在肝移植術(shù)中應(yīng)用調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的研究進(jìn)展

丁非凡，曾 仲

（昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院器官移植科，云南 昆明 650500）

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）是T淋巴細(xì)胞群中表達(dá)CD4、CD25、Foxp3等特異性表面標(biāo)志物的淋巴細(xì)胞亞群，其可以有效地抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞的功能及增殖。1995年，日本學(xué)者Sakaguchi等[1]的研究中首次發(fā)現(xiàn)CD4+CD25+Treg，并指出CD4+CD25+Treg的免疫調(diào)節(jié)作用是維持自身免疫耐受的關(guān)鍵。自此以后，國內(nèi)外眾多學(xué)者便致力于對(duì)Treg的研究。大量的研究表明，Treg不僅在維持動(dòng)物體自身免疫耐受和免疫防御中具有重要的作用，其在腫瘤的發(fā)展、移植耐受、維持免疫平衡等方面也具有至關(guān)重要的作用。以至于有學(xué)者認(rèn)為，以CNI（鈣神經(jīng)蛋白抑制劑）為主的免疫抑制劑有可能被Treg增強(qiáng)免疫療法所取代。

1 Treg的概述

根據(jù)Treg來源的不同，可將其分為來源于胸腺的天然型Treg（natural Treg，nTreg）和通過抗原刺激產(chǎn)生的誘導(dǎo)型 Treg（induced Treg，iTreg）。

nTreg在胸腺中發(fā)育成熟后，可進(jìn)入患者的外周淋巴組織，其具有較強(qiáng)的免疫耐受性，可防止患者發(fā)生自身免疫性疾病。iTreg可分為Th3細(xì)胞和Trl細(xì)胞[2]。其中，Th3細(xì)胞可分泌轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor β，TGF-β），Trl細(xì)胞可分泌白細(xì)胞介素10（interleukin 10，IL-10）。有研究表明，在胸腺發(fā)育成熟的nTreg進(jìn)入外周血后，具有較強(qiáng)的自身免疫耐受性，可預(yù)防自身免疫性疾病的發(fā)生，而iTreg產(chǎn)生的同種異體抗原能夠更好的延長肝臟移植物的存活時(shí)間[3-5]。

nTreg和iTreg的增殖和分化依賴于TGF-β和白細(xì)胞介素2（interleukin 2，IL-2）細(xì)胞因子的刺激。成熟的TGF-β能夠與TβR（TGF-β受體）相結(jié)合，使果蠅抗生物皮膚生長因子蛋白2（Drosophila mothers against decapentaplegic protein 2，Smad2）和果蠅抗生物皮膚生長因子蛋白3（Drosophila mothers against decapentaplegic protein 3，Smad3）被磷酸化，被磷酸化的Smad2、Smad3與果蠅抗生物皮膚生長因子蛋白4（Drosophila mothers against decapentaplegic protein 4，Smad4）結(jié)合后，可附著在DNA上的Smad結(jié)合位點(diǎn)，從而可調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄[6]。同時(shí)，Tet1（清除記憶基因1）和Tet2（清除記憶基因2）可通過TGF-β以及IL-2信號(hào)通路被募集至FoxP3基因座上，維持Foxp3基因調(diào)節(jié)區(qū)的去甲基化狀態(tài)，從而維持Treg的穩(wěn)定性。

IL-2信號(hào)通路的主要作用是調(diào)節(jié)人體內(nèi)Treg的平衡。肝移植術(shù)后患者體內(nèi)如果缺少IL-2或者IL-2的受體（α鏈/CD25和β鏈/CD122），可使Treg的數(shù)量明顯降低。由于nTreg自身并不能轉(zhuǎn)錄及分泌IL-2，因此，其只能完全依賴于旁分泌的方式來調(diào)節(jié)Treg的數(shù)量。經(jīng)大量的研究證實(shí)，IL-2可以使信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子5（signal transduction and activator of transcription5，STAT5） 被 磷酸化，從而誘導(dǎo)和分化成熟的Treg。

袁淵等[7]的研究表明，外周血中睪酮素的水平與Treg的數(shù)量呈正相關(guān)。臨床實(shí)踐證實(shí)，進(jìn)行腎臟移植術(shù)后，男性患者體內(nèi)的雄激素可直接抑制效應(yīng)T細(xì)胞，從而減少其對(duì)腎臟移植物的排異反應(yīng)。而女性在月經(jīng)期間，其Treg水平的升高、細(xì)胞免疫（cell-mediated immunity）水平的降低則可能與外周血中孕激素水平的異常升高有關(guān)。

2 Treg表面標(biāo)志物

CD25（cluster of differentiation 25，分化群25）曾被視為Treg特異性表面標(biāo)志物。但有研究表明，CD25還可以在活化的T淋巴細(xì)胞表面進(jìn)行誘導(dǎo)性表達(dá)，從而造成了無法區(qū)分CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和CD4+CD25+活化T細(xì)胞的困境。Roncador等[8]的研究表明，可以將Foxp3（forkhead box P3，插頭盒蛋白P3）作為CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物。

Foxp3是人類Fox（Forkhead box，插頭盒）基因家族中的一員。Fox家族是脊椎動(dòng)物叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子的總稱，與細(xì)胞生長發(fā)育的調(diào)控有關(guān)。由于Foxp3具有在Treg內(nèi)表達(dá)的特性，因此，只能在破壞Treg細(xì)胞膜的情況下檢測Foxp3的水平。由此可見，F(xiàn)oxp3并不是Treg有效的表面標(biāo)志物。

FONTENOT等[9-10]人的研究表明，CD127（IL-7受體）可在Treg表面下調(diào)表達(dá)，可將CD127low作為Treg的另一個(gè)特異性標(biāo)志物。此外，該項(xiàng)研究還表明，外周血中Treg的水平與其受到CD127調(diào)控的程度呈負(fù)相關(guān)。也就是說，CD127若在Treg表面進(jìn)行表達(dá)，會(huì)降低Treg的功能。這一發(fā)現(xiàn)解決了需要破壞Treg細(xì)胞膜檢測Foxp3水平的困境。

除此之外，Treg非特異性表面標(biāo)志物還有PD-1（Programmed death1，程序性死亡蛋白 1）、CTLA4（Xytotoxic T lymphocyte-associated protei-4，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4）、TNF（Tumor necrosis factor，腫瘤壞死因子）、TGF-β（Transforming growth factor β，轉(zhuǎn)化生長因子β）、IFN-γ（Interferon γ，γ 干擾素）和以GARP（Glycoprotein A repetition，糖蛋白A）為主的重復(fù)序列蛋白。

3 Treg的作用機(jī)制

Treg能夠分泌TGF-β。有研究表明，TGF-β可與NK（自然殺傷細(xì)胞）表面的TGF-β1R Ⅱ（轉(zhuǎn)化生長因子β1Ⅱ型受體）結(jié)合，通過TGF-β-Smad信號(hào)通路使Smad2被磷酸化，從而誘導(dǎo)P15INK4B（抑癌基因）和P21WAF1/cip1（靶向抑癌基因）的轉(zhuǎn)錄[11]。臨床實(shí)踐證實(shí)，P15INK4B、P21WAF1/cip1均能夠有效地抑制NK細(xì)胞的繁殖。

Treg和活化的T細(xì)胞均能夠上調(diào)IL-2R（IL-2受體）的表達(dá)[12-14]。IL-2（白細(xì)胞介素2）是一種糖蛋白，能夠與IL-2R的復(fù)合體﹝包括CD25 IL-2Rα鏈（白細(xì)胞介素2受體α鏈抗體）、CD122 IL-2Rβ鏈（白細(xì)胞介素2受體β鏈抗體）、CD132 IL-2Rγ鏈（白細(xì)胞介素2受體γ鏈抗體）﹞相結(jié)合。CD25 IL-2Rα鏈與CD122 IL-2Rβ鏈、CD132 IL-2Rγ鏈結(jié)合，可提高IL-2R對(duì)IL-2的親和力。CD122 IL-2Rβ鏈和CD132 IL-2Rγ鏈對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)具有重要的作用，通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可激活PI3K/Akt (磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B通路)、RTPK（酪氨酸蛋白激酶受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)）、MAPKs (絲裂原活化蛋白激酶通路)、JAK/STAT（轉(zhuǎn)錄因子激活通路）等，從而進(jìn)一步激活NK細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。有研究表明，Treg與效應(yīng)性T 細(xì)胞競爭性結(jié)合IL-2，從而可抑制其他免疫細(xì)胞的增殖和活化。

Treg分泌的CTLA4與協(xié)同刺激信號(hào)B7-1分子和B7-2分子具有較高的親和力，可以與其他效應(yīng)T細(xì)胞表面的CD28競爭性結(jié)合APC表面的相同分子，從而干擾CD28的共刺激信號(hào)。同時(shí)，CTLA4還能下調(diào)APC表面B7分子的表達(dá)，從而降低APC的刺激能力[15-16]。有研究表明，在CD4+CD25+效應(yīng)T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染CTLA4表達(dá)質(zhì)粒，能夠使效應(yīng)T細(xì)胞獲得免疫抑制的功能[17]。如果向CD4+CD25+效應(yīng)T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Foxp3表達(dá)質(zhì)粒則不會(huì)使效應(yīng)T細(xì)胞出現(xiàn)免疫抑制的功能。

大量的研究表明，Treg可以通過釋放顆粒酶/穿孔素等途徑起到抑制免疫反應(yīng)的作用。顆粒酶屬于外源性的絲氨酸蛋白酶，其是由CTLs（細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞）和NK（自然殺傷細(xì)胞）共同釋放的細(xì)胞漿顆粒。這些細(xì)胞漿顆粒中含有顆粒質(zhì)酶、穿孔蛋白等。Treg通過釋放顆粒酶，可以有效地激活CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞，使未成熟的DC（樹突狀細(xì)胞）自然凋亡。

4 Treg的體外擴(kuò)增

Treg的免疫抑制功能在臨床中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。在臨床應(yīng)用中需要較大數(shù)量的Treg，故如何在體外誘導(dǎo)過程中產(chǎn)生大量功能穩(wěn)定、表型穩(wěn)定的Treg具有重要的研究意義。

進(jìn)行Treg體外擴(kuò)增的方式包括抗原特異性體外擴(kuò)增與非特異性體外擴(kuò)增。抗原特異性體外擴(kuò)增是指在進(jìn)行體外擴(kuò)增時(shí)所產(chǎn)生的Treg具有抗原的特異性。相關(guān)的研究表明，具有抗原特異性的Treg可向靶器官遷移，并可在靶器官中發(fā)揮抑制作用，從而可降低腫瘤、感染的發(fā)生率。也有研究表明，具有抗原特異性的Treg能夠有效地降低肝移植術(shù)后小鼠GVHD的發(fā)生率，并可避免肝移植術(shù)后小鼠對(duì)肝臟移植物發(fā)生急性排斥反應(yīng)[18]。

Feng等[19]的研究中，曾使用同種異樹突狀細(xì)胞和PDE3抑制劑對(duì)小鼠進(jìn)行體外擴(kuò)增，其使用同種異樹突狀細(xì)胞的主要原因是：1）樹突狀細(xì)胞提供了同種異體的特異性抗原。2）樹突狀細(xì)胞可提供Treg擴(kuò)增所需要的CD28傳導(dǎo)信號(hào)。

非特異性體外擴(kuò)增是目前較為成熟的Treg體外擴(kuò)增的方式。大量的研究表明，進(jìn)行非特異性體外擴(kuò)增時(shí)，TGF-β和 IL-2能夠促進(jìn)Treg中幼稚祖細(xì)胞源分化成為Treg，但由此產(chǎn)生的Treg具有免疫無能性。有研究表明，刺激TCR（T細(xì)胞抗原受體）可激活具有免疫無能性的Treg。刺激TCR的常用方法為在TCR中加入抗CD3的抗體、抗CD28的抗體、抗原呈遞細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）抗原的同時(shí)，加入10～2000 U/mL高濃度的外源性IL-2。

Zhang等[20]的研究表明，在對(duì)TCR進(jìn)行刺激時(shí)，TGF-β1/Fc融合蛋白與西羅莫司均能夠誘導(dǎo)未成熟的CD4+CD25+Foxp3—T細(xì)胞分化成為成熟的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。Lu等[21]的研究表明，由TGF-β誘導(dǎo)的CD4+CD25—T淋巴細(xì)胞可以在CD3抗體、CD28 抗體存在時(shí)，將ATRA (all-trans-retinoic acid，全反式維A酸)轉(zhuǎn)換成為CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。這一研究結(jié)果已經(jīng)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)，且證實(shí)其能夠有效地能夠延長患有GVHD的小鼠的生存期。

但目前，對(duì)肝移植術(shù)后患者進(jìn)行Treg的非特異性體外擴(kuò)增仍存在較大的“缺陷”。肝移植術(shù)后患者若存在炎癥反應(yīng)，Treg可轉(zhuǎn)化為Th17（輔助性T細(xì)胞）。相關(guān)的研究表明，Th17是一種能夠分泌IL-17、IL-22等促炎性因子的輔助性T細(xì)胞。這兩種細(xì)胞因子均可加重患者的局部炎癥反應(yīng)。

5 Treg在肝移植術(shù)中的應(yīng)用

目前，臨床上常采用肝移植術(shù)對(duì)肝癌終末期患者進(jìn)行治療。臨床實(shí)踐證實(shí)，影響肝移植術(shù)后患者肝臟移植物存活率的主要因素為其是否發(fā)生急性排斥反應(yīng)。近年來，免疫抑制劑的更新迭代及臨床應(yīng)用，雖然有效地降低了肝移植患者急性排斥反應(yīng)的發(fā)生率，但卻提高了其不良反應(yīng)的發(fā)生率。

相關(guān)的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，肝移植術(shù)后患者完全接受肝臟移植物的占比為進(jìn)行肝臟移植術(shù)總?cè)藬?shù)的25%～33%，這與其受體內(nèi)CD4+CD25+的異常表達(dá)有關(guān)[22]。Tapirdamaz等[23]的研究表明，肝移植術(shù)后患者肝臟移植受體的CTLA-4基因存在+49A/+6230G風(fēng)險(xiǎn)等位，可提高其發(fā)生急性排斥反應(yīng)的發(fā)生率。

Demirkiran等[24]的研究表明，肝移植術(shù)后患者發(fā)生急性排異反應(yīng)時(shí)其體內(nèi)Treg的數(shù)量低于未發(fā)生排異反應(yīng)的患者，這說明，肝移植術(shù)后患者肝臟移植物的存活率與其體內(nèi)Treg的數(shù)量呈正相關(guān)。目前，醫(yī)學(xué)界內(nèi)僅有對(duì)造血干細(xì)胞移植術(shù)后患者進(jìn)行體外擴(kuò)增Treg以抑制其急性排異反應(yīng)的臨床研究。Trzonkowski P等[25]的研究中，曾為骨髓移植術(shù)后發(fā)生GVHD的患者采用體外擴(kuò)增CD4+CD25+CD127lowTreg的方法進(jìn)行治療。該研究證實(shí)，對(duì)骨髓移植術(shù)后患者進(jìn)行CD4+CD25+CD127lowTreg體外擴(kuò)增治療可減少其免疫抑制劑的用量，有效地緩解其臨床癥狀。Brunstein等[26]在一項(xiàng)研究中對(duì)23例臍帶造血干細(xì)胞移植術(shù)患兒進(jìn)行CD4+CD25+CD127lowTreg體外擴(kuò)增治療，有效地降低了其GVHD的發(fā)生率。

6 結(jié)論

進(jìn)行體外擴(kuò)增Treg或在進(jìn)行自體血液分離Treg后再將Treg回輸入患者體內(nèi)很可能是對(duì)接受肝移植術(shù)后發(fā)生急性排斥反應(yīng)患者進(jìn)行治療的有效方法。目前，這兩種治療方法均處于研究階段，且相關(guān)研究的對(duì)象大多為在無菌環(huán)境中生長的嚙齒類動(dòng)物。與在無菌環(huán)境中生長的嚙齒類動(dòng)物相比，人類的免疫系統(tǒng)更為復(fù)雜。目前，對(duì)肝移植術(shù)后患者采用體外擴(kuò)增Treg的治療方式來抑制其發(fā)生急性排斥反應(yīng)的臨床研究還處于空白狀態(tài)，Treg在人體內(nèi)通過何種方式或由何種物質(zhì)誘導(dǎo)生成還不明確，此類課題均有待于進(jìn)一步的研究。