白細(xì)胞介素-6快速定量熒光免疫層析試紙條的制備及特性研究

張文琪，何小維△，李　凱，劉曉云，李文美

(1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣州 510000；2.廣州萬(wàn)孚生物技術(shù)股份有限公司，廣州 510000；3.南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué)學(xué)院，廣州 510000)

白細(xì)胞介素(IL)-6在人體健康中扮演著重要的角色。通常情況下，血漿中的IL-6會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)其水平逐漸降低，當(dāng)成長(zhǎng)為健康成年人時(shí)血漿中IL-6水平將低于10.00 pg/mL[1]。雖然人在健康的情況下IL-6在血清中水平很低，但是在某些疾病狀態(tài)下血液中IL-6的水平異常升高，如在炎性反應(yīng)的早期階段[2]，IL-6的水平可以增加到10 000倍，因此，IL-6是一項(xiàng)有用的促炎細(xì)胞因子標(biāo)記物。目前發(fā)現(xiàn)，IL-6已與多種疾病相關(guān)，例如已發(fā)現(xiàn)佩吉特病和多發(fā)性骨髓瘤患者與IL-6水平的升高有良好的線性關(guān)系[3]。冠心病作為炎性反應(yīng)疾病中的一種，已有研究表明，動(dòng)脈粥樣硬化的各個(gè)階段都有慢性炎性反應(yīng)的參與[4-5]。IL-6的急劇升高會(huì)引起急性炎性反應(yīng)[6]，也與損傷、感染、壓力、腦死亡和其他情況相關(guān)[7-9]。因此，監(jiān)控人體內(nèi)的IL-6水平具有重要意義。

目前，IL-6比較經(jīng)典的檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)[10]、化學(xué)發(fā)光法[11]、免疫膠體金法[12]。LUO等[11]研究了運(yùn)用化學(xué)發(fā)光免疫方法檢測(cè)人源IL-6，該方法檢測(cè)IL-6的范圍為4.00～625.00 pg/mL，最低檢出限為0.50 pg/mL。IDA等[12]用傳統(tǒng)的ELISA對(duì)人的IL-6檢測(cè)方法進(jìn)行了研究，檢測(cè)限可達(dá)9.50 pg/mL，但是檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，需要4.5 h。MAN等[13]將膠體金作為標(biāo)志物并運(yùn)用免疫層析的技術(shù)檢測(cè)IL-6和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，直接觀察結(jié)果無(wú)需儀器讀取，肉眼可見(jiàn)IL-6的最低檢測(cè)限為62.50 ng/mL。熒光膠乳免疫層析技術(shù)與免疫放射方法相比，操作安全無(wú)污染、無(wú)需專(zhuān)業(yè)操作員操作；與化學(xué)發(fā)光法、ELISA相比，設(shè)備價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)便等；與免疫膠體金方法相比，本試驗(yàn)制備的靈敏度更高的試劑盒進(jìn)行定量操作，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑人重組IL-6蛋白(美國(guó)Fitzgerald公司)；IL-6抗體A1、IL-6抗體A2、膠乳封閉液、膠乳保存液、噴墊工作液、樣本稀釋(廣州萬(wàn)孚生物技術(shù)有限公司)；IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-8、TNF-α、干擾素γ(英國(guó)Abcam公司)；小牛血清(美國(guó)Sigma公司)；熒光微球(美國(guó)Bangslab公司)；玻璃纖維素膜、硝酸纖維素膜(美國(guó)Millipore公司)。噴膜機(jī)(Iso Flow型，美國(guó)Biodot公司)；噴墊機(jī)(HGS510，杭州峰航科技有限公司)；切條機(jī)(HGS201，杭州峰航科技有限公司)；熒光定量檢測(cè)儀(飛測(cè)Ⅱ，廣州萬(wàn)孚生物技術(shù)股份有限公司)；超純水機(jī)(Milli-Q，美國(guó)Millipore公司)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DGG-9123A型，上海森信試驗(yàn)儀器有限公司)。

1.2試驗(yàn)原理本試驗(yàn)采用雙抗夾心法定量檢測(cè)血清中IL-6水平。將待測(cè)血清和樣本稀釋液按照一定比例混合后加入加樣孔中，血清中的IL-6抗原會(huì)和樣品墊上的熒光標(biāo)記IL-6抗體結(jié)合形成復(fù)合物，并通過(guò)層析作用逐漸在硝酸纖維素膜(NC膜)上移動(dòng)到固定在NC膜上檢測(cè)區(qū)(T線)的包被IL-6抗體結(jié)合，質(zhì)控區(qū)(C線)的抗體也會(huì)和熒光膠乳中的物質(zhì)結(jié)合。當(dāng)檢測(cè)卡插入熒光檢測(cè)儀后，儀器會(huì)自動(dòng)讀取檢測(cè)卡上T線和C線的熒光信號(hào)強(qiáng)度，通過(guò)T/C熒光信號(hào)強(qiáng)度則可計(jì)算出待測(cè)血清中IL-6的水平。

1.3方法

1.3.1試劑卡制備將IL-6抗體和羊抗兔IgG噴于包被膜的T線和C線上，兩帶間隔4 mm，置于50 ℃的干燥箱中干燥48 h。將制備的免疫熒光膠乳和標(biāo)記熒光微球的兔IgG工作液稀釋后用噴墊機(jī)進(jìn)行噴墊，置于的50 ℃烘箱中干燥24 h，密封保存。用切條機(jī)得到寬度為4 mm的試紙條，將試紙條裝入特定的塑料檢測(cè)卡中，用壓卡機(jī)壓緊檢測(cè)卡上下蓋，后置于干燥房待用。

1.3.2樣本檢測(cè)檢測(cè)在室溫下進(jìn)行，取75 μL血清樣本，與100 μL實(shí)驗(yàn)室研制的樣本稀釋液充分混勻1 min，取75 μL的混合液加入試劑卡中，層析反應(yīng)15 min后將檢測(cè)卡插入熒光定量檢測(cè)儀中，讀取熒光信號(hào)T、C值，計(jì)算出相應(yīng)的T/C，T/C越高則樣本中IL-6水平越高。

1.3.3熒光免疫層析試紙條性能評(píng)價(jià)

1.3.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立取8個(gè)配制的標(biāo)準(zhǔn)品水平點(diǎn)，平行測(cè)定10次，檢測(cè)低、中、高水平的標(biāo)準(zhǔn)品在試紙卡的熒光信號(hào)T/C。標(biāo)準(zhǔn)品水平的對(duì)數(shù)值為變量，對(duì)應(yīng)檢測(cè)的熒光信號(hào)T/C為因變量，構(gòu)建擬合計(jì)算方程式，并繪制確定最終的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3.2靈敏度試驗(yàn)對(duì)確定的20份陰性血清樣本進(jìn)行測(cè)試，重復(fù)測(cè)定6次。檢測(cè)限(LOD)等于標(biāo)準(zhǔn)曲反求值的平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差。定量限(LOQ)等于標(biāo)準(zhǔn)曲線反求水平的平均值加上10倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.3.3.3添加回收試驗(yàn)配制IL-6水平分別為10.00、500.00、1 000.00 pg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品，重復(fù)檢測(cè)6次。根據(jù)測(cè)得的熒光定量信號(hào)T/C，標(biāo)準(zhǔn)曲線反求出待測(cè)樣本的水平。添加回收率越接近100.00%則表示檢測(cè)方法越準(zhǔn)確。

1.3.3.4精密度試驗(yàn)本試驗(yàn)用同一批試紙條檢測(cè)批內(nèi)的精密度，再選用3種不同批次的試紙條進(jìn)行不同批次間的批間精密度試驗(yàn)，每個(gè)水平點(diǎn)重復(fù)測(cè)定10次。計(jì)算出每個(gè)水平點(diǎn)的平均變異系數(shù)(CV)值，對(duì)批次內(nèi)的精密度和批間內(nèi)的精密度進(jìn)行分析。

1.3.3.5特異性試驗(yàn)本試驗(yàn)將一定量的IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-8、TNF-α、干擾素γ添加到陰性小牛血清中，分別配制成水平為10 000.00 pg/mL的競(jìng)爭(zhēng)物標(biāo)準(zhǔn)溶液，重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算出每個(gè)競(jìng)爭(zhēng)物的交叉反應(yīng)率。交叉反應(yīng)率(%)=(S/Z)×100% (S表示抗原類(lèi)似物用試劑卡測(cè)定的水平，Z表示抗原類(lèi)似物添加的水平)。

1.3.3.6穩(wěn)定性試驗(yàn)將試劑卡在50 ℃烘箱中分別放置7、14、21、30 d后取出放入干燥房?jī)?nèi)，與干燥房?jī)?nèi)常溫放置的試劑卡進(jìn)行對(duì)比，如穩(wěn)定性不變則相當(dāng)于試劑卡可以常溫保存1年，樣本稀釋液使用4 ℃保存，檢測(cè)試劑卡的穩(wěn)定性。

1.3.3.7臨床樣本檢測(cè)取廣州中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院嶺南醫(yī)院、廣東省第二人民醫(yī)院日常檢測(cè)臨床樣本,選取臨床樣本共計(jì)100例，患者的血清用的是SIEMENSIMMULITE1000儀器檢測(cè)。在實(shí)驗(yàn)室用研制的同批次IL-6熒光定量免疫層析試劑卡進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)其檢測(cè)值進(jìn)行線性回歸分析。

2　結(jié)　　果

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立用制備的標(biāo)準(zhǔn)品0.00、20.00、44.00、85.00、161.00、385.00、500.00、842.00 pg/mL按1.3.3.4中的步驟加入試劑卡中，每個(gè)水平點(diǎn)平行測(cè)定10次。用熒光定量檢測(cè)儀測(cè)定每張?jiān)噭┛ǖ臒晒庑盘?hào)T/C，用標(biāo)準(zhǔn)品水平的對(duì)數(shù)值作為X軸，對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)平均T/C作為Y軸。其中標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=0.731+1.246X-1.561X2+0.564X3，r2=0.965，線性關(guān)系良好。

2.2靈敏度試驗(yàn)結(jié)果對(duì)20份確定的陰性血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)曲線反求檢測(cè)結(jié)果的平均值為1.30 pg/mL，標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.40，因此，LOD值為8.49 pg/mL，大于則判定為陽(yáng)性，低于則判為陰性。LOQ值為25.28 pg/mL。因此，本試驗(yàn)研究試劑盒的檢測(cè)范圍為8.49～848.00 pg/mL。

2.3添加回收試驗(yàn)結(jié)果本試驗(yàn)用添加回收試驗(yàn)測(cè)定IL-6熒光定量試劑卡的檢測(cè)準(zhǔn)確性，當(dāng)回收率越接近100.00%，說(shuō)明此試劑卡檢測(cè)越準(zhǔn)確。在10.00、500.00、1 000.00 pg/mL水平點(diǎn)包含低、中、高的水平范圍內(nèi)進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，在10.00 pg/mL的回收率平均值為96.51%，CV為9.60%；在500.00 pg/mL的回收率平均值為102.46%，CV為8.57%；在1 000.00 pg/mL的回收率平均值為103.06%，CV為2.59%。

2.4精密度試驗(yàn)結(jié)果批內(nèi)精密度結(jié)果見(jiàn)表1，批內(nèi)各水平點(diǎn)T/C的CV范圍為4.07%～7.72%。3批次混合后測(cè)得的批間精密度結(jié)果見(jiàn)表2，批間各水平點(diǎn)T/C的CV為3.86%～6.70%。同一批次的批內(nèi)和3個(gè)批次的批間的CV均小于15.00%。

表1　　批內(nèi)精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=10)

表2　　批間精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=10)

2.5特異性試驗(yàn)結(jié)果IL-6熒光定量免疫層析試劑盒對(duì)待測(cè)水平為10.00 pg/mL的競(jìng)爭(zhēng)物IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-8、TNF-α、干擾素γ進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明競(jìng)爭(zhēng)物IL-4、TNF-α、干擾素γ在試驗(yàn)中并未檢測(cè)到；IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-8的交叉反應(yīng)率均小于0.10%。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果熒光定量免疫層析試劑卡的穩(wěn)定性見(jiàn)圖1，試劑卡放在50 ℃烘箱中加速破壞1、2、3、4周在標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)試的情況下的反應(yīng)曲線與常溫保存的試劑卡基本吻合，低、中、高水平的熒光信號(hào)T/C基本沒(méi)變化。

圖1　　IL-6熒光定量免疫層析試劑卡穩(wěn)定性

2.7臨床樣本檢測(cè)結(jié)果將100份血清臨床樣本分別在SIEMENS IMMULITE1000 IL-6試劑盒與研制的IL-6熒光定量免疫層析試劑盒中進(jìn)行測(cè)定，見(jiàn)圖2。其中相關(guān)方程為Y=0.657X-10.048，r2=0.965，Y表示SIEMENS IMMULITE1000 IL-6試劑盒測(cè)定的臨床水平值，X表示IL-6熒光定量免疫層析試劑盒測(cè)定的臨床水平值，回歸方程中r2=0.965，實(shí)驗(yàn)室研制IL-6試劑盒與化學(xué)發(fā)光試劑盒的r2>0.950 0。

圖2　　　　　IL-6熒光定量免疫層析法與

3　討　　論

目前在市面還沒(méi)有相應(yīng)的IL-6熒光定量免疫層析試劑盒的開(kāi)發(fā)，因此，研究IL-6熒光定量免疫層析試劑盒具有重要意義。目前通常市場(chǎng)上檢測(cè)IL-6的常用檢測(cè)方法儀器成本較高，耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)、操作麻煩。因此，可以進(jìn)一步建立用于商業(yè)用途的IL-6熒光定量免疫層析試劑盒。

本試驗(yàn)研制的IL-6熒光定量免疫層析試劑卡的定量反應(yīng)曲線線性與化學(xué)發(fā)光法相關(guān)性良好，r2=0.965，說(shuō)明標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系、精密度良好，LOD為8.49 pg/mL，LOQ為25.28 pg/mL，對(duì)10.00、500.00、1 000.00 pg/mL水平進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，測(cè)得其回收率平均值分別為96.51%、102.46%，103.06%，批內(nèi)以及批間的精密度均小于15.00%，試紙條和7種競(jìng)爭(zhēng)物沒(méi)有交叉反應(yīng)，說(shuō)明準(zhǔn)確性、特異性均良好，試紙條的穩(wěn)定性良好。試劑卡放在50 ℃烘箱中加速破壞1、2、3、4周在標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)試的情況下的反應(yīng)曲線與常溫保存的試劑卡基本吻合，低、中、高水平的熒光信號(hào)T/C基本沒(méi)變化。說(shuō)明熒光定量免疫層析試劑卡經(jīng)加速破壞測(cè)試后，穩(wěn)定性良好，可以常溫放置1年。

因此，本試驗(yàn)研制的IL-6熒光免疫層析試劑盒可以快速、定量地檢測(cè)血清中的IL-6水平，然而目前該方法仍處于研究階段，還需要進(jìn)一步的研究實(shí)現(xiàn)商業(yè)化。

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