山河陳醋大曲淀粉酶系分析

李中正，曹彥軍，呂玉柱， 郝林*

(1.山西農業(yè)大學 食品科學與工程學院，山西 太谷　030801；2.山河醋業(yè)有限公司，山西 和順　032700)

大曲是山西陳醋生產中的重要糖化發(fā)酵劑，大曲質量的優(yōu)劣直接影響到陳醋的出醋率和質量，大曲中各種淀粉酶含量及活力是大曲質量優(yōu)劣的一個方面，檢測分析大曲中各種淀粉酶含量及活力，對于保證陳醋正常生產及品質具有非常重要的意義。

淀粉酶是水解淀粉和糖原酶類的總稱,是一類用途十分廣泛的酶,在食品工業(yè)、紡織工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)都經常使用。淀粉酶主要可以分為四大類[1]：α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶[2]和淀粉脫支酶。

目前，對于大曲淀粉酶系的研究大多數集中在α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶(糖化酶)，而對淀粉脫支酶的研究報道很少。增加對大曲中淀粉脫支酶的研究，對全面分析評價大曲中淀粉酶系的性能和質量十分重要。

淀粉脫支酶又稱異淀粉酶[3]，它可以水解糖原、支鏈淀粉和β-極限糊精中α-1，6糖苷鍵，對α-極限糊精具有部分水解作用，淀粉脫支酶在淀粉加工工業(yè)中具有重要的應用價值，以葡萄糖的生產為例，單獨使用糖化酶，底物濃度34%時，葡萄糖值最大為95.5%，若要進一步提高葡萄糖值，需要降低底物濃度；而利用脫支酶與糖化酶協同作用，在相同底物濃度下，葡萄糖值可以達到97.0%，原料利用率提高0.3%～0.5%，并且反應時間縮短15%，糖化酶用量減少15%，每年可節(jié)省淀粉原料3萬余噸[4]。

醋廠的原料淀粉先要經過液化，再用糖化酶進行糖化。糖化酶對α-1，6葡萄糖苷鍵水解速率較低，為了提高對淀粉分支鍵的水解效率，往往需要添加過量的糖化酶。糖化酶添加過多時，可以催化葡萄糖發(fā)生聚合反應，生成異麥芽糖，導致最終葡萄糖產量下降。當在糖化過程中加入淀粉脫支酶時，淀粉脫支酶能與糖化酶協同作用，可以快速地切割α-1，6葡萄糖苷鍵，減少糖化酶的用量，減少副反應的發(fā)生；提高淀粉的利用率，縮短糖化時間，提高生產效率。

本研究對山河陳醋大曲及大曲中分離出的糖化菌株進行淀粉酶系的分析研究，為下一步大曲的強化奠定基礎。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

大曲:取自山河醋業(yè)有限公司制曲廠房；菌種：分離自山河陳醋大曲。

3，5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、苯酚、無水亞硫酸鈉、氫氧化鈉、可溶性淀粉、蠟質玉米淀粉(支鏈淀粉)、醋酸鈉、冰醋酸、檸檬酸、檸檬酸鈉、碘、碘化鉀(均為分析純)：天津歐博凱化工有限公司。

1.2　儀器與設備

FW80微型高速萬能試樣粉碎機天津市泰斯特儀器有限公司；UV-2450紫外可見分光光度計上海光譜儀器有限公司；KLO4A離心機湖南凱達科學儀器有限公司；雙列六孔恒溫振蕩水浴鍋上海樹立儀器儀表有限公司。

1.3　方法

1.3.1α-淀粉酶、β-淀粉酶活力的測定

采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法測定[5,6]。

1.3.2葡萄糖淀粉酶(糖化酶)活力的測定

采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)比色定糖法測定[7,8]。

1.3.3淀粉脫支酶(異淀粉酶)活力的測定

1.3.3.1酶活測定原理

由于線性葡聚糖與碘的結合能力比分支葡聚糖(支鏈淀粉)要強很多，淀粉脫支過程中與碘的結合增強，從而顯示更強的藍色[9-11]。

1.3.3.2測定步驟

吸取0.5 mL經過適當稀釋的粗酶液，加入到含有3 mL 0.833%支鏈淀粉底物的18 mm×18 cm 試管中，50 ℃孵育30 min。30 min后取出0.5 mL反應液加入到含有0.5 mL碘液的試管中。然后迅速加入15 mL稀硫酸溶液，混勻。室溫放置10 min，然后在610 nm下測定吸光度[12]。

2　結果與分析

2.1　α-淀粉酶活力的測定結果

山河陳醋大曲和12株菌株的α-淀粉酶活力測定結果，見圖1。

圖1　山河大曲和12種不同菌制成的麩曲的α-淀粉酶活力Fig.1 Activity of α-amylase from Shanhe Daqu and twelve different Fuqu

由圖1可知，各菌株酶活力在0.303～6.238 U/g，M4，M17酶活力較高，均達到了5 U/g以上，X5在細菌中的酶活力最高，為4.006 U/g，X17的酶活力最低，其他幾株的酶活力相差在3 U/g以內，山河大曲的α-淀粉酶活力只有1.540 U/g，添加優(yōu)勢菌株麩曲強化山河大曲[13]，可以提高山河大曲的α-淀粉酶活力。

2.2　β-淀粉酶活力的測定結果

山河大曲和12株菌株的β-淀粉酶活力測定結果，見圖2。

圖2　山河大曲和12種不同菌制成的麩曲的β-淀粉酶活力Fig.2 Activity of β-amylase from Shanhe Daqu and twelve different Fuqu

由圖2可知，各菌株的酶活力在15.973～234.664 U/g，差異較大，細菌的酶活力普遍不高，均在50 U/g之下，M13的活力最高，為234.664 U/g，另外，大曲的酶活力為215.622 U/g，和M13的酶活力差異很小，不需要專門強化。

2.3　葡萄糖淀粉酶活力的測定結果

山河大曲和12株菌株的葡萄糖淀粉酶活力的測定結果，見圖3。

圖3　山河大曲和12種不同菌制成的麩曲的葡萄糖淀粉酶活力Fig.3 Activity of glucose amylase from Shanhe Daqu and twelve different Fuqu

由圖3可知，各菌株的酶活力在384.970～1204.368 U/g，M17，M4，M13的菌株酶活力較高，M13的酶活力最高，為1204.368 U/g，酶活力在800 U/g及以上的菌株有5株，山河大曲的酶活力為816.815 U/g，和M13菌株的酶活力有一定差距，可以添加M13麩曲強化山河大曲，適當提高葡萄糖淀粉酶活力。

2.4　淀粉脫支酶的測定結果

山河大曲和12株菌株的淀粉脫支酶的測定結果，見圖4。

圖4　山河大曲和12種不同菌制成的麩曲的淀粉脫支酶活力Fig.4 Activity of debranching enzyme from Shanhe Daqu and twelve different Fuqu

由圖4可知，酶活力在0.031～0.101 U/g，差異不大且普遍很低，在0.07 U/g左右的有5株菌株，M13酶活力最高，為 0.101 U/g。

將以上所有菌株及大曲各自的4種酶活力歸納成表1。

表1　淀粉酶系活力測定結果Table 1 Results of amylase activity determination

續(xù)　表

由表1可知，山河大曲的α-淀粉酶活力為1.540 U/g，β-淀粉酶活力為215.622 U/g，葡萄糖淀粉酶活力為816.815 U/g，淀粉脫支酶活力為0.073 U/g。其中山河大曲的α-淀粉酶活力和淀粉脫支酶活力明顯不高，這會導致原料淀粉糖化不充分，糖化速度慢，可發(fā)酵性糖的轉化率低，最終造成生產出醋率低，生產效益差的結果。針對山河大曲淀粉酶系的不足，可以選用本研究中綜合表現優(yōu)秀的M4和M13菌株制成麩曲，強化山河大曲，以達到提高生產出醋率，提高生產效益的目的。

3　結論

山河大曲中淀粉脫支酶的酶活力M13最高，為0.101 U/g，國內對淀粉脫支酶的報道也有一些。其中，王武等[14]首先在1993年篩選得到1株產異淀粉酶的短桿菌BI25164，經發(fā)酵優(yōu)化酶活力達到0.520 U/g，段緒果等在2013年通過PCR克隆得到異淀粉酶編碼基因，構建得到產重組異淀粉酶的大腸桿菌，酶活力達到0.879 U/g。在后續(xù)的研究中，可以采用基因的重組表達和分子改造的方法[15]，提高淀粉脫支酶的酶活力，以期達到更加理想的效果。

淀粉酶系活力是大曲的重要指標，也是衡量大曲質量的指標，在山河醋業(yè)原有的陳醋生產工藝基礎上，添加適量的由M4和M13菌株制成的麩曲，強化原有大曲進行陳醋生產，可以在最大限度保持山河陳醋原有感官質量的基礎上，提高原料出品率，對提高醋廠的經濟效益有重要意義。

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