DNA納米技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用

路亞瓊綜述，王晴凈審校

0 引 言

納米技術(shù)是在1～100 nm尺度范圍內(nèi)的結(jié)構(gòu)材料的基礎(chǔ)上，研究其性質(zhì)和應(yīng)用的技術(shù)。從20世紀80年代末逐步發(fā)展起來后，相繼和物理學(xué)、化學(xué)、生物技術(shù)有機結(jié)合。納米材料能夠表現(xiàn)出與宏觀物體相對獨立的運動規(guī)律和特殊的理化性質(zhì)，因此可以構(gòu)建具有特定功能的納米結(jié)構(gòu)和器件來解決實際問題，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有誘人的應(yīng)用前景。現(xiàn)介紹DNA納米結(jié)構(gòu)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域上的三大應(yīng)用，并對DNA納米技術(shù)的未來進行展望。

1 DNA 納米技術(shù)在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用

1.1DNA納米技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢測方面的應(yīng)用DNA納米技術(shù)為發(fā)展單分子水平上的生物傳感器提供了新的思路，可作為生物分子探針載體平臺的空間可定位骨架。之前的臨床研究表明多種新生物標記物(如microRNA)的含量增加或減少可能導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，而且一種疾病往往與多個基因標記物有關(guān)。為實現(xiàn)超靈敏和個性化的疾病分子分析，新出現(xiàn)的DNA納米材料為推動超靈敏生物檢測領(lǐng)域的發(fā)展提供了新的應(yīng)用方向。最早將DNA origami應(yīng)用到生物檢測領(lǐng)域中的是Yan課題組，他們將尺寸為100 nm×70 nm的矩形折紙作為生物芯片來輔助檢測溶液中的RNA分子[1]。在折紙芯片特定位置的3列訂書釘鏈上伸出20個堿基長的寡核苷酸單鏈作為探針，分別可以和3種microRNA序列雜交，當和靶向RNA分子雜交后，DNA/RNA 雙鏈成為帶有位阻效應(yīng)的V型結(jié)構(gòu)，其硬度和高度的增加可通過AFM識別。Fan實驗室在“中國地圖”折紙的折紙芯片上，將剛性的“V型探針”改為更加簡便的“線性探針”，成功實現(xiàn)了對特定靶向DNA的檢測[2]。除了DNA折紙術(shù)構(gòu)建的生物芯片外，DNA四面體可以在自組裝的四條DNA單鏈的頂點處伸出特定的寡核苷酸探針，實現(xiàn)對DNA、RNA的超靈敏檢測[3-4]。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNP)是最常見的一種人類可遺傳變異，同時可以作為疾病診斷的有效標記，所以對SNP的檢測區(qū)分一直備受關(guān)注?；贒NA折紙平臺，不僅可以實現(xiàn)SNP的區(qū)分，還能通過AFM進行可視化檢測。Seeman等[5]在矩形折紙芯片上，設(shè)計了可讀出的包含有A、T、C、G4個核苷酸字母的形狀，當單核苷酸錯配為T的靶向DNA存在時，無法和探針T完全互補，此時信號分子淬滅，該核苷酸形狀T消失，AFM圖像可直接讀出錯配結(jié)果。相比之前在均相和界面上的檢測方法，該平臺可實現(xiàn)多個SNP位點的可視化讀數(shù)[5]，在醫(yī)療診斷方面的應(yīng)用性就可以大為加強[5]。

DNA納米結(jié)構(gòu)尤其是DNA折紙可作為納米尺度的“液晶顯示屏”成為信號輸出設(shè)備，在AFM的成像幫助下，實現(xiàn)基因缺損與異常等疾病的高靈敏檢測和診斷。除此之外，還可偶聯(lián)其他分子如納米金、抗體、核酸適配體等實現(xiàn)對重金屬離子、相應(yīng)蛋白或酶以及配體的檢測[6-7]。DNA納米結(jié)構(gòu)因為其構(gòu)型變化和某些金屬離子有關(guān)，可以檢測鉛、鎂、鋅、汞等多種元素。Mirkin等[8]將在2種納米金顆粒上分別修飾一條互補DNA鏈，其含有T-T錯配，當溶液中存在汞離子時，2條DNA鏈可形成穩(wěn)定的T-Hg-T結(jié)構(gòu)而脫離納米金，其表面失去DNA鏈的保護而聚集沉淀，實現(xiàn)對汞離子的檢測。Elezgaray實驗室則利用矩形折紙芯片實現(xiàn)對鉀離子的定量檢測。在折紙芯片上排布并伸出可以和G四聯(lián)體相連接的探針，當K+濃度很富集時，其結(jié)構(gòu)不變，減少鉀離子濃度，則G四聯(lián)體構(gòu)象發(fā)生變化，打開為單鏈進而引發(fā)DNA雜交反應(yīng)，根據(jù)熒光變化檢測鉀離子濃度的改變[9]。

1.2DNA納米技術(shù)在醫(yī)學(xué)治療方面的應(yīng)用DNA具有優(yōu)越的易修飾性，與許多基團如氨基、巰基、羧基、特異的小分子和各種熒光基團等相整合[10-11]；作為具有良好生物相容性的三大生物大分子之一，安全無毒副作用。DNA納米結(jié)構(gòu)具有多樣的編碼能力和良好的可設(shè)計性，載帶藥物量大，在體內(nèi)走向明確；具有良好的滲透性，可傳送和定位傳遞信息，通過細胞表面配體的特異性可定位的在靶向位置緩釋藥物。這些都使得DNA納米結(jié)構(gòu)具有優(yōu)越的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用[12-17]。

Fan課題組利用滾環(huán)擴增(rolling circle amplification，RCA)原理獲得一條長單鏈且具有多個重復(fù)單元，以此代替噬菌體單鏈M13mp18作為腳手架鏈，訂書釘鏈的數(shù)目降低為3條，即可折疊出DNA納米帶結(jié)構(gòu)，合成方便且大大節(jié)約了實驗成本。在staple鏈上攜載免疫核酸CpG序列，進入細胞，細胞攝取能力更為高效，免疫活性較之含有CpG序列的單、雙鏈DNA增幅很大[18]。Weizmann課題組利用相似的設(shè)計自組裝為DNA納米帶結(jié)構(gòu)，載帶小分子干擾RNA沉默特定基因，同時還可作為細胞中的pH報告器[19]。Ding課題組發(fā)現(xiàn)DNA納米結(jié)構(gòu)具有增強的腫瘤被動靶向性和在腫瘤區(qū)域的長滯留效應(yīng)，他們將抗癌藥物阿霉素(doxorubicin)以嵌入的形式載帶在三角形DNA折紙內(nèi)，使其具有大劑量的藥物載帶和持久的緩慢釋放性，展現(xiàn)了DNA折紙在藥物載帶方面突出的治療功效[20-21]。

除了靜態(tài)的DNA納米結(jié)構(gòu)可以在藥物運輸、靶向治療上發(fā)揮傳統(tǒng)方式難以匹敵的療效外，可根據(jù)需要靈活設(shè)計開關(guān)狀態(tài)的動態(tài)DNA納米機器更適合于生物治療領(lǐng)域。Yan課題組設(shè)計了一個以核酸適配體為開關(guān)的六邊形圓筒結(jié)構(gòu)，當細胞表面的抗原存在時，可與核酸適配體發(fā)生高親和作用結(jié)合，將六邊形折紙結(jié)構(gòu)解鎖打開，釋放空腔內(nèi)的載帶物[22]。Church課題組則設(shè)計了三維的六棱桶狀納米結(jié)構(gòu)，通過細胞膜表面上2個不同受體相對應(yīng)的核酸適體的構(gòu)象變化人為控制開關(guān)，當DNA六棱桶進入細胞后，當且僅當2個目標受體都存在時，六棱桶才能打開，通過此途徑提高納米結(jié)構(gòu)的選擇性，進行對靶標癌細胞的特異性識別，桶內(nèi)載帶的抗體緩釋，從而抑制癌細胞的生長[23]。DNA納米結(jié)構(gòu)載體具有良好的體內(nèi)穩(wěn)定性和較強的腫瘤靶向性，在醫(yī)學(xué)治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。

1.3DNA納米技術(shù)在醫(yī)學(xué)仿生方面的應(yīng)用人類的生物系統(tǒng)是復(fù)雜且精密的，為了對它的運轉(zhuǎn)方式有更好的了解，科研工作者利用DNA納米技術(shù)構(gòu)造生物仿生系統(tǒng)。首先從較基礎(chǔ)的生物分子機器開始構(gòu)建。DNA和蛋白質(zhì)的關(guān)系水乳交融，連接方式多種多樣，如特殊的DNA序列可以識別鋅指蛋白并連接[24]；修飾有Ni-NTA的DNA分子可以與帶有組氨酸標簽的蛋白相結(jié)合連接[25]；修飾有生物素的DNA可以和鏈霉親和素通過抗體作用相連接[26]；DNA和多肽可通過EDC/NHS反應(yīng)相連接等[27]。其中，生物素和鏈霉親和素因其高親和力的牢固結(jié)合而被廣泛應(yīng)用開發(fā)。Yan等[28]在DNA二維網(wǎng)格結(jié)構(gòu)上設(shè)計了若干條修飾有生物素的DNA鏈，實現(xiàn)了鏈霉親和素蛋白陣列。Kuzyk課題組在矩形DNA折紙上，排布鏈霉親和素的圖形[34]。核酸適配體(aptamer)和蛋白相互作用中的距離效應(yīng)也是構(gòu)建生物仿生系統(tǒng)的研究范圍。Yan課題組將分別和凝血酶2個區(qū)域結(jié)合的apt-A和apt-B作為研究對象，利用DNA納米結(jié)構(gòu)的可尋址性精確的控制兩者之間的間距，進而操縱其與凝血酶相結(jié)合的能力[29]。這篇報道是基于DNA納米結(jié)構(gòu)來人工模擬并控制生物大分子相互作用的首例。

Turberfield課題組設(shè)計了具有空腔的DNA納米籠，在特定位置的DNA鏈上修飾tris-NTA，將帶有組氨酸標簽(His-tag)的蛋白錨定于其上，并與冷凍電子顯微鏡技術(shù)相結(jié)合獲得目標蛋白質(zhì)分子的高分辨率圖像并解析結(jié)構(gòu)，為生物結(jié)構(gòu)學(xué)家夢寐以求的研究提供了新的思路[30]。Fan課題組利用DNA納米技術(shù)人工模擬了生物體內(nèi)常見的雙酶體系。在矩形DNA折紙上組裝葡萄糖氧化酶與辣根過氧化物酶，在折紙上控制兩個酶之間的距離，并觀察酶聯(lián)反應(yīng)的變化，發(fā)現(xiàn)兩者之間呈反比；之后將矩形折紙的上下兩端封閉得到DNA納米圓筒并作為雙酶級聯(lián)生物反應(yīng)器，與矩形折紙相比，同樣距離下酶聯(lián)級促的反應(yīng)活性更高，猜測是“三維限域空間”效應(yīng)導(dǎo)致[31]。自然界中存在微管上向負端“行走”的動力蛋白和向正端“行走”的驅(qū)動蛋白(Kinesin-1)來運輸細胞內(nèi)的“貨物”，Peterson課題組構(gòu)建了三維的螺旋管結(jié)構(gòu)作為它們運輸?shù)摹柏浳铩?，通過控制這2種馬達蛋白的極性、數(shù)目、位置來研究它們的運輸特征[32]。

研究膜結(jié)構(gòu)和動力學(xué)的必須工具是人工脂質(zhì)雙分子層，合成理化性質(zhì)穩(wěn)定，尺寸可控的脂質(zhì)囊泡具有很大的意義，可用于膜蛋白解析，藥物遞送等過程，應(yīng)用廣泛。Shih課題組設(shè)計尺寸不一的三維DNA納米環(huán)形結(jié)構(gòu)作為脂質(zhì)體生長的模版，合成直徑<100 nm且形貌均一的立體囊泡結(jié)構(gòu)[33]。Sugiyama課題組將人工磷脂雙分子層作為可變化的基底，在其上鋪上十字形狀的DNA折紙來輔助構(gòu)建晶格狀大分子[34]。

生物體的磷脂雙分子層中的納米孔通道從本質(zhì)上來說是一種離子通道，這種跨膜通道可以調(diào)控離子或其他小生物分子的運輸，利用DNA納米技術(shù)來構(gòu)建納米孔材料是醫(yī)學(xué)仿生領(lǐng)域內(nèi)有價值的內(nèi)容。Simmel課題組構(gòu)建了一端為桿狀一端為桶形“蓋子”的結(jié)構(gòu)，主干桿狀結(jié)構(gòu)可嵌入磷脂雙分子層，蓋狀結(jié)構(gòu)將主干固定于膜上不動。通過單通道電生理學(xué)實驗設(shè)備，對這種復(fù)合型納米孔通道進行電導(dǎo)表征，發(fā)現(xiàn)它們與生命中天然存在的通道相似；當DNA鏈穿過通道時，每種核酸分子的電信號特征都不相同，可鑒定不同的DNA分子[35]。除此之外，DNA納米結(jié)構(gòu)孔結(jié)構(gòu)也模擬生物仿生系統(tǒng)檢測各種生物分子[36-43]。

DNA納米結(jié)構(gòu)可以模擬酶聯(lián)級促反應(yīng)器和納米孔通道外，還可與病毒衣殼相結(jié)合進入細胞以增強細胞傳送力，構(gòu)建宏觀材料水凝膠作為三維細胞培養(yǎng)的門控等多種用途。

2 展 望

在多學(xué)科相互聯(lián)系交叉發(fā)展的21世紀，DNA納米技術(shù)因其具有尋址性的結(jié)構(gòu)信息，強大的分子載帶量和良好的生物兼容性站在了發(fā)展的前沿。DNA納米結(jié)構(gòu)從簡單的幾條DNA鏈自組裝的tile結(jié)構(gòu)發(fā)展到立體復(fù)雜的DNA折紙圖案，從間接的凝膠表征到可視化的照片顯示，從靜態(tài)的圖形圖案到動態(tài)的分子機器，DNA納米結(jié)構(gòu)越來越復(fù)雜，元件越來越精細。

DNA納米技術(shù)的快速發(fā)展，帶來了在生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域巨大的應(yīng)用潛力，在生物醫(yī)學(xué)上的研究方向是向智能化進行的，由于精確的可定制性，DNA納米結(jié)構(gòu)，可對各種病原微生物、腫瘤標志物、基因變異等各種疾病的相關(guān)指標進行早期診斷和靈敏度高的檢測，先進的診斷方式至關(guān)重要；研究并制備載帶有特異性藥物的納米結(jié)構(gòu)載體，在靶向部位定時定量的緩釋藥物，以解決癌癥的可轉(zhuǎn)移性或治療其他重大疾??；將納米機器努力做得像天然生命系統(tǒng)一樣，按照人類的指令精確可控的完成各種任務(wù)和研究，這是其他技術(shù)在醫(yī)學(xué)仿生領(lǐng)域所不具備的優(yōu)勢。

雖然DNA納米技術(shù)發(fā)展很快，但仍處于發(fā)展的初期階段，面臨諸多挑戰(zhàn)，如DNA合成的高成本、更高級結(jié)構(gòu)的設(shè)計、體內(nèi)的安全性評估、細胞的攝取效率等。相信隨著科學(xué)的發(fā)展，DNA納米技術(shù)從實驗室走向臨床實踐的道路艱辛卻光明。

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