006, 1758(8): 994-1003.

[16]Vandenbroucke K, Robbens S, Vandepoele K, et al. Hydrogen peroxide-induced gene expression across kingdoms: A comparative analysis[J]. Molecular Biology and Evolution, 2008, 25(3): 507-516.

[17]Liu N, Lin Z, Guan L, et al. Antioxidant enzymes regulate reactive oxygen species during pod elongation in Pisum sativum and Brassica chinensis[J]. Plos One, 2014, 9(2):e87588.

[18]Liszkay A, Van der Zalm E, Schopfer P.Production of reactive oxygen intermediates (O2.-, H2O2,and.OH) by maize roots and their role in wall loosening and elongation growth[J]. Plant Physiology, 2004, 136(2):3114-3123.

[19]Schopfer P, Liszkay A, Bechtold M, et al. Evidence that hydroxyl radicals mediate auxin-induced extension growth[J]. Planta, 2002, 214(6):821-828.

[20]薛鑫, 張芊, 吳金霞. 植物體內(nèi)活性氧的研究及其在植物抗逆方面的應(yīng)用[J]. 生物技術(shù)通報(bào),2013 (10): 6-11.

[21]譚永安, 柏立新, 肖留斌, 等. 綠盲蝽危害對(duì)棉花防御性酶活性及丙二醛含量的誘導(dǎo)[J]. 棉花學(xué)報(bào), 2010, 22(5): 479-485.