神經(jīng)干細(xì)胞在缺血性腦卒中中的臨床應(yīng)用現(xiàn)狀

謝 沖，管陽(yáng)太

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海 200127

最新的疾病負(fù)擔(dān)研究顯示，在中國(guó)，導(dǎo)致早死所致生命損失年（years of life lost，YLL）最高的疾病是腦卒中[1]。最新流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)腦卒中的年齡標(biāo)化患病率、發(fā)病率和死亡率分別為1 114.8/10萬(wàn)、246.8/10萬(wàn)人年和114.8/10萬(wàn)人年；中國(guó)農(nóng)村居民腦卒中發(fā)病率（298.2/10萬(wàn)人年）顯著高于城市居民（203.6/10萬(wàn)人年）[2]。腦卒中嚴(yán)重影響人民的健康，同時(shí)也給社會(huì)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)腦卒中防治工程委員會(huì)發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)腦卒中患者約700萬(wàn)人，每年因腦卒中帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)達(dá)400億元[3]。因此，如何有效地治療腦卒中以及促進(jìn)腦卒中患者的功能恢復(fù)是目前亟待解決的重大難題。

腦卒中后及時(shí)的康復(fù)訓(xùn)練可以促進(jìn)大腦的重塑和神經(jīng)功能的恢復(fù)[4]，但是恢復(fù)的效果隨著時(shí)間的遷延而減退，并且神經(jīng)功能恢復(fù)在數(shù)月后進(jìn)入“高原期”。由此說(shuō)明，神經(jīng)的內(nèi)源性修復(fù)存在時(shí)間局限性[5]。在組織學(xué)水平上，通過(guò)促進(jìn)神經(jīng)和血管的再生可以提高神經(jīng)功能恢復(fù)的水平。然而，迄今為止，所有通過(guò)促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)修復(fù)來(lái)改善腦卒中患者臨床癥狀的藥物嘗試都是失敗的[6]。基于上述研究結(jié)果，促使研究者關(guān)注于探索促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)的外源性方法。

隨著干細(xì)胞研究的不斷深入，以神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cell，NSC）為基礎(chǔ)的細(xì)胞治療在腦卒中和神經(jīng)退行性疾病的治療中顯示出巨大的應(yīng)用潛力。多項(xiàng)研究表明，NSC可以延長(zhǎng)腦卒中藥物干預(yù)的時(shí)間窗，減少梗死面積，改善神經(jīng)缺損癥狀，促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)[7-8]。當(dāng)前有關(guān)NSC治療腦卒中的臨床前研究日益增多[9]。2016年8月，Lancet報(bào)道了首個(gè)人源性NSC治療缺血性腦卒中Ⅰ期臨床試驗(yàn)的結(jié)果，目前Ⅱ期臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行之中[10]。本文旨在總結(jié)近年來(lái)NSC從實(shí)驗(yàn)室進(jìn)入臨床試驗(yàn)的進(jìn)程，并探討NSC治療機(jī)制及臨床應(yīng)用前景，以期為更多高質(zhì)量臨床試驗(yàn)的開(kāi)展提供文獻(xiàn)支持。

1 NSC治療腦卒中的機(jī)制

為提高和優(yōu)化NSC的治療價(jià)值，從細(xì)胞學(xué)、分子學(xué)和生物學(xué)角度理解NSC發(fā)揮治療效果的機(jī)制至關(guān)重要。目前認(rèn)為，NSC主要通過(guò)以下三個(gè)方面的機(jī)制發(fā)揮治療作用：一是直接替代梗死組織中的神經(jīng)元，修復(fù)神經(jīng)通路；二是通過(guò)旁分泌、免疫調(diào)控等手段發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用；三是促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)和血管再生。

1.1 直接的細(xì)胞替代

內(nèi)源性NSC主要存在于血管微環(huán)境中，其中大部分保持未分化狀態(tài)，通過(guò)直接接觸或釋放可溶性因子與周?chē)h(huán)境相互作用。在梗死病灶中，內(nèi)源性NSC很少通過(guò)直接參與分化為神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞以實(shí)現(xiàn)組織修復(fù)。注射入體內(nèi)的外源性NSC則可以在體內(nèi)進(jìn)行遷移并分化為神經(jīng)細(xì)胞。注射入體內(nèi)的NSC可以分化為多種類(lèi)型的細(xì)胞，包括神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，且部分細(xì)胞表達(dá)血管特異性標(biāo)志物[11-12]。然而，單純的細(xì)胞替代學(xué)說(shuō)正在受到質(zhì)疑，這是因?yàn)槠渲委熜Ч⒉慌c外源性細(xì)胞的存活或分化比例相關(guān)[13-14]?？傊?，雖然移植的NSC在體內(nèi)表現(xiàn)出一定的存活和分化能力，但尚未對(duì)此達(dá)成共識(shí)，因此僅用細(xì)胞替代學(xué)說(shuō)以解釋NSC的治療作用尚不全面。

1.2 改善宿主局部微環(huán)境

在NSC移植后，宿主腦組織內(nèi)的細(xì)胞增殖會(huì)顯著增強(qiáng)[12,15]。移植的NSC增強(qiáng)內(nèi)源性神經(jīng)再生的原因可能與釋放某些神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子或抑制局部炎癥和細(xì)胞凋亡有關(guān)。人源性NSC可以分泌多種營(yíng)養(yǎng)因子，從而直接促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)再生[15-18]。

研究表明，腦卒中后3個(gè)月時(shí)，腦組織內(nèi)仍然存在炎癥，抑制腦室下區(qū)（subventricular zone，SVZ）的細(xì)胞增殖，而外源性NSC可以逆轉(zhuǎn)這一過(guò)程[12]。注射N(xiāo)SC后，可以觀察到NSC通過(guò)借助各種黏附因子和炎性細(xì)胞因子而最終到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）病灶周?chē)鳦NS病灶周?chē)腃D45＋淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯減少，CNS內(nèi)浸潤(rùn)的CD4＋T細(xì)胞所占比例及絕對(duì)數(shù)量均明顯下降[19-20]。

1.3 促進(jìn)血管再生

血管再生是組織再生的一個(gè)必備和先決條件，而移植的NSC同樣可以增加病灶的血供。人源性NSC在體外可以釋放血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），而VEGF可以通過(guò)促進(jìn)新生血管生成以增加局部組織的血供[21-22]。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，NSC可以增加缺血大鼠模型的血供，在移植NSC后12～14 d，缺血組織的血供可以恢復(fù)至基線水平[23]。NSC還可以通過(guò)分泌表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）以影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的生成。還有研究發(fā)現(xiàn)，NSC可以通過(guò)直接接觸方式以促進(jìn)血管內(nèi)皮的生成[7,13]。NSC與血管內(nèi)皮細(xì)胞在空間上逐漸靠近，促使血管內(nèi)皮細(xì)胞形成新生血管，而血管內(nèi)皮細(xì)胞反過(guò)來(lái)又可通過(guò)釋放可溶性因子以促進(jìn)NSC分化。血管再生與神經(jīng)再生在時(shí)間和空間上存在嚴(yán)密調(diào)控和相互協(xié)調(diào)的關(guān)系。

2 人源性NSC制備技術(shù)的發(fā)展

人源性NSC是一種較好的腦卒中治療選擇，這是因?yàn)镹SC可以在體外通過(guò)特定培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)因子（如EGF、FGF等）進(jìn)行規(guī)模性增殖，并且由于NSC具有自我增殖的特性，因此可以不斷地傳代下去，從而避免了細(xì)胞來(lái)源不足的難題。早期的人源性NSC大多來(lái)源于捐獻(xiàn)的胚胎，而隨著誘導(dǎo)多能干（induced pluripotent stem，iPS）細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，目前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了從體細(xì)胞到誘導(dǎo)NSC的轉(zhuǎn)化，從而解決了取材困難和免疫排斥的難題。然而，在應(yīng)用人源性NSC時(shí)同樣面臨一些問(wèn)題，如NSC培養(yǎng)所形成的細(xì)胞球內(nèi)混雜著不同增殖階段的干細(xì)胞或前體細(xì)胞，細(xì)胞的同質(zhì)性較差，從而影響干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果的效力[24]。此外，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，人源性NSC會(huì)隨著不斷地傳代，表現(xiàn)出增殖活性降低、基因突變?cè)龆嗟痊F(xiàn)象，而傳代細(xì)胞在細(xì)胞活力和分化潛力上亦不盡相同[25-26]。為解決上述問(wèn)題，轉(zhuǎn)錄因子Myc被用于人源性NSC的改造。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Myc可以延長(zhǎng)NSC的傳代周期，保持NSC基因型的穩(wěn)定，進(jìn)而形成“永生細(xì)胞系”[27]。

ReNeuron公司生產(chǎn)的CTX細(xì)胞是一種成熟的人源性NSC產(chǎn)品，被當(dāng)前絕大多數(shù)臨床前實(shí)驗(yàn)和臨床研究所應(yīng)用。CTX細(xì)胞的主要作用是將c-Myc基因連同控制元件插入NSC基因中，在維持細(xì)胞多能性和增殖活性的同時(shí)，通過(guò)控制元件以確保細(xì)胞處于相同的增殖階段，并批量保存于“細(xì)胞銀行”中。一旦細(xì)胞被輸注入體內(nèi)，c-Myc與控制元件發(fā)生甲基化而失去作用，可防止干細(xì)胞的永久增殖。隨著技術(shù)的進(jìn)步，CTX細(xì)胞已逐步實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化生產(chǎn)和儲(chǔ)存，出廠后可以直接進(jìn)行臨床注射使用，而無(wú)需進(jìn)行再次復(fù)蘇與檢測(cè)，真正實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化隨取隨用。

3 NSC治療缺血性腦卒中的臨床前研究

在開(kāi)展臨床試驗(yàn)之前，研究者通過(guò)開(kāi)展大量的臨床前研究以評(píng)估NSC治療缺血性腦卒中的安全性和有效性。最常采用的缺血性腦卒中動(dòng)物模型為大鼠線栓法大腦中動(dòng)脈阻斷（middle cerebral artery occlusion，MCAo）模型。線栓法的基本原理是通過(guò)線栓阻閉大腦中動(dòng)脈起始部，造成大腦中動(dòng)脈供血區(qū)缺血，從而使大鼠發(fā)生局灶性腦缺血，引發(fā)局部腦組織缺血性壞死，繼而表現(xiàn)出各種神經(jīng)功能缺損癥狀。此方法的優(yōu)勢(shì)是穩(wěn)定性好、重復(fù)性好、損傷小、梗死部位確切且成功率高。通過(guò)開(kāi)展MCAo模型實(shí)驗(yàn)，研究者已積累了大量有關(guān)NSC治療缺血性腦卒中的數(shù)據(jù)（表1），為NSC治療腦卒中臨床研究的開(kāi)展奠定了基礎(chǔ)。

多項(xiàng)使用CTX細(xì)胞的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，人源性NSC在大鼠體內(nèi)可以分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，可有效改善MCAo模型大鼠的運(yùn)動(dòng)與感覺(jué)功能，但是對(duì)于高級(jí)認(rèn)知功能（如記憶和學(xué)習(xí)）則無(wú)明顯的改善作用[11-12]。大鼠神經(jīng)功能的改善與腦內(nèi)注射的外源性NSC數(shù)量成正比，而不與最終存活的外源性NSC數(shù)量成正比，由此說(shuō)明外源性NSC的治療作用并不直接依賴(lài)于存活細(xì)胞所發(fā)揮的神經(jīng)細(xì)胞替代作用，而可能與注射的外源性NSC的旁分泌作用（神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的釋放）有關(guān)，旁分泌機(jī)制可導(dǎo)致內(nèi)源性神經(jīng)再生能力的加強(qiáng)[12]。除了CTX細(xì)胞，其他人源性NSC系也被應(yīng)用于缺血性腦卒中的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。研究者同樣發(fā)現(xiàn)人源性NSC可以改善大鼠的神經(jīng)功能、減少梗死面積，且外源性NSC還具有免疫調(diào)節(jié)特性，可以通過(guò)調(diào)控白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-10等炎性細(xì)胞因子的分泌以抑制腦組織的局部炎癥，促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)再生和血管生成[28-29]。除了人源性NSC以外，鼠源性NSC也被應(yīng)用于MCAo模型的治療。CHEN等[30]發(fā)現(xiàn)，外源性NSC改善神經(jīng)功能的作用可能與調(diào)控內(nèi)源性NSC的分化有關(guān)，即增強(qiáng)神經(jīng)元的生成而抑制NSC向膠質(zhì)細(xì)胞分化。

表1 NSC治療缺血性腦卒中臨床前研究

4 NSC治療缺血性腦卒中的臨床研究

目前已完成或正在進(jìn)行中的2項(xiàng)人源性NSC治療缺血性腦卒中的臨床試驗(yàn)均采用CTX細(xì)胞。PISCES Ⅰ期臨床試驗(yàn)[10]已完成，數(shù)據(jù)已發(fā)表，PISCES Ⅱ期臨床試驗(yàn)?zāi)壳耙淹瓿苫颊哒心脊ぷ鳌?/p>

第1項(xiàng)人源性NSC治療缺血性腦卒中的臨床試驗(yàn)是在英國(guó)完成的，這項(xiàng)PISCES Ⅰ期臨床試驗(yàn)的結(jié)果顯示，NSC可以改善患者的神經(jīng)癥狀評(píng)分，且未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)[10]。PISCES Ⅰ期臨床試驗(yàn)是一項(xiàng)開(kāi)放的單臂研究，入組患者為11例年齡為60歲以上的處于穩(wěn)定期的缺血性腦卒中男性患者，接受1×106、5×106、10×106或20×106個(gè)CTX細(xì)胞的腦內(nèi)注射；主要終點(diǎn)事件是腦內(nèi)注射CTX細(xì)胞的安全性和耐受性，次要終點(diǎn)事件是治療后24個(gè)月時(shí)的神經(jīng)功能評(píng)分[10]。在整個(gè)研究期間，未發(fā)現(xiàn)CTX細(xì)胞相關(guān)不良事件；4例患者出現(xiàn)與腦內(nèi)注射相關(guān)的無(wú)癥狀性不良反應(yīng)，未引發(fā)癲癇[10]。研究結(jié)果顯示，腦內(nèi)注射CTX細(xì)胞后，隨著時(shí)間的推移，患者的美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院卒中量表（National Institute of Health Stroke Scale，NIHSS）評(píng)分有所改善，但是Barthel指數(shù)和上下肢Ashworth分級(jí)評(píng)分均無(wú)明顯改善；腦內(nèi)注射CTX細(xì)胞后第12個(gè)月，4例患者的改良Rankin評(píng)分表現(xiàn)為1個(gè)級(jí)別的改善，其余7例患者的改良Rankin評(píng)分無(wú)明顯變化；腦內(nèi)注射CTX細(xì)胞后第24個(gè)月，7例患者的改良Rankin評(píng)分無(wú)明顯變化，1例患者的改良Rankin評(píng)分表現(xiàn)為2個(gè)級(jí)別的惡化，3例患者的改良Rankin評(píng)分表現(xiàn)為1個(gè)級(jí)別的改善[10]。

由于PISCES Ⅰ期臨床試驗(yàn)[10]入組患者少，且未設(shè)對(duì)照組，因此該研究結(jié)論的可靠性尚待驗(yàn)證。在完成PISCES Ⅰ期臨床試驗(yàn)后，PISCES Ⅱ期臨床試驗(yàn)也已正式啟動(dòng)，納入大腦中動(dòng)脈區(qū)缺血性腦卒中后遺留上肢癱瘓的40歲以上男性或女性患者，至少21例；試驗(yàn)設(shè)計(jì)為多中心、單臂、開(kāi)放研究；每一例入組患者在腦卒中后3個(gè)月時(shí)，接受腦內(nèi)注射20×106個(gè)CTX細(xì)胞（即PISCESⅠ期臨床試驗(yàn)中采用的最高細(xì)胞數(shù)）；觀察周期為12個(gè)月，主要終點(diǎn)事件為上肢功能恢復(fù)情況以及包括NIHSS評(píng)分、Barthel指數(shù)、改良Rankin評(píng)分在內(nèi)的神經(jīng)功能和殘疾度指標(biāo)。

5 小結(jié)與展望

本文從治療機(jī)制、制備技術(shù)、臨床前研究和臨床研究等方面詳細(xì)回顧了人源性NSC從實(shí)驗(yàn)室走入臨床應(yīng)用的進(jìn)程。目前的臨床前研究和Ⅰ期臨床試驗(yàn)均顯示出NSC治療缺血性腦卒中的光明前景。然而，目前已開(kāi)展的臨床試驗(yàn)尚存在不少局限，如樣本量小、觀察期短，以至于無(wú)法發(fā)現(xiàn)相對(duì)少見(jiàn)的不良反應(yīng)（包括成瘤性）。外源性NSC在注射入人體后，必須嚴(yán)密監(jiān)測(cè)其增殖特性，以防腫瘤生成。此外，值得關(guān)注的是，目前開(kāi)展的臨床研究均未詳細(xì)規(guī)范入組患者的生活方式和康復(fù)鍛煉方法，而這些對(duì)于慢性缺血性腦卒中患者而言十分重要，長(zhǎng)期的生活方式和康復(fù)鍛煉方式的差異可能會(huì)干擾研究結(jié)果，因此后續(xù)研究應(yīng)將此納入考量。

總之，今后有待開(kāi)展更多設(shè)計(jì)合理的NSC治療缺血性腦卒中的臨床研究，以推動(dòng)NSC在缺血性腦卒中患者中的合理應(yīng)用。