谷子硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白NRT1家族的鑒定及表達分析

張瑞娟，屈聰玲，賀榆婷，楊致榮，王興春,3*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學 生命科學院，山西 太谷 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學 文理學院，山西 太谷 030801；3.雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與遺傳改良山西省重點實驗室，山西 太谷 030801)

氮素是作物生長發(fā)育過程需求量最大的營養(yǎng)元素，也是限制作物產(chǎn)量和品質(zhì)的主要因素。然而，當前我國氮肥的平均利用率僅35%左右[1]。低水平的氮肥利用率不僅造成了資源的大量浪費，而且還帶來了土壤酸化、水體富營養(yǎng)化等一系列環(huán)境問題[2, 3]。因此，充分挖掘利用作物自身潛力，提高氮素利用效率是發(fā)展資源節(jié)約型和環(huán)境友好型農(nóng)業(yè)的重要保障。

對于大多數(shù)植物來說，硝態(tài)氮是植物從土壤中吸收和利用的主要氮源，其吸收和轉(zhuǎn)運主要由硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白來完成[4, 5]。硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白1(nitrate transporter 1，NRT1)家族是植物中最大的硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白家族。該家族蛋白不僅可以轉(zhuǎn)運硝酸鹽，還可以轉(zhuǎn)運鉀鹽、多肽、氨基酸、葡萄糖異硫氰酸鹽和植物激素等，因此也有人將NRT1家族稱之為NPF家族(NRT1/PTR FAMILY)[6, 7]。在模式植物擬南芥中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)53個NRT1家族成員[8]。其中，已知的與硝酸鹽吸收和轉(zhuǎn)運有關(guān)的蛋白有11個，它們各司其職，共同促進植物對氮素的吸收利用[4]。AtNRT1.1(AtNPF6.3)是第一個被鑒定出來的NRT1家族蛋白，參與高、低濃度硝酸鹽的轉(zhuǎn)運[9, 10]。AtNRT1.1與另外一個NRT1家族蛋白AtNRT1.2共同負責根部硝酸鹽吸收[10, 11]。根部吸收的硝酸鹽，由AtNRT1.5、AtNRT1.8和AtNRT1.9進一步運輸至植物的莖部[12～14]。AtNRT1.4和AtNRT1.6基因分別在葉柄和幼嫩的種子中表達，負責調(diào)控硝酸鹽向葉片和種子的分配，在調(diào)控葉片和胚胎早期發(fā)育過程起著重要的作用[15, 16]。在擬南芥衰老過程中，AtNRT1.7基因負責硝酸鹽從衰老器官向幼嫩器官的轉(zhuǎn)運，該基因功能喪失后將影響植物氮素的循環(huán)再利用[17]。AtNRT1.11和AtNRT1.12 在主葉脈的伴胞中表達，負責硝酸鹽從木質(zhì)部到韌皮部的轉(zhuǎn)運[18]。此外，AtNRT1.3基因在地上部分的表達受到硝酸鹽的誘導，但在硝酸鹽吸收和轉(zhuǎn)運過程的具體功能尚不清楚[19]。與擬南芥相比，水稻中NRT1基因家族的研究相對較少。其中，功能較清楚的是AtNRT1.1的同源基因OsNRT1.1B[20]。正是由于NRT1.1B基因一個單核苷酸多態(tài)性導致了秈稻和粳稻兩大亞種之間硝酸鹽利用的差異，該基因在提高水稻氮素利用效率方面具有重要的應用價值[20]。

谷子具有突出的耐瘠薄特性，是解析作物氮素高效吸收利用機制的理想材料。2012年，由中國華大基因和美國國家能源部所屬的聯(lián)合基因組研究所分別進行的張谷和豫谷1號全基因組測序工作相繼完成，使得在全基因組水平鑒定谷子氮素高效利用相關(guān)基因成為可能[21, 22]。前期我們利用生物信息學的方法從谷子中鑒定了93個NPF家族蛋白，但這些蛋白中可能僅有少部分參與了硝酸鹽的吸收和轉(zhuǎn)運(王興春，未發(fā)表數(shù)據(jù))。本文進一步以擬南芥中11個具有硝酸鹽轉(zhuǎn)運功能的NRT1家族蛋白為基礎(chǔ)，從谷子中鑒定出8個可能與硝酸鹽吸收和轉(zhuǎn)運相關(guān)的NRT1基因，并對其進行了生物信息學和表達譜分析，為深入揭示硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白NRT1家族基因功能和谷子耐貧瘠的機制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

谷子NRT1基因表達模式分析所用品種為‘豫谷1號’。將‘豫谷1號’播種在大田，2周后取長勢良好且健康的幼苗；抽穗5天時，分別取長勢良好且健康植株的根、莖、葉和穗。所有材料均取3份生物學重復，取材后立即液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 擬南芥、水稻和谷子硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白NRT1家族的篩選

目前，擬南芥中已知的與硝酸鹽吸收和轉(zhuǎn)運相關(guān)的NRT1基因有11個，分別為AtNRT1.1-AtNRT1.9，AtNRT11和AtNRT12。首先，在TAIR網(wǎng)站(http://www.arabidopsis.org/)檢索這11個NRT1的蛋白序列，若該基因有不同剪切方式，則選擇最長的一個。然后，將獲得的蛋白序列在Phytozome網(wǎng)站(https://phytozome.jgi.doe.gov/)分別與谷子和水稻基因組進行序列比對，從而獲得谷子和水稻NRT1家族的CDS序列、基因全長、啟動子序列及氨基酸序列。

1.3 NRT1家族生物信息學分析

利用ExPASy(https://www.expasy.org/)的computer pI/Mw工具在線分析谷子、擬南芥和水稻硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白NRT1的理化性質(zhì)，所有參數(shù)均選擇默認。用Mega 7.0軟件[23]對谷子、擬南芥和水稻的硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白NRT1進行多序列比對，用Neibor-joining算法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，分析參數(shù)選擇默認值。以谷子全基因組數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，搜索NRT1家族成員基因序列上游的1 500 bp堿基，獲取啟動子ATG之前的所有堿基序列作為基因的啟動子序列，利用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在線分析谷子NRT1家族成員啟動子元件。通過MEME v4.11.0 (http://meme-suite.org/tools/meme)在線分析谷子、擬南芥和水稻NRT1家族成員氨基酸序列保守位點，保守位點寬度設(shè)置為≥10和≤100，最大保守序列鑒定數(shù)目設(shè)置為6。

1.4 谷子總RNA的提取和RT-PCR

谷子總RNA的提取采用TaKaRa的總RNA提取試劑盒(貨號9769S)，反轉(zhuǎn)錄采用TaKaRa的PrimeScriptT TMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒(貨號RR047 A)，所有操作都嚴格按照試劑盒使用說明書進行。取苗、根、莖、葉和穗的cDNA，采用RT-PCR的方法檢測基因的表達情況，RT-PCR引物見表1。

表1 RT-PCR引物Table 1 Primers used in RT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 谷子硝酸鹽轉(zhuǎn)運子NRT1的鑒定

以擬南芥中11個參與硝酸鹽吸收和轉(zhuǎn)運的NRT1蛋白序列為基礎(chǔ)，利用 BLASTP在谷子全基因組數(shù)據(jù)庫中進行序列比對，共鑒定出8個谷子NRT1基因(表1)。其中，與擬南芥AtNRT1.6和AtNRT1.7蛋白序列相似度最高的谷子NRT1家族蛋白均為Seita.5G424900，將其歸為序列相似度較高的AtNRT1.7的同源基因；與擬南芥AtNRT1.5和AtNRT1.9蛋白序列相似度最高的均為Seita.1G296400，將其歸為序列相似度較高的AtNRT1.5的同源基因；與擬南芥AtNRT1.11和AtNRT1.12蛋白序列相似度最高的均為Seita.5G326900，將其歸為序列相似度較高的AtNRT1.11的同源基因。為了比較谷子硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白NRT1基因家族與其它單子葉植物之間的進化關(guān)系，同時從單子葉模式植物水稻中鑒定出8個與硝酸鹽吸收轉(zhuǎn)運相關(guān)的NRT1基因(表2)。這些NRT1蛋白的氨基酸序列長度在576～620 aa之間，分子量處于57.53～68.7 kDa之間，理論等電點在5.5～9.23之間。

2.2 谷子硝酸鹽吸收和轉(zhuǎn)運相關(guān)NRT1家族系統(tǒng)發(fā)育樹和基因結(jié)構(gòu)分析

為揭示谷子中參與硝酸鹽轉(zhuǎn)運的NRT1家族成員的系統(tǒng)進化關(guān)系，并對其進行分類，利用谷子、水稻和擬南芥NRT1蛋白全長序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。參照擬南芥NPF家族分類結(jié)果，谷子中8個參與硝酸鹽轉(zhuǎn)運的NRT1分屬于5個NPF亞家族，其中NPF6亞家族3個成員，NPF2亞家族2個成員，NPF1、NPF4和NPF7亞家族各有1個成員(圖1)。此外，谷子所有NRT1與水稻同一亞家族親緣關(guān)系相對較近，而與擬南芥同一亞家族成員間親緣關(guān)系相對較遠(圖1)。對家族成員的基因結(jié)構(gòu)分析顯示，與擬南芥和水稻相比，谷子NRT1基因結(jié)構(gòu)相對較簡單，內(nèi)含子數(shù)較少，為1～3個。此外，同一亞家族的谷子、水稻和擬南芥NRT1基因之間內(nèi)含子數(shù)相差較大(圖1)。

表2鑒定的谷子硝酸鹽轉(zhuǎn)運相關(guān)NRT1基因及其在擬南芥和水稻中的同源基因和相應的理化性質(zhì)

Table2NRT1 genes identified inSetariaitalicaand their homologs inArabidopsisthalianaandOryzasativaand there physical and chemical properties

擬南芥Arabidopsisthaliana水稻Oryzasativa谷子Setariaitalica符號Symbol基因編號GeneID分子量/kDMolecularWeight等電點Isoelectricpoint符號Symbol基因編號GeneID分子量/kDMolecularWeight等電點Isoelectricpoint符號Symbol基因編號GeneID分子量/kDMolecularWeight等電點IsoelectricpointAtNRT11At1G121106492868OsNPF65LOC＿Os10g406006372828SiNPF63Seita．6G0583006452919AtNRT12At1G698506398881OsNPF411LOC＿Os06g382946373903SiNPF415Seita．4G2315006369884AtNRT13At3G21670652591OsNPF66LOC＿Os04g390306237901SiNPF67Seita．1G2105006496923AtNRT14At2G266906357906OsNPF62LOC＿Os01g375906258855SiNPF62Seita．5G1950005753877AtNRT15At1G3245068755OsNPF711LOC＿Os02g485706411628SiNPF712Seita．1G2964006411663AtNRT16At1G270806493717--------AtNRT17At1G698706842884OsNPF25LOC＿Os01g685106579812SiNPF210Seita．5G4249006705866AtNRT18At4G216806551611------AtNRT19At1G188806517907OsNPF24LOC＿Os03g481806356908SiNPF28Seita．3G4065006481758AtNRT111At1G52190669897OsNPF12LOC＿Os01g556106456914SiNPF14Seita．5G3269006422895AtNRT112At3g161806533912--------

圖1 谷子、擬南芥和水稻硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白NRT1家族蛋白進化樹及基因結(jié)構(gòu)Fig.1 The unrooted phylogenetic tree and gene structure of nitrate transporter NRT1 family in Setaria italica, Arabidopsis thaliana and Oryza sativa

2.3 谷子硝酸鹽轉(zhuǎn)運相關(guān)NRT1家族蛋白保守位點分析

利用DNAMAN5.0和MEME在線軟件對11個擬南芥NRT1家族成員、8個水稻NRT1家族成員和8個谷子NRT1家族成員的蛋白保守位點進行分析，發(fā)現(xiàn)谷子參與硝酸鹽吸收和轉(zhuǎn)運的NRT1蛋白都含有1個由25個氨基酸組成的保守QX4GX8GX3FX5P基序(圖2)。進一步分析表明，在擬南芥和水稻參與硝酸鹽吸收和轉(zhuǎn)運的NRT1蛋白中也含有1個類似基序(圖2)，這表明NRT1基因在不同物種間進化存在保守性。

2.4 谷子NRT1基因啟動子序列分析

分別截取8個谷子NRT1基因的起始密碼子上游1 500 bp的基因組序列，利用Plant CARE分析預測啟動子區(qū)順式作用元件。發(fā)現(xiàn)NRT1家族成員啟動子除含有一些基本元件如CAAT-box、TATA-box之外，還富含光響應元件(6種)，其中所有的基因均含有SP1、G-Box及G-box光響應元件和TGACG-motif茉莉酸甲酯響應元件。谷子NRT1基因還含有幾種逆境相關(guān)元件和生長發(fā)育相關(guān)元件，如干旱響應元件(MBS)、脫落酸響應元件(ABRE)、分生作用相關(guān)元件(CCGTCC-box)、生長素誘導增強元件(GC-motif)及水楊酸響應元件(TCA-element)等。此外，5個谷子NRT1基因啟動子含有高轉(zhuǎn)錄水平順式作用元件(表3)。

圖2 NRT1蛋白家族保守基序分布Fig.2 Distribution of conserved motifs of NRT1 family members

2.5 谷子NRT1家族基因表達模式分析

為了研究谷子NRT1基因家族在不同組織中的表達特征，我們利用RT-PCR的方法檢測了上述8個NRT1基因在苗、根、莖、葉和穗中的表達情況。如圖3所示，8個谷子NRT1基因表達具有組織特異性，其中Seita.1G210500和Seita.5G424900基因在檢測的所有組織中都表達，且這兩個基因在葉中的表達量都相對較高；所有8個NRT1基因在幼苗和莖中都表達，但Seita.5G195000基因的表達量相對較低；Seita.1G210500、Seita.5G424900和Seita.6G058300 3個基因在根中表達，可能負責從土壤中吸收硝酸鹽；而Seita.1G210500、Seita.3G406500和Seita.5G424900在穗中表達，可能參與了籽粒形成過程硝酸鹽的轉(zhuǎn)運。

圖3 硝酸鹽吸收和轉(zhuǎn)運相關(guān)NRT1基因在谷子不同組織中的表達分析Fig.3 Expression analysis of NRT1 genes in different foxtail millet tissues

3 討論

隨著植物基因組研究的不斷深入以及豫谷1號和張谷等谷子基因組測序工作的相繼完成，利用比較基因組學鑒定和分析谷子重要功能基因家族成為可能。本研究以模式植物擬南芥和水稻作為參照，在谷子全基因組水平鑒定了8個與硝酸鹽吸

收和轉(zhuǎn)運相關(guān)的NRT1家族基因，并對其進行了生物信息學分析和表達模式研究，為后續(xù)深入解析谷子NRT1基因家族的功能和解析谷子氮素高效利用機制奠定了基礎(chǔ)，對于提高作物氮素利用效率、減輕環(huán)境污染和降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本等具有重要意義。

進化分析發(fā)現(xiàn)谷子參與硝酸鹽吸收和轉(zhuǎn)運的NRT1基因分屬于NPF1、NPF2、NPF4、NPF6和NPF7亞家族，但缺少擬南芥AtNRT1.6(At1G27080)、AtNRT1.8(At4G21680)和AtNRT1.12(At3g16180)對應的同源基因(圖1)，這與同為單子葉植物的水稻和小麥類似[24]。導致這一現(xiàn)象的原因可能有兩個：一是谷子等單子葉植物在全基因組復制時發(fā)生未知事件造成了NRT1基因的缺失；二是單雙子葉植物在長期的進化過程中，這些基因發(fā)生較大的變異。此外，谷子與水稻NRT1家族的親緣關(guān)系較近，而與擬南芥之間的親緣關(guān)系較遠(圖2)。NRT1基因內(nèi)含子和外顯子的數(shù)目和分布情況能為其進化關(guān)系提供重要的證據(jù)。盡管我們發(fā)現(xiàn)NRT1家族在谷子、水稻和擬南芥中具有保守的QX4GX8GX3FX5P基序(圖2)，但該基序是否與硝酸鹽的吸收和轉(zhuǎn)運有關(guān)仍有待深入研究。硝酸鹽的吸收和轉(zhuǎn)運受到眾多因素的影響，其中光是最重要的因素之一[25]。我們發(fā)現(xiàn)谷子NRT1基因家族啟動子區(qū)富含6種光響應元件，其中8個啟動子全部含有SP1光響應元件(表3)，這可能是光合作用的產(chǎn)物量增加導致氮素等營養(yǎng)需求增加。Seita.6G058300和Seita.4G231500啟動子中含有預測到的所有元件，這表明Seita.6G058300和Seita.4G231500在響應環(huán)境信號發(fā)面有著重要的作用。與擬南芥類似，谷子NRT1基因的表達具有組織特異性，表明NRT1基因家族在谷子不同生長發(fā)育時期以及不同組織和器官中各司其職，共同促進植物對氮素的吸收利用。Seita.1G210500和Seita.5G424900在谷子所有組織中都表達，這兩個基因可能在谷子的生長發(fā)育中起著重要的作用。

表3 谷子NRT1家族啟動子元件預測Table 3 Predicted cis-acting elements of NRT1 family in Setaria italic

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