Hsa_circ_PVT1在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義

朱元鑫，付航瑋，林夏，藍(lán)翔，馬鈺，李光耀，董睿，王宇洲，陳平

在全球范圍內(nèi)，肝細(xì)胞癌(HCC)約占原發(fā)性肝癌的90%，是癌癥相關(guān)致死的主要原因之一，其中有50%的病例發(fā)生在我國[1]。目前肝癌最有效的治療方法仍然是手術(shù)治療，但是由于缺乏早期診斷的有效手段，導(dǎo)致僅30%～40%的肝癌患者適于根治性切除術(shù)，而且由于術(shù)后高復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率，導(dǎo)致這些肝癌患者預(yù)后較差[2-3]。因此，尋找更加有效的腫瘤標(biāo)志物是HCC早期診斷、早期治療以及改善預(yù)后的關(guān)鍵。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA(circRNA)作為一類共價(jià)閉合環(huán)狀的內(nèi)源性RNA，廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中[4-6]，且可能作為癌癥早期診斷的新型生物標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)[7]。hsa_circ_PVT1(CircBaseID: hsa_circ_0001821)是一類來源于PVT1基因座內(nèi)的長鏈非編碼RNA區(qū)漿細(xì)胞瘤變體易位轉(zhuǎn)錄物，長約410nt。Chen等[8]首次利用RNA測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)漿細(xì)胞瘤多樣異位基因1(circ-PVT1)在胃癌組織中高表達(dá)，并且通過與miR-125b結(jié)合促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖，證實(shí)了circ-PVT1在胃癌中可以作為一種新型的增殖因子及預(yù)后標(biāo)志物。circ-PVT1與人類肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展是否存在相關(guān)性，能否通過影響肝癌細(xì)胞的增殖能力從而影響肝癌發(fā)生和演變，目前尚不清楚。本研究檢測HCC患者中肝癌組織/癌旁組織的circ-PVT1表達(dá)水平，分析其與患者臨床病理指標(biāo)的關(guān)系，并通過干擾circ-PVT1的表達(dá)檢測細(xì)胞增殖能力的變化，以明確circ-PVT1表達(dá)與人肝癌細(xì)胞增殖的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與研究對(duì)象

1.1.1 主要試劑 南美胎牛血清(ExCell公司)，DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，總RNA提取試劑盒(Promega公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa公司)，細(xì)胞周期檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù))，CCK-8(Dojindo 公司)，Click-iT EDU法細(xì)胞增殖成像檢測試劑盒(凱基生物)，LipoFiter脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(漢恒生物)。

1.1.2 研究對(duì)象 本研究收集2016年1月－2017年6月在第三軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院肝膽外科行肝癌切除術(shù)且術(shù)后病理診斷為HCC的患者共46例，且入組患者術(shù)前均未接受放療或者化療，組織標(biāo)本包括：組織標(biāo)本取自肝癌組織和癌旁組織(距離腫瘤>2cm)。人肝癌細(xì)胞系(HepG2、SMMC-7721、MHCC-97H、MHCC-97L、HCC-LM3)，正常人肝細(xì)胞系(L02，上海市生命科學(xué)院細(xì)胞中心)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 組織標(biāo)本與數(shù)據(jù)收集 46例HCC患者的肝癌組織/癌旁組織標(biāo)本均在腫瘤切除后15min內(nèi)置于液氮罐中凍存。臨床病理指標(biāo)主要包括：患者性別、年齡、家族史、肝硬化、HBsAg、腫瘤大小、腫瘤TNM分期、分化程度、甲胎蛋白(alpha fetal protein，AFP)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase， ALP)、γ-谷胺酰轉(zhuǎn)肽酶(gamma glutamyl transpeptidase， GGT)。本試驗(yàn)所有標(biāo)本獲取前均得到受試者同意，并得到第三軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞系(HepG2、SMMC-7721、MHCC-97H、MHCC-97L、HCC-LM3)，正常人肝細(xì)胞系L02均采用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，5%CO237℃的細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)。

1.2.3 circ-PVT1表達(dá)檢測 按照試劑盒說明書提取組織標(biāo)本及細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。取上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在Bio-Rad PCR儀上擴(kuò)增，反應(yīng)體系為10μl，包括cDNA 1μl，上下游引物各0.5μl，SYBR Premix Ex Taq(2×)5μl。RT-qPCR條件為：95℃ 預(yù)變性30s；95℃ 5s，60℃退火30s，40個(gè)循環(huán)。Hsa_circ_PVT1引物序列：前引物5'-GGTTCCACCAGCGTTATTC-3'，后引物5'-CAACTTCCTTTGGGTCTCC-3'；線性RNA PVT1引物序列：前引物5'-TTCAGCACTCTGGACGGAC TT-3'，后引物5'-TATGGCAGGGCAGGGTAG-3'；GAPDH作為內(nèi)參，前引物5'-TTGCCCTCAACGAC CACTTT-3'，后引物5'-TGGTCCAGGGGTCTTACT CC-3'(成都擎科生物合成)。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。通過熔解曲線分析確認(rèn)擴(kuò)增特異性，利用ΔCt法(目標(biāo)基因Ct值－內(nèi)參基因的Ct值)比較表達(dá)的高低，采用2–ΔΔCT法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)設(shè)小干擾RNA PVT1(sicircPVT1)組和陰性對(duì)照(si-NC)組，分別以LipoFiter脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將si-circPVT1和si-NC轉(zhuǎn)染入人肝癌細(xì)胞系HepG2、SMMC-7721中。轉(zhuǎn)染方法：HepG2、SMMC-7721分別以2.0×105/孔在6孔板中培養(yǎng)，待融合度達(dá)40%～50%時(shí)，將培養(yǎng)基換成無血清DMEM，嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行操作。si-circPVT1及si-NC均由上海生工公司合成，sicircPVT1序列：5'-GCCAACUUCCUUUGGGUCUT T-3'，si-NC序列：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGU TT-3'。

1.2.5 CCK-8實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后常規(guī)消化，重懸并計(jì)數(shù)，以2.0×103/孔接種于96孔板中。置于培養(yǎng)箱(37℃，5%CO2)中分別培養(yǎng)24、48、72、96h，每孔加入10μl CCK-8溶液，37℃孵育2h，酶標(biāo)儀檢測450nm波長處吸光度(OD)值。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。

1.2.6 EdU實(shí)驗(yàn) 采用Click-iT EdU法細(xì)胞增殖成像檢測試劑盒進(jìn)行EdU測定。將細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后常規(guī)消化，重懸并計(jì)數(shù)，以1.0×104/孔接種于96孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。50μmol/L EdU孵育2h后，用4%多聚甲醛將細(xì)胞固定并用Click-iT反應(yīng)混合物染色，Hoechst 33342染細(xì)胞核，在熒光顯微鏡(OLympus FSX100)下隨機(jī)取3個(gè)視野拍照，并計(jì)算EdU陽性細(xì)胞百分率。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，按照細(xì)胞周期試劑盒使用說明進(jìn)行固定、染色，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，并記錄激發(fā)波長488nm處紅色熒光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0及GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組之間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。數(shù)據(jù)以±s表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 circ-PVT1在人肝癌組織及肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)檢測 RT-qPCR結(jié)果顯示，circ-PVT1在人肝癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織(圖1A，P＜0.001)，同時(shí)circ-PVT1在人肝癌細(xì)胞系(HepG2、SMMC-7721、MHCC-97H、MHCC-97L、HCC-LM3)中的表達(dá)水平明顯高于人正常肝細(xì)胞系L02(圖1B，P<0.05)。

圖1 RT-qPCR檢測circ-PVT1在人肝癌組織(A)及肝癌細(xì)胞系(B)中的表達(dá)水平Fig.1 Expression of circ-PVT1 in human hepatocellular carcinoma (HCC) and HCC cell lines detected by RT-qPCR

2.2 circ-PVT1的表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌患者臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系 circ-PVT1表達(dá)水平(ΔCt)與肝細(xì)胞癌患者腫瘤大小(P=0.029)，腫瘤TNM分期(P=0.036)及分化程度(P=0.038)密切相關(guān)(表1)。

2.3 siRNA轉(zhuǎn)染效率及特異性檢測 RT-qPCR結(jié)果顯示，si-circPVT1可明顯抑制circ-PVT1的表達(dá)(P<0.001)，但對(duì)其親本基因PVT1的mRNA表達(dá)幾乎無影響(P=0.05)，表明此siRNA可特異性干擾circ-PVT1的表達(dá)(圖2)。

圖2 RT-qPCR檢測si-circPVT1對(duì)circ-PVT1及PVT1線性轉(zhuǎn)錄本mRNA表達(dá)量的影響Fig.2 Expression of circ-PVT1 and PVT1 RNA were detected after treatment with si-circPVT1 by RT-qPCR

表1 肝癌組織中circ-PVT1表達(dá)水平(ΔCt)與HCC患者臨床病理指標(biāo)之間的關(guān)系Tab.1 Relationship between circ-PVT1 expression levels (ΔCt) in cancer tissues and clinicopathological features of patients with HCC

2.4 干擾circ-PVT1表達(dá)對(duì)人肝癌細(xì)胞周期及增殖能力的影響 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干擾circ-PVT1表達(dá)后，人肝癌細(xì)胞HepG2、SMMC-7721的增殖活性明顯低于si-NC組(P＜0.01，圖3A、B)。EDU實(shí)驗(yàn)得到相同的結(jié)果，即干擾circ-PVT1的表達(dá)后，與si-NC組比較，si-circPVT1組肝癌細(xì)胞增殖能力明顯下降(圖3C、D)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，sicircPVT1組細(xì)胞在G1期的比例明顯高于si-NC組，S期和G2期的細(xì)胞比例則低于si-NC組。推測干擾circ-PVT1表達(dá)后，肝癌細(xì)胞系HepG2、SMMC-7721可能發(fā)生了G1/S期轉(zhuǎn)換阻滯(圖3E、F)。

3 討 論

在過去的幾十年中，環(huán)狀RNA一直被認(rèn)為是剪接體介導(dǎo)的拼接錯(cuò)誤產(chǎn)生的副產(chǎn)物[9]，并未引起科研工作者們的足夠重視。然而，近年來隨著高通量測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用和生物信息技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA在真核生物中普遍存在[4,10]，且通過非線性反向剪接形成閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其表達(dá)具有組織特異性、細(xì)胞類型特異性及生長階段差異性[7,11-12]，引起了科研工作者們?cè)絹碓蕉嗟闹匾?。最近已?jīng)發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了多種環(huán)狀RNA具有重要的生理功能[13]，尤其在癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中，環(huán)狀RNA可能作為多種癌癥的診斷標(biāo)志物及潛在的治療靶點(diǎn)。但是由于癌癥的多樣性以及在不同的發(fā)展階段，環(huán)狀RNA都可能通過不同的靶點(diǎn)發(fā)揮作用[11-12]，所以其作用機(jī)制至今尚未完全闡明。研究報(bào)道最多的是環(huán)狀RNA可作為競爭性內(nèi)源RNA或miRNA分子海綿，形成circRNA-miRNA-mRNA軸參與癌癥的發(fā)展[4,14]。部分環(huán)狀RNA含有miRNA結(jié)合位點(diǎn)，可以通過與mRNA競爭性結(jié)合miRNA，抑制mRNA降解[4,14-15]，從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)作用。例如，Circ-SRY通過吸附miR-138成為結(jié)直腸癌和卵巢癌中的腫瘤相關(guān)分子[16]；Cir-ITCH可以作為miR-7、miR-17和miR-214的分子海綿，抑制Wnt/β-Catenin信號(hào)通路[17]；ciRS-7通過與miR-7相互作用參與胃癌的發(fā)生發(fā)展過程[18]；Hsa_circ_0005386通過與miR-129-5p相互作用調(diào)控Notch1的表達(dá)，從而參與HCC的發(fā)生過程，并且可以作為HCC診斷的潛在生物標(biāo)志物[19]。

人類PVT1基因位于染色體8q24區(qū)，在腫瘤細(xì)胞中，此區(qū)是常見的DNA擴(kuò)增區(qū)，提示腫瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)高，屬于癌癥易感基因座。Chen等[8]在對(duì)胃癌中環(huán)狀RNA的研究過程中首次命名了circ-PVT1，發(fā)現(xiàn)circ-PVT1是一種源自PVT1基因的3號(hào)外顯子，并且側(cè)翼含有2個(gè)長的內(nèi)含子，其中富含大量ALU元件重復(fù)序列的細(xì)胞質(zhì)環(huán)狀RNA，在胃癌中，circ-PVT1可以通過對(duì)let-7b的海綿吸附作用促進(jìn)c-Myc的表達(dá)，并且可以通過與miR-125b結(jié)合促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖，證實(shí)了circ-PVT1是胃癌中的新型增殖因子和預(yù)后標(biāo)志物。本研究利用RT-qPCR技術(shù)檢測了46例HCC患者肝癌組織/癌旁組織中circ-PVT1的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)circ-PVT1在肝癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，circ-PVT1的表達(dá)水平與HCC患者的腫瘤大小、TNM分期及分化程度密切相關(guān)。為進(jìn)一步研究circ-PVT1與HCC發(fā)生發(fā)展過程的關(guān)系，我們比較了人肝癌細(xì)胞系(HepG2、SMMC-7721、MHCC-97H、MHCC-97L、 HCC-LM3)中circ-PVT1的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平高于正常肝細(xì)胞系L02；體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，干擾circ-PVT1表達(dá)可明顯抑制肝癌細(xì)胞的增殖能力，并且對(duì)細(xì)胞周期分布產(chǎn)生顯著影響。

圖3 siRNA干擾circ-PVT1表達(dá)對(duì)人肝癌細(xì)胞系HepG2、SMMC-7721增殖和細(xì)胞周期的影響Fig.3 Effects of circ-PVT1 on cell proliferation and cell cycle of HCC cell lines HepG2 and SMMC-7721 after treatment with sicirc-PVT1

綜上所述，circ-PVT1不僅是HCC診斷的潛在生物標(biāo)志物，而且可能會(huì)成為HCC中的一種新型增殖因子，但其在HCC發(fā)生發(fā)展過程中的具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究闡明。

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