百里香抑菌物質(zhì)的提取工藝優(yōu)化及活性研究

王娣，柯春林，曹珂珂，李妍

(蚌埠學(xué)院 生物與食品工程系，安徽 蚌埠　233030)

超高壓技術(shù)是指常溫下用100～1000 MPa的流體靜壓力作用于物料，瞬間的升、降壓差會使活性成分滲出細(xì)胞進(jìn)入提取液中[1-3]。超高壓提取(UHPE)具有效率高、能耗低等優(yōu)點，可用于食品滅菌及淀粉、蛋白質(zhì)變性等，也可對精油、多酚類、黃酮類等活性成分進(jìn)行提取[4-12]。

百里香(Thyme)為唇形科，主要分布在長江流域以北地區(qū)，例如甘肅、陜西等省[13,14]。在我國古代著作《嘉祜本草》、《御制本草品匯精要》等中均有記載[15,16]，百里香是一種天然調(diào)味品，常用于烹飪時除腥提鮮，有較高的食用價值。本文利用超高壓提取百里香活性成分，采用響應(yīng)面法對百里香抑菌物質(zhì)的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化；研究百里香提取物對3種常見食品污染菌的抑菌作用；對百里香超高壓提取物進(jìn)行成分分析，為深入研究百里香生物活性功能、西北百里香資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

百里香(Thyme)：產(chǎn)于陜西省吳起縣，低溫烘干，粉碎過60目篩備用。

金黃色葡萄球菌(S.aureus)：編號29213，廣州微生物研究所；大腸桿菌(E.coli)：學(xué)校食品學(xué)院微生物實驗室保藏；單增李斯特菌(L.monocytogenes)：編號1.10753，中科院微生物所；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品：中國生物制品檢定所；百里香酚標(biāo)準(zhǔn)品：綠葉制藥集團(tuán)有限公司；乙醇、苯酚、硫酸、葡萄糖(分析純)：中國醫(yī)藥(集團(tuán))上海化學(xué)試劑公司；胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)、胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)：海博生物技術(shù)有限公司。

HPP.L2B-600/0.6超高壓設(shè)備天津華泰森淼生物工程技術(shù)有限公司；MZKR022-R高速冷凍離心機(jī)德國Hettich公司；RE200B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；CHR-ST冷凍干燥機(jī)德國Christ公司；WGZ-2XJ細(xì)菌濁度分析儀上海昕瑞儀器儀表有限公司；DDBJ-350電導(dǎo)率儀杭州齊威儀器有限公司； TU-1901紫外分光光度計北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；GC9790氣相色譜儀浙江福立分析儀器；LDR0026-07蒸汽發(fā)生器上海華征熱能設(shè)備有限公司；DHP030恒溫培養(yǎng)箱上海實驗儀器有限公司。

1.2　百里香抑菌成分的提取、分析及抑菌作用研究

百里香→粉碎→超高壓提取→離心→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)→真空冷凍→低溫避光保存→抑菌活性試驗。

1.2.1超高壓提取百里香抑菌成分最佳條件的確定

以大腸桿菌(Escherichiacoli)的相對電導(dǎo)率作為百里香提取物質(zhì)抑菌作用大小的指標(biāo)。電導(dǎo)率是衡量溶液離子強(qiáng)度高低的參數(shù)，當(dāng)微生物遇到抑菌劑時細(xì)胞膜會遭到破壞，細(xì)胞膜的滲透性會增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)部的電解質(zhì)會外泄，使電導(dǎo)率上升，因此菌液電導(dǎo)率的變化可以反映細(xì)胞膜通透性的變化[17,18]。參照改進(jìn)Kong等的方法[19]，將對數(shù)期的大腸桿菌在4 ℃，5000 r/min離心15 min，用5%的葡萄糖溶液反復(fù)清洗，直到獲得等滲細(xì)胞，其電導(dǎo)率與5%的葡萄糖溶液相同，將菌體懸浮至OD600=0.4，加入百里香超高壓提取物(5 mg/mL)，測定、計算相對電導(dǎo)率。

式中：L1為加入百里香提取物的等滲細(xì)胞菌懸液初始時電導(dǎo)率；L2為加入百里香提取物的等滲細(xì)胞菌懸液于37 ℃培養(yǎng)3 h的電導(dǎo)率；L0為等滲細(xì)胞菌懸液在沸水中加熱5 min的電導(dǎo)率。

1.2.1.1百里香預(yù)處理

將百里香粉碎過篩(60目)，得百里香粉。準(zhǔn)確稱取百里香粉于聚乙烯袋中，加入乙醇溶液，真空密封，放入超高壓設(shè)備中進(jìn)行提取， 4000 r/min 離心 5 min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，真空冷凍干燥，冷藏備用。

1.2.1.2單因素試驗

研究壓力(100,200,300,400,500 MPa)、料液比[1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60 (g/mL)]、乙醇濃度(50%,60%,70%,80%,90%)、保壓時間(2,4,6,8,10 min)對超高壓百里香抑菌成分提取的影響。

1.2.1.3超高壓提取工藝響應(yīng)面試驗

根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，利用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行3因素3水平試驗，試驗因素和水平表見表1。

表1　響應(yīng)面試驗因素Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.2百里香超高壓提取物抑菌作用研究

1.2.2.1最低抑菌濃度(MIC)的測定

采用試管倍半稀釋法測定最低抑菌濃度[20]。用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基稀釋S.aureus,E.coli，用TSB稀釋L.monocytogenes至菌懸液為1×106cfu/mL。取10支無菌試管，每管各加5 mL液體培養(yǎng)基，在第1支試管內(nèi)加入5 mL用相同培養(yǎng)液溶解的百里香提取物，混勻后吸取5 mL至第2管，以此類推，從第10管吸取5 mL棄去，做空白對照，加入100 μL 菌懸液，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察，菌不生長的最低濃度即對該菌的MIC 值。

1.2.2.2百里香超高壓提取物對3種細(xì)菌生長曲線的影響

將百里香提取物加到S.aureus,L.monocytogenes及E.coli的培養(yǎng)基中，使終濃度為MIC和1/2MIC，120 r/min 37 ℃培養(yǎng)，每2 h取樣測定600 nm處的吸光度值，探討其對細(xì)菌生長曲線的影響。

1.2.2.3百里香超高壓提取物對3種細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)容物泄露的影響

在Cooper等實驗基礎(chǔ)上稍做改動[21]，采用上清液在260 nm測定細(xì)菌胞內(nèi)核酸成分泄露量。用磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH 7.4)懸浮對數(shù)生長期的S.aureus、L.monocytogenes及E.coli細(xì)胞至1×106cfu/mL，將百里香提取物加到菌懸液中，使終濃度為MIC和2MIC，做空白對照，120 r/min，37 ℃培養(yǎng)0～3 h，0.22 μm濾膜過濾，260 nm處測吸光度，以評估細(xì)胞中核酸泄漏量。

1.2.3百里香提取物成分分析

研究發(fā)現(xiàn)，百里香中黃酮、多酚及水、醇提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等細(xì)菌有一定抑制作用[22,23]。本文對在超高壓最優(yōu)條件下得到的百里香提取物進(jìn)行黃酮、多酚等活性物質(zhì)含量分析。

1.2.3.1總黃酮含量檢測

準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、30%的乙醇溶解定容。吸取0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中,加5%的NaNO2溶液0.3 mL還原6 min,10%的Al(NO3)3溶液0.3 mL絡(luò)合6 min,1 mol/L的NaOH溶液4 mL定容顯色15 min，510 nm處測吸光度，得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，將百里香超高壓提取物溶解稀釋后按上述方法檢測黃酮含量。

1.2.3.2總多酚含量檢測

采用福林酚法進(jìn)行測定。精確稱取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，蒸餾水溶解定容制備2 mg/L標(biāo)準(zhǔn)液。吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 mL于50 mL容量瓶中，加FC試劑6.0 mL，搖勻，加10% Na2CO3溶液24.0 mL，定容，30 ℃避光2 h，760 nm處測吸光度，得沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，將百里香超高壓提取物溶解稀釋后按上述方法檢測總多酚含量。

1.2.3.3總多糖含量檢測

采用苯酚-硫酸法測定多糖的含量。準(zhǔn)確稱取制備100 mg/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，吸取0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中，補(bǔ)水至2 mL，加入6%苯酚溶液1.0 mL，迅速滴加5.0 mL濃硫酸搖勻，顯色冷卻，490 nm處測吸光度得標(biāo)準(zhǔn)曲線，將百里香超高壓提取物溶解稀釋后按上述方法檢測總多糖含量。

1.2.3.4百里香酚含量檢測

精密稱取百里香酚0.010 g，乙醇溶解稀釋成20,40,60,80,100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。GC條件:色譜柱:石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm)；檢測器：300 ℃；進(jìn)樣器:230 ℃；輔助I：230 ℃;柱溫箱:70 ℃，以25 ℃/min升溫至130 ℃保持5 min，再以4 ℃/min升溫至155 ℃保持2 min，最后以35 ℃/min升溫至270 ℃保持3 min，得百里香酚的線性方程，將百里香超高壓提取物稀釋后用0.45 μm超濾膜過濾，氣相色譜檢測百里香酚含量。

2　結(jié)果與分析

2.1　超高壓單因素試驗結(jié)果

2.1.1壓力對百里香抑菌成分超高壓提取的影響

圖1　壓力對百里香抑菌物質(zhì)提取的影響Fig.1 Effects of pressure on the extraction of thyme antibacterial substances

由圖1可知，隨著壓力的升高，相對電導(dǎo)率呈現(xiàn)“增加-下降”的變化趨勢，確定百里香最適提取壓力為400 MPa。壓力越大，溶劑越容易滲透進(jìn)細(xì)胞，越有助于抑菌物質(zhì)的提取，但壓力過大可能會使抑菌成分受到破壞，引起抑菌作用下降。

2.1.2料液比對百里香抑菌成分超高壓提取的影響

圖2　料液比對百里香抑菌物質(zhì)提取的影響Fig.2 Effects of solid to liquid ratio on the extraction of thyme antibacterial substances

由圖2可知，隨著乙醇用量的增大，相對電導(dǎo)率出現(xiàn)先增后降的趨勢，因此確定1∶40為百里香抑菌物質(zhì)的最適提取料液比。

2.1.3乙醇濃度對百里香抑菌成分超高壓提取的影響

圖3　乙醇濃度對百里香抑菌物質(zhì)提取的影響Fig.3 Effects of ethanol concentration on the extraction of thyme antibacterial substances

由圖3可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，相對電導(dǎo)率先增加后減小，因此確定80%為百里香抑菌物質(zhì)的最適提取乙醇濃度。

2.1.4保壓時間對百里香抑菌成分超高壓提取的影響

圖4　保壓時間對百里香抑菌物質(zhì)提取的影響Fig.4 Effects of holding time on the extraction of thyme antibacterial substances

由圖4可知，隨著時間的延長，相對電導(dǎo)率先緩慢增加后趨于平穩(wěn)并略有下降，由于在4 min和6 min處相對電導(dǎo)率無顯著差異(P>0.05)，表明保壓時間對提取影響較小，所以在響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計中不再考慮保壓時間。

2.2　響應(yīng)面優(yōu)化試驗與結(jié)果

2.2.1響應(yīng)面結(jié)果與分析

響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2　響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 The experimental design and results of response surface methodology

2.2.2回歸模型的建立與顯著性分析

采用Design-Expert V8.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到模擬方程為：Y=15.60-0.65A+0.23B+0.062C-1.58A2-0.44B2-0.068C2-0.21AB+0.042AC-0.11BC，該方程拋物面開口向下，具有極大值點。對該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3　回歸模型方差分析Table 3 Regression model variance analysis

注：*，P<0.05，表示差異顯著；**，P<0.01，表示差異極顯著。

由表3可知，該模型的P<0.0001，說明二次多項回歸模型為極顯著。失擬項P值為0.0614，不顯著(P>0.05)，說明該模型與實際情況擬合較好。該模型R2=0.9915，說明該回歸方程代表性較好；模型校正相關(guān)系數(shù)為RAdj2=0.9807，較好；變異系數(shù)為0.88%，說明試驗結(jié)果重復(fù)性較好；模型精密度為25.235，說明該模型是可行的[24]。由表3中F值的大小可判斷各因素對提取影響的強(qiáng)弱，F(xiàn)值越大，影響作用越強(qiáng)[25]。各個因素影響程度次序為：A(壓力)>B(乙醇濃度)>C(料液比)。其中A和B對包埋效率的影響顯著(P<0.05)。

由于C(料液比)對相對電導(dǎo)率無顯著影響，固定料液比1∶40，可得A(壓力)和B(乙醇濃度)對百里香抑菌物質(zhì)提取影響的等高線和響應(yīng)面圖，見圖5。

圖5　壓力和乙醇濃度對百里香抑菌物質(zhì)提取的影響Fig.5 Effects of ethanol concentration and ultra high pressure on the extraction of the extracts from thyme

等高線能直觀反映兩因素交互作用的顯著程度。由圖5可知，響應(yīng)面開口向下，有最大值。當(dāng)料液比為0水平時，固定乙醇濃度不變時，相對電導(dǎo)率隨超高壓的壓力增加出現(xiàn)先增后降；當(dāng)固定壓力不變時，相對電導(dǎo)率隨乙醇濃度的增加出現(xiàn)先增后降的趨勢，但前者曲面坡度陡峭明顯大于后者，這與表3分析結(jié)果吻合。

2.3　驗證試驗

軟件分析得到百里香抑菌物質(zhì)最佳提取工藝為：壓力377.9 MPa，乙醇濃度82.87%，料液比1∶41.63，相對電導(dǎo)率最大為15.7128%。考慮到實際操作，確定提取條件為：壓力380 MPa，乙醇濃度83%，料液比1∶42，在此條件下，相對電導(dǎo)率最大為15.69%±0.21%。

2.4　百里香提取物抑菌試驗結(jié)果

2.4.1百里香超高壓提取物對3種細(xì)菌的最低抑菌濃度(MIC)

表4　百里香提取物抗菌活性Table 4 Antibacterial activities of the extracts from thyme

注：“+”表示長菌；“-”表示無菌生長。

由表4可知，百里香提取物對S.aureus，L.monocytogenes及E.coli3種細(xì)菌均有抑制作用，其中對S.aureus的抑制作用最強(qiáng)，其次是L.monocytogenes，對E.coli抑菌效果最小，可能百里香提取物對革蘭氏陽性菌的抑制作用要強(qiáng)于革蘭氏陰性菌，這和樊明濤等的研究結(jié)果相同。對S.aureus，L.monocytogenes及E.coli菌的最低抑菌濃度為0.188,0.375,3 mg/mL。

2.4.2百里香超高壓提取物對3種細(xì)菌生長曲線的影響

圖6　金黃色葡萄球菌生長曲線Fig.6 Growth curve of S.aureus

圖7　單增李斯特菌生長曲線Fig.7 Growth curve of L.monocytogenes

圖8　大腸桿菌生長曲線Fig.8 Growth curve of E.coli

由圖6可知,經(jīng)過百里香提取物作用，S.aureus，L.monocytogenes及E.coli菌的生長曲線均產(chǎn)生明顯變化，且隨著百里香超高壓提取物濃度的增加，生長曲線的變化也越大。在12 h內(nèi)，對照組的細(xì)菌繁殖較快，菌體數(shù)量不斷增加，當(dāng)菌液中含有1/2MIC百里香提取物時，遲滯期延長，尤其是S.aureus和L.monocytogenes菌生長明顯緩慢，增長的細(xì)菌數(shù)始終低于對照組；而當(dāng)菌液中百里香提取物濃度為MIC時，菌液OD值基本未增加，這表明百里香超高壓提取物對3種細(xì)菌的生長具有明顯的抑制作用。

2.4.3百里香提取物對3種細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)容物泄露的影響

Chen 和Cooper的研究表明：260 nm 吸光物的釋放與抑菌劑的殺菌活性有關(guān)。百里香超高壓提取物對S.aureus，L.monocytogenes及E.coli菌作用后的菌懸液隨時間的變化情況(A260)見圖9～圖11。

圖9　百里香提取物對金黃色葡萄球菌紫外吸光度變化的影響Fig.9 Effects of extracts from thyme on the UV absorption of S.aureus

圖10　百里香提取物對大腸桿菌紫外吸光度變化的影響Fig.10 Effects of extracts from thyme on the UV absorption of E.coli

圖11　百里香提取物對單增李斯特菌紫外吸光度變化的影響Fig.11 Effects of extracts from thyme on the UV absorption of L.monocytogenes

試驗結(jié)果顯示：菌懸液的紫外吸收值隨著百里香提取物濃度的增加而增加，這說明百里香超高壓提取物的濃度越高，對細(xì)菌細(xì)胞膜的完整性破壞越嚴(yán)重。由于革蘭氏陽性菌的S.aureus，L.monocytogenes沒有細(xì)菌外膜[26]，和革蘭氏陰性菌E.coli的試驗結(jié)果不同，陽性菌變化更快，S.aureus菌懸液的A260在1 h內(nèi)快速增長達(dá)到平穩(wěn)期(見圖9)，其次是L.monocytogenes，其A260在1.5 h內(nèi)快速增長達(dá)到平穩(wěn)期(見圖10)；而大腸桿菌A260在1～2 h 才有明顯的增長(見圖11)。

2.5　百里香提取物成分檢測

圖12　蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.12 The standard work curve of rutin

圖13　沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.13 The standard work curve of gallic acid

圖14　葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.14 The standard work curve of glucose

圖15　40 μg/L百里香酚氣相食色譜標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.15 The gas chromatography of 40 μg/L thymol

制備得到的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖12)為：Y=0.0108X-0.005(R2=0.9969)；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖13)為：Y=0.1122X-0.022(R2=0.9971)；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖14)為：Y=0.0199X-0.0249(R2=0.9978)；百里香酚(GC)標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖15)為：Y=12519X-14535(R2=0.9993)，均具有良好的線性關(guān)系。檢測結(jié)果表明每1 g百里香超高壓提取物中含黃酮0.189 mg、多酚0.162 mg、多糖0.085 mg、百里香酚0.134 mg。

3　結(jié)論

響應(yīng)面試驗優(yōu)化確定百里香最佳提取條件為：壓力380 MPa，乙醇濃度83%，料液比1∶42，在此條件下，相對電導(dǎo)率最大為15.69%±0.21%；百里香提取物對S.aureus，L.monocytogenes及E.coli菌的最低抑菌濃度(MIC)為0.188,0.375,3 mg/mL；百里香提取物處理后的細(xì)菌生長曲線變化很大，菌體數(shù)量：對照組>1/2MIC組>MIC組；百里香提取物處理后的細(xì)菌細(xì)胞膜通透性增加，A260核酸泄露量明顯增加，表明百里香提取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及單增李斯特菌生長均具有一定抑制作用。檢測發(fā)現(xiàn)每1 g百里香超高壓提取物中含黃酮0.189 mg、多酚0.162 mg、多糖0.085 mg、百里香酚0.134 mg，由于百里香提取物具有良好抑菌活性，下一步將對百里香提取物的活性成分進(jìn)行分離純化，研究純品對細(xì)菌的抑制活性和機(jī)理，更好地對百里香資源進(jìn)行開發(fā)利用。

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