環(huán)磷酰胺對(duì)大鼠卵巢結(jié)構(gòu)與功能的影響及機(jī)制

魏天琴，凌麗，馮秀山，張文倩，熊正愛(ài)

早發(fā)性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI)是指女性年齡<40歲，出現(xiàn)月經(jīng)紊亂(月經(jīng)稀發(fā)4個(gè)月或閉經(jīng))，伴有低雌激素和高促性腺激素[連續(xù)2次間隔4周促卵泡激素(FSH)>25U/L[1]]等卵巢活動(dòng)衰退的臨床綜合征[2-3]。 POI的病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制尚不清楚，可能與染色體缺陷、感染、自身免疫性損傷及醫(yī)源性因素等相關(guān)[3-4]。育齡婦女中POI的發(fā)病率較高，且隨著惡性腫瘤年輕化及發(fā)病率的增加，因化療導(dǎo)致的POI呈逐年上升趨勢(shì)，因此與POI相關(guān)的基礎(chǔ)研究尤為重要。環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)屬烷化劑類(lèi)抗腫瘤藥，卵巢是其生殖毒性作用的主要靶器官。本研究采用CTX建立化療所致POI大鼠模型，動(dòng)態(tài)觀察大鼠卵巢的組織病理學(xué)和內(nèi)分泌功能改變，初步探討POI的發(fā)病機(jī)制，以期為臨床治療POI提供實(shí)驗(yàn)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 10～12周齡健康雌性SD大鼠，體重220～260g，購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，代養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，相對(duì)濕度50%～60%，室溫23±1℃，明暗周期12h，自由飲食和飲水。每日上午8:00～9:00行陰道脫落細(xì)胞涂片，觀察動(dòng)情周期，連續(xù)觀察7d，篩選50只動(dòng)情周期正常大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(編號(hào)：2016-044)。

1.2 主要試劑 CTX(江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司)；雌激素(E2)、抗苗勒管激素(AMH)、FSH、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-α(VEGF-α)ELISA試劑盒(武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司)；Bax/Bcl-2單克隆抗體(Proteintech武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；山羊抗鼠抗體二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 POI模型的建立 參考文獻(xiàn)[5-6]方法建立POI模型。將50只動(dòng)情周期正常的健康雌性SD大鼠隨機(jī)分為模型組及對(duì)照組，每組25只。模型組：無(wú)菌條件下，將200mg CTX溶于100ml生理鹽水，配制成濃度為2mg/ml的溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。首日以50mg/kg 負(fù)荷劑量腹腔注射，隨后以8mg/(kg·d)維持劑量連續(xù)腹腔注射上述溶液14d。對(duì)照組每日腹腔注射等量生理鹽水。建模完成24h及1、2、4、8周采用3%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉大鼠，心臟采血法分批處死，每次每組處死5只，采集相關(guān)實(shí)驗(yàn)材料。

1.3.2 觀察指標(biāo) ①動(dòng)情周期觀察：從兩組大鼠中隨機(jī)篩選10只，每日上午8:00～9:00行陰道脫落細(xì)胞涂片，HE染色，光鏡下觀察大鼠動(dòng)情周期[7]。②血清性激素檢測(cè)：收集建模完成24h及1、2、4、8周大鼠血清，嚴(yán)格按照ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作流程檢測(cè)血清AMH、E2及FSH的水平。③大鼠體重變化及卵巢器官指數(shù)測(cè)定：記錄大鼠每日體重。摘取大鼠雙側(cè)卵巢稱(chēng)濕重，測(cè)定卵巢臟器指數(shù)。卵巢臟器指數(shù)=卵巢濕重/體重。④卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察及卵泡計(jì)數(shù)：摘取建模完成24h及1、2、4、8周大鼠新鮮卵巢，4%多聚甲醛固定72h，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度5μm，行HE染色，光鏡下觀察卵巢組織病理學(xué)變化并進(jìn)行原始卵泡、初級(jí)卵泡、次級(jí)卵泡及成熟卵泡計(jì)數(shù)。⑤其他臟器組織形態(tài)學(xué)觀察：摘取建模完成24h及1、2、4、8周大鼠新鮮心臟、肝臟、脾、肺、腎臟和子宮，4%多聚甲醛固定72h，常規(guī)方法制備石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察并攝片。

1.3.3 POI發(fā)生機(jī)制的研究 ①卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞凋亡檢測(cè)：取建模完成24h及1、2、4、8周大鼠卵巢石蠟切片，常規(guī)脫蠟處理，按照TUNEL檢測(cè)試劑盒方法操作，光鏡下觀察棕色陽(yáng)性細(xì)胞。②卵巢組織凋亡相關(guān)蛋白檢測(cè)：提取建模完成24h及1、2、4、8周大鼠卵巢組織總蛋白，分別檢測(cè)樣品蛋白含量，SDS-PAGE凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2h，洗膜，加入Bax、Bcl-2、β-actin一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次，加入二抗室溫孵育2h，TBST洗膜3次，ECL化學(xué)發(fā)光，X線片曝光。Image J軟件計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin灰度值比值。③卵巢組織勻漿中TNF-α、IL-1β、IL-6和VEGF-α含量檢測(cè)：摘取建模完成24h及1、2、4、8周大鼠卵巢，液氮研磨卵巢組織樣本，4℃下12 000r/min離心15min，收集勻漿上清液，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)各組上清液的蛋白濃度。嚴(yán)格按照ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作流程檢測(cè)卵巢組織勻漿中TNF-α、IL-1β、IL-6和VEGF-α的含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組大鼠一般情況比較 與對(duì)照組比較，CTX誘導(dǎo)的POI模型組大鼠毛色暗淡無(wú)光，日常活動(dòng)減少，部分出現(xiàn)腹瀉。模型組大鼠體重于注射CTX后即開(kāi)始下降，注射8周結(jié)束后較對(duì)照組明顯下降，且于建模完成時(shí)降至最低(P<0.05，或P<0.01，圖1)，停藥后體重緩慢增加。

2.2 動(dòng)情周期的改變 HE染色結(jié)果顯示，正常大鼠動(dòng)情周期(圖2A)分為動(dòng)情間期(以白細(xì)胞為主)、動(dòng)情前期(以橢圓形有核上皮細(xì)胞為主)、動(dòng)情期(以片狀、樹(shù)葉狀堆積的無(wú)核角化上皮細(xì)胞為主)及動(dòng)情后期(白細(xì)胞、無(wú)核角化上皮細(xì)胞及有核上皮細(xì)胞同時(shí)存在，且比例相當(dāng))。對(duì)陰道脫落細(xì)胞HE染色結(jié)果行統(tǒng)計(jì)分析顯示：CTX誘導(dǎo)的POI模型組大鼠動(dòng)情周期紊亂，表現(xiàn)為動(dòng)情間期延長(zhǎng)、持續(xù)動(dòng)情間期、無(wú)動(dòng)情期及動(dòng)情后期(圖2B)。

2.3 大鼠血清性激素水平的比較 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示：CTX誘導(dǎo)的POI模型組大鼠血清各時(shí)間點(diǎn)AMH、E2水平較對(duì)照組明顯下降(P<0.01)，而FSH水平較對(duì)照組明顯升高(P<0.01，圖3)。

2.4 大鼠卵巢形態(tài)學(xué)及各級(jí)卵泡計(jì)數(shù)比較 模型組大鼠卵巢臟器指數(shù)[(2.38±0.22)×10–4]與對(duì)照組[(2.41±0.20)×10–4]比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與對(duì)照組比較，CTX誘導(dǎo)的POI模型組大鼠卵巢間質(zhì)增生和纖維化明顯，生長(zhǎng)卵泡閉鎖增多，次級(jí)卵泡數(shù)及成熟卵泡數(shù)明顯減少(P<0.05)，原始卵泡及初級(jí)卵泡數(shù)量稍減少，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。

2.5 大鼠其他重要臟器的組織形態(tài)學(xué)改變 與對(duì)照組比較，CTX誘導(dǎo)的POI模型組大鼠子宮腺體萎縮，子宮壁變薄，組織較正常致密，子宮腔縮小(圖5A、B)；心臟、肝臟、脾、肺及腎臟組織無(wú)明顯病理學(xué)改變(圖5C)。

圖1 CTX對(duì)大鼠體重的影響Fig.1 Effect of CTX on rat's body weight

圖2 CTX對(duì)大鼠動(dòng)情周期的影響Fig.2 Effect of CTX on rat's estrous cycle

圖3 CTX注射后各時(shí)間點(diǎn)大鼠血清AMH、E2、FSH水平的比較Fig.3 Serum AMH, E2, FSH levels at different time points after CTX injection

2.6 CTX對(duì)大鼠卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞凋亡的影響TUNEL染色顯示，對(duì)照組卵泡內(nèi)僅見(jiàn)少量TUNEL染色呈弱陽(yáng)性的凋亡細(xì)胞，而CTX誘導(dǎo)的POI模型組TUNEL染色陽(yáng)性的凋亡細(xì)胞明顯增加(圖6)。

2.7 兩組凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示CTX誘導(dǎo)的POI模型組大鼠卵巢內(nèi)Bax表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高(P<0.01)，而B(niǎo)cl-2表達(dá)水平較對(duì)照組明顯下降(P<0.01，圖7)。

圖4 CTX誘導(dǎo)的POI大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)改變及各級(jí)卵泡計(jì)數(shù)情況Fig.4 Ovarian morphology and follicle count of rats with CTX-induced POI

圖5 CTX誘導(dǎo)的POI模型組大鼠與對(duì)照組大鼠重要臟器組織形態(tài)學(xué)比較Fig.5 Comparison of the uterus and other organs in model and control group

2.8 大鼠卵巢組織勻漿中TNF-α、IL-1β、IL-6及VEGF-α含量比較 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，CTX誘導(dǎo)的POI大鼠卵巢組織勻漿中TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯上升(P<0.01)，VEGF-α水平明顯下降(P<0.01，圖8)。

圖6 CTX誘導(dǎo)的POI大鼠與正常大鼠卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞凋亡比較(TUNEL×200)Fig.6 Comparison of the apoptosis of granulose cells in model and control group (TUNEL ×200)

圖7 CTX誘導(dǎo)的POI大鼠與正常大鼠卵巢內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2表達(dá)水平Fig.7 Comparison of the levels of Bcl-2 and Bax protein in model and control group

圖8 兩組大鼠卵巢組織勻漿中炎癥因子含量比較(n=25)Fig.8 Comparison of the concentration of inflammatory cytokines in model and control group (n=25)

3 討 論

POI臨床表現(xiàn)多樣，病因復(fù)雜，且呈進(jìn)行性發(fā)展，患者常以月經(jīng)改變?yōu)橄日?，主要表現(xiàn)為月經(jīng)稀發(fā)或閉經(jīng)，也可表現(xiàn)為雌激素缺乏相關(guān)癥狀，如血管舒縮癥狀、精神神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、泌尿生殖道癥狀及骨質(zhì)疏松等。POI在一般人群中的發(fā)病率為1%～3%[8]，也有研究報(bào)道在40歲前的發(fā)病率約為1%，20歲前的發(fā)病率為1‰[9]，其中化療藥物引發(fā)的POI占POI總數(shù)的25%[10]?；熕侣殉补δ苁軗p的程度與接受化療時(shí)患者的年齡、化療藥物的種類(lèi)及劑量有關(guān)。目前臨床常用的化療藥物按作用機(jī)制主要分為5大類(lèi)[11]：鉑類(lèi)、烷化劑、抗代謝藥、植物堿及抗生素。CTX屬于雙功能烷化劑及細(xì)胞非特異性藥物，被廣泛用于抗腫瘤、免疫抑制治療等，卵巢是其雌性生殖毒性作用的主要靶器官[12]。

良好的POI模型需滿足下列幾個(gè)條件：①動(dòng)情周期改變；②血清性激素水平變化；③卵泡數(shù)量減少；④造模所用藥物對(duì)其他重要臟器無(wú)明顯損傷。大鼠的動(dòng)情周期一般為4～5d，動(dòng)情周期中陰道脫落細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化主要受雌激素變化的影響，可間接地反映卵巢功能[13]。因此陰道脫落細(xì)胞涂片法可以較準(zhǔn)確地區(qū)分大鼠動(dòng)情周期的每個(gè)階段。本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠動(dòng)情周期紊亂，血清AMH、E2水平明顯下降，F(xiàn)SH水平明顯升高，與臨床POI患者的內(nèi)分泌變化一致，且卵巢內(nèi)各級(jí)卵泡數(shù)量均不同程度減少，子宮病理呈低雌激素改變，其他重要臟器無(wú)明顯器質(zhì)性損害，表明CTX誘導(dǎo)的POI模型建立成功。其中卵巢內(nèi)各級(jí)卵泡數(shù)量均不同程度減少，尤以成熟卵泡數(shù)量減少最為明顯，表明成熟卵泡比原始卵泡對(duì)CTX更敏感，這也是青春期前的女性在接受化療時(shí)，其卵巢對(duì)化療藥物的耐受性相對(duì)較好的原因[14]。有研究表明，曾經(jīng)接受過(guò)化療的女性，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，多數(shù)會(huì)出現(xiàn)卵巢功能受損表 現(xiàn)[15-16]。部分臨床化療患者的卵巢功能在停用化療藥后有一定程度的恢復(fù)，而在本實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)間內(nèi)，模型組大鼠卵巢間質(zhì)增生和纖維化明顯，卵巢功能無(wú)明顯恢復(fù)，可能與觀察時(shí)間不夠長(zhǎng)有關(guān)。在下一步的實(shí)驗(yàn)中，本課題組計(jì)劃進(jìn)一步延長(zhǎng)觀察時(shí)間，并與雄鼠合籠，更直觀地觀察卵巢的生殖功能情況。

POI的發(fā)生機(jī)制尚不十分清楚，一般認(rèn)為與始基卵泡池儲(chǔ)備不足、卵泡閉鎖加速、優(yōu)勢(shì)卵泡募集改變、卵泡成熟障礙等相關(guān)。有研究表明，CTX引起卵巢結(jié)構(gòu)及功能改變的主要機(jī)制是細(xì)胞凋亡，其中顆粒細(xì)胞的凋亡最早發(fā)生[17]，而顆粒細(xì)胞凋亡受Bax及Bcl-2調(diào)控。Bcl-2基因是一種癌基因，具有抑制細(xì)胞凋亡的作用；Bax基因與Bcl-2基因同源，具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。TUNEL法染色顯示，模型組卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞凋亡增加；Western blotting結(jié)果顯示，模型組大鼠卵巢組織中凋亡蛋白Bax表達(dá)上調(diào)，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)，均表明CTX可促進(jìn)卵巢內(nèi)顆粒細(xì)胞的凋亡，并進(jìn)一步引起卵巢結(jié)構(gòu)和功能的改變。

相關(guān)研究表明，多種細(xì)胞因子參與了POI的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[18-20]。其中，CTX作用于機(jī)體，誘發(fā)機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)，釋放相關(guān)細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1β和IL-6，這些細(xì)胞因子可通過(guò)多種路徑作用于顆粒細(xì)胞，調(diào)控顆粒細(xì)胞的凋亡[18]。此外，VEGF參與維持卵巢的正常功能，且其時(shí)間分布與雌激素水平有關(guān)。VEGF mRNA在原始卵泡、初級(jí)卵泡、閉鎖卵泡中無(wú)表達(dá)[21]，在卵泡期的卵母細(xì)胞中呈弱表達(dá)，并隨卵子成熟表達(dá)漸強(qiáng)，至排卵、黃體形成時(shí)達(dá)最強(qiáng)，黃體萎縮后表達(dá)漸弱。VEGF能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂、增生和游走，參與卵巢周期性血管生成，調(diào)節(jié)卵巢的血供[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組卵巢組織勻漿上清中TNF-α、IL-1β和IL-6含量上升，VEGF-α含量下降，說(shuō)明CTX誘導(dǎo)的POI大鼠卵巢處于慢性炎癥反應(yīng)狀態(tài)，局部微環(huán)境改變，卵泡不能發(fā)育成熟或不能排卵，與臨床POI患者的卵巢有卵泡丟失、閉鎖、無(wú)排卵相符。

綜上所述，CTX可致卵巢結(jié)構(gòu)及功能改變，且與臨床POI患者的表現(xiàn)類(lèi)似。POI的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，本實(shí)驗(yàn)只是初步探討其發(fā)病機(jī)制，檢測(cè)指標(biāo)尚不完善，需要進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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