新生豬源沙門氏菌耐藥性及耐藥基因的研究

沈陽(yáng)工學(xué)院生命工程學(xué)院 113122

1 材料與方法

（1）材料。菌株來(lái)源：2017年6月～2017年10月抽取某養(yǎng)殖場(chǎng)150份新生豬豬肉樣品；藥敏質(zhì)控菌沙門氏菌C79-13及陽(yáng)性對(duì)照菌株。試劑：PCR試劑（北京百泰生物技術(shù)有限公司），實(shí)驗(yàn)所需引物系自主合成，藥敏紙片（北京蘭博瑞生物技術(shù)有限公司），具體包含慶大霉素、復(fù)方新諾明、鏈霉素、環(huán)丙沙星、氯霉素、壯觀霉素、四環(huán)素、諾氟沙星、阿米卡星以及萘啶酸共10種。儀器：DYY-70型號(hào)電泳儀、TGL-16G臺(tái)式離心機(jī)、DHP-9048型號(hào)恒溫培養(yǎng)箱等。

（2）方法。將采集的150份新生豬豬肉樣本逐一置于滅菌袋內(nèi)，加入培養(yǎng)基共同保存。新生豬豬肉樣本保存時(shí)間不得超出12小時(shí)。

細(xì)菌分離方法。將樣本置于含BPW培養(yǎng)液的無(wú)菌密封袋內(nèi)保存，于37℃條件下?lián)u床過(guò)夜。第二天，吸取1mL BPW前增菌液至改良肉湯半固體培養(yǎng)基表面，置于42℃恒溫箱內(nèi)持續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)后從培養(yǎng)基中挑取白色可疑菌落，采用三區(qū)劃線法進(jìn)行處理，于37℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。采用PCR鑒定法鑒定疑似沙門氏菌，以Stn的核苷酸序列設(shè)引物。PCR反應(yīng)條件為：94℃5min預(yù)變性處理，保持溫度不變，預(yù)變性45s后轉(zhuǎn)為55℃條件，持續(xù)退火45s；調(diào)整至72℃延伸30s，經(jīng)過(guò)30個(gè)循環(huán)。最后于72℃條件下持續(xù)延伸10min。電泳方法選用瓊脂糖凝膠，電泳后回收DNA膠，所得產(chǎn)物用于DNA測(cè)序。標(biāo)本血清型鑒定選用玻片凝集法，新生豬源沙門氏菌的藥敏試驗(yàn)采用K-B法進(jìn)行。

2 結(jié)果

（1）新生豬源沙門氏菌鑒定結(jié)果。本組150份新生豬豬肉樣本經(jīng)改良肉湯半固體培養(yǎng)基、XL74培養(yǎng)基兩輪篩選后，分離出24株可疑沙門氏菌（表面可見黑色中心，而且周圍可見透明暈環(huán)菌落）。經(jīng)PCR鑒定（Stn基因）及電泳產(chǎn)物回收測(cè)序后，確定21株沙門氏菌。新生豬源沙門氏菌的分離率為14.00%。

（2）新生豬源沙門氏菌的血清型鑒定結(jié)果。21株新生豬源沙門氏菌中，共鑒定出6種血清型，其中腸炎沙門氏菌分離率最高，占比25.14%，其他優(yōu)勢(shì)血清型包含徳爾卑血清型（21.25%）和里森沙門菌（13.62%）。

（3）新生豬源沙門氏菌的耐藥性。21株新生豬源沙門氏菌的10種抗生素藥敏分析結(jié)果顯示，分離菌對(duì)10種抗菌藥物的耐藥性各不相同：新生豬源沙門氏菌對(duì)氯霉素（72.45%）、慶大霉素（68.26%）和壯觀霉素（65.28%）的敏感性較高，而對(duì)環(huán)丙沙星（98.75%）、鏈霉素（94.23%）和阿米卡星（87.69%）表現(xiàn)為高耐藥。其中，3株新生豬源沙門氏菌僅耐1種藥物，而18株新生源沙門氏菌耐2種以上抗生素。

（4）新生豬源沙門氏菌的耐藥基因。本組10種耐藥基因中，有5種經(jīng)PCR擴(kuò)增出相應(yīng)大小的目的片段。其中，磺胺類耐藥基因包含sulII和sulI兩種，后者檢出率最高，為45.62%；喹諾酮類耐藥基因以parC為主，檢出率為97.46%；氯霉素耐藥基因floR為47.26%。

3 討論

沙門氏菌抗原性復(fù)雜，耐藥性強(qiáng)，沙門氏菌感染為豬安全養(yǎng)殖及食物污染控制帶來(lái)諸多不便。為了評(píng)估新生豬源沙門氏菌的耐藥性及耐藥基因，本研究將150份新生豬豬肉標(biāo)本作為研究對(duì)象，結(jié)果表明：150份豬肉樣本中共分離出21株沙門氏菌，分離率為14.00%。新生豬源沙門氏菌對(duì)不同抗生素的耐藥程度各不相同，其中高耐藥主要包含環(huán)丙沙星（98.75%）、鏈霉素（94.23%）和阿米卡星（87.69%），而3株新生豬源沙門氏菌僅耐1種藥物，其余18株新生源沙門氏菌耐2種以上抗生素。這一結(jié)果表明新生豬源沙門氏菌的耐藥現(xiàn)象較為明顯。

PCR結(jié)果顯示：磺胺類耐藥基因sulII、sulI（45.62%），喹諾酮類耐藥基因parC （97.46%），氯霉素floR（47.26%）。通過(guò)對(duì)耐藥性及耐藥基因的對(duì)比發(fā)現(xiàn)，新生豬源沙門氏菌的耐藥性與耐藥基因存在密切關(guān)聯(lián)。

4 結(jié)論

綜上所述，新生豬源沙門氏菌耐藥現(xiàn)象較為明顯，而且對(duì)環(huán)丙沙星、鏈霉素及阿米卡星的耐藥性較高。因此，對(duì)新生豬的沙門氏菌感染治療中應(yīng)慎用上述抗生素。此外，養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)加強(qiáng)沙門氏菌的感染預(yù)防，一旦發(fā)生感染，應(yīng)遵循交叉用藥原則，避免因抗生素濫用導(dǎo)致沙門氏菌耐藥率持續(xù)增長(zhǎng)。