低溫β-甘露聚糖酶菌株的篩選鑒定及產(chǎn)酶條件的研究

李曉艷，楊旭穎，王 帆，遲乃玉

（大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 遼寧 大連 116622）

β-甘露聚糖酶（β-1,4-D-mannan mannohydrolase,EC 3.2.1.78）是能夠水解含有β-1,4-D-甘露糖苷鍵的多聚糖（如半乳甘露聚糖、甘露聚糖、葡甘露聚糖）為甘露低聚糖的酶[1]，其作用底物是中β-甘露聚糖，而β-甘露聚糖是半纖維素的主要成份，半纖維素是自然界中第二大類雜聚多糖，廣泛存在于槐豆膠、瓜爾豆膠、魔芋精粉等食用植物中[1]。而β-甘露聚糖酶以食用植物如魔芋粉、槐豆膠等為底物，水解形成的產(chǎn)物甘露低聚糖在食品、飼料、造紙、石油開采等方面廣泛應(yīng)用[2-5]。微生物發(fā)酵生產(chǎn)的β-甘露聚糖酶具有生產(chǎn)成本比較低、生產(chǎn)周期短、產(chǎn)酶量大酶活力高等優(yōu)點，成為國內(nèi)外理論和應(yīng)用研究的熱點。有關(guān)微生物生產(chǎn)β-甘露聚糖酶的研究主要集中在中溫酶、高溫酶產(chǎn)酶菌株的篩選[5]、響應(yīng)面優(yōu)化產(chǎn)酶條件[1,6-8]、酶的分離、制備工藝優(yōu)化[9,10]、產(chǎn)酶基因的克隆與其表達(dá)[11-13]等多方面。國外(Yutaka Tamaru,O.Politz)[14,15]對海洋微生物產(chǎn)β-甘露聚糖酶基因進(jìn)行研究，國內(nèi)張云光等[16]對海洋細(xì)菌β-甘露聚糖酶進(jìn)行菌株篩選研究，得到最適作用溫度30℃產(chǎn)酶菌株。低溫酶具有低溫高效結(jié)構(gòu)柔順性、高催化活性、熱不穩(wěn)定性等特點，使其在應(yīng)用上比高溫酶、中溫酶更有優(yōu)勢。低溫脂肪酶、蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶等多種低溫酶已經(jīng)實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，低溫β-甘露聚糖酶研究與開發(fā)是大勢所趨。

以大連星海公園的海水、海泥為樣品，篩選生產(chǎn)低溫β-甘露聚糖酶的菌株，得到1株高產(chǎn)低溫β-甘露聚糖酶的菌株，根據(jù)其生物學(xué)特性及菌落特征對其進(jìn)行初步分類鑒定，同時以其為研究對象，研究其產(chǎn)酶條件，為其發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化及工業(yè)化應(yīng)用生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

以大連黃海海水、富含腐殖質(zhì)的海泥為樣品，篩選產(chǎn)低溫β-甘露聚糖酶菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基

（1）富集培養(yǎng)基(g/L)：魔芋粉5，瓜豆膠5，硫酸銨5，硫酸鎂0.2，磷酸氫二鉀1，氯化鈉5，pH自然，115 ℃ 0.75 Mpa滅菌20 min。

（2）分離培養(yǎng)基(g/L)：魔芋粉5，瓜豆膠5，硫酸鎂0.2，磷酸氫二鉀1，氯化鈉5，剛果紅0.5，瓊脂粉18，pH自然，115 ℃ 0.075 Mpa 滅菌20 min。

（3）種子培養(yǎng)基(g/L)：魔芋粉10，蛋白胨5，硫酸鎂0.2，磷酸氫二鉀1，氯化鈉5，pH自然，115 ℃ 0.075 Mpa 滅菌 20 min。

（4）產(chǎn)酶培養(yǎng)基(g/L)：魔芋粉5，蛋白胨5，硫酸鎂0.2，磷酸氫二鉀1，氯化鈉5，pH自然，115 ℃ 0.075Mpa 滅菌 20 min。

（5）斜面保藏培養(yǎng)基(g/L)：魔芋粉5，氯化鈉20，瓊脂粉18，pH自然，115 ℃ 0.075 Mpa 滅菌20 min。

（6）甘油保藏培養(yǎng)基(g/L)：魔芋粉5，酵母膏5，硫酸鎂0.2，磷酸氫二鉀1，氯化鈉5，pH自然，115 ℃ 0.075 Mpa 滅菌 20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株的富集培養(yǎng)

取海泥或海水10 g放入裝有100 mL無菌水的錐形瓶中，搖勻后靜置30 min取上清液10 mL接種到富集培養(yǎng)基中，置于振蕩培養(yǎng)箱中25℃ 160 r/min振蕩培養(yǎng)28 h。

1.2.2 菌株的初篩

取富集培養(yǎng)液20mL放入500mL盛有180 mL無菌水及含40個玻璃珠錐形瓶中，160 r/min振蕩30 min使樣品均勻分散，稀釋涂布裝有鑒別培養(yǎng)基的平板25 ℃倒置培養(yǎng)，菌落周圍形成透明圈的菌株為初篩菌株，透明圈直徑與菌落直徑之比為判定其酶活力重要指標(biāo)。

1.2.3 菌株的復(fù)篩

挑取透明圈直徑與菌落直徑之比較大的菌株純培養(yǎng)物一環(huán)，接種于種子培養(yǎng)基中，25 ℃ 160 r/min HZP-256全溫振蕩培養(yǎng)24 h為種子液，以3 %的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)28 h，用1 mL移液槍取1 mL發(fā)酵液于1.5 mL Tube管中，4 ℃8000 r/min離心10 min后，粗酶液為上清液。通過測定酶活力進(jìn)行復(fù)篩。

1.2.4 酶活的測定方法

將魔芋粉溶于pH 6.0的磷酸鈉緩沖液中配制20 g/L的溶液，此溶液為底物。取低溫離心得到粗酶液0.1 mL加入到0.9 mL底物中，50 ℃水浴中10 min。加入2.0 mL DNS試劑，沸水浴5 min顯色，立即以流動水沖洗冷卻至室溫，用去離子水定容至10.0 mL，以空白液調(diào)零，于540 nm處測定吸光度，即OD540。

1.3 低溫 β-甘露聚糖酶菌株的鑒定

根據(jù)其個體生物學(xué)特性及菌落特征，同時參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》。

1.4 低溫 β-甘露聚糖酶生產(chǎn)菌株的產(chǎn)酶曲線與生長曲線的測定

1.4.1 低溫 β-甘露聚糖酶生產(chǎn)菌株的產(chǎn)酶曲線的測定

接種環(huán)挑取菌株一環(huán)接種于種子培養(yǎng)基，按照3 %接種量分別接入均裝有6 mL種子培養(yǎng)基無菌試管40支，25 ℃ 160r/min恒溫振蕩培養(yǎng)。時間分別為0 h、4 h、6 h、8 h、10 h…40 h，按時間先后順序測酶活。每次測兩支試管取平均值計算該培養(yǎng)時間酶活，繪制產(chǎn)酶曲線。

1.4.2 低溫β-甘露聚糖酶生產(chǎn)菌株的生長曲線的測定

接種環(huán)挑取菌株一環(huán)，接種于種子培養(yǎng)基，按照3 %接種量分別接入均裝有6 mL種子培養(yǎng)基無菌試管40支，25 ℃ 160r/min恒溫振蕩培養(yǎng)。時間分別為0 h、4 h、6 h、8 h、10 h…40 h，按時間先后順序測OD540。每次測兩支試管取平均值，繪制生長曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫β-甘露聚糖酶生產(chǎn)菌株的篩選與鑒定

采用以魔芋粉為唯一碳源的鑒別培養(yǎng)基平板初篩產(chǎn)低溫β-甘露聚糖酶的菌株，通過測定酶活力進(jìn)行復(fù)篩，進(jìn)而獲得產(chǎn)酶高且穩(wěn)定性好的菌株。

海泥、海水中分離到產(chǎn)透明圈的菌株4株，選取產(chǎn)生透明圈最大、產(chǎn)酶穩(wěn)定的一株命名為WYQ-01。由圖1可知該菌株形成的菌落表面光滑、濕潤、易于挑取、邊緣整齊、邊緣與中間厚薄不一、不透明、乳白色、直徑大小為0.8 cm。由圖2可以看出該菌產(chǎn)低溫β-甘露聚糖酶，且所產(chǎn)生的低溫β-甘露聚糖酶為胞外酶，透明圈直徑大小為3 cm，透明圈與菌落直徑比為3:0.8。由圖3、圖4可知該菌株為桿菌，革蘭氏陰性，菌株長為2 μm、寬為0.6 μm。

圖1 菌株WYQ-01菌落形態(tài)

圖2 形成透明圈的菌株WYQ-01

圖3 菌株WYQ-01革蘭氏染色（10×100)

圖4 圖3放大10倍

2.2 低溫 β-甘露聚糖酶生產(chǎn)菌株WYQ-01產(chǎn)酶曲線與生長曲線

由圖5看出，菌株WYQ-01延滯期為0～14 h，對數(shù)期為14～26 h，穩(wěn)定期為26～34 h，衰亡期為34～40 h。0～14 h時，兩曲線均處于平緩狀態(tài)，此時菌體生長處于延滯期，有代謝產(chǎn)物低溫β-甘露聚糖酶的產(chǎn)生，與菌體生長呈現(xiàn)平行狀態(tài)，是菌株WYQ-01生理、代謝必須的代謝產(chǎn)物，由此可知低溫β-甘露聚糖酶為初級代謝產(chǎn)物。從16 h開始，兩曲線均出現(xiàn)急速上升，此時菌體處于對數(shù)生長期，營養(yǎng)物質(zhì)主要用于菌體的生長，伴隨著大量代謝產(chǎn)物生成，穩(wěn)定期28 h時產(chǎn)酶最多，酶活高達(dá)2175.225 U/mL。隨著發(fā)酵周期的延長，菌體開始進(jìn)入衰亡期，產(chǎn)酶量逐漸降低，是因為隨著菌體生長，發(fā)酵液中營養(yǎng)物質(zhì)逐漸耗盡、代謝產(chǎn)物大量積累、環(huán)境條件的改變致使產(chǎn)酶量下降。由此可知菌株WYQ-01最佳產(chǎn)酶時間為28 h。

圖5 菌株WYQ-01生長曲線和產(chǎn)酶曲線

2.3 低溫β-甘露聚糖酶生產(chǎn)菌株WYQ-01發(fā)酵條件的優(yōu)化

對產(chǎn)低溫β-甘露聚糖酶菌株WYQ-01采用單因素實驗進(jìn)行產(chǎn)酶條件優(yōu)化，單因素包括溫度、裝液量、轉(zhuǎn)速、pH和接種量等優(yōu)化，每個因素設(shè)3個平行。

2.3.1 培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酶的影響

以3%的接種量取種子培養(yǎng)液接種產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，分別在 10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃條件下160 r/min培養(yǎng)28 h后測定酶活。

由圖6可知，在0℃～25℃，隨著溫度的上升，菌株產(chǎn)酶逐漸增多，25 ℃時產(chǎn)酶最多，酶活最高為2002.911 U/m L，20℃時的酶活為25 ℃的80 %左右，10℃時的酶活為最大酶活的20%左右。溫度低于25℃時，產(chǎn)酶量極速下降。由此顯示出菌株WYQ-01產(chǎn)生的低溫β-甘露聚糖酶在低溫環(huán)境中產(chǎn)酶量大且穩(wěn)定性較高；當(dāng)溫度進(jìn)一步升高時，酶活急劇降低，是因為高溫引起酶的變性，使酶活的穩(wěn)定性受到影響進(jìn)而酶活下降，這體現(xiàn)出低溫在高溫下迅速失活的特性。由此可知最佳產(chǎn)酶溫度為25 ℃。

圖6 溫度對菌株WYQ-01產(chǎn)酶的影響

2.3.2 裝液量對產(chǎn)酶的影響

以3%的接種量取種子培養(yǎng)液接種容積為250 mL錐形瓶裝液量分別為30 mL、50mL、80 mL、100 mL和120 mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，25 ℃ 160 r/min振蕩培養(yǎng)28 h測定酶活。由圖7可知，裝液量在30 mL～100 mL時，隨裝液量的增加，產(chǎn)酶量逐漸增大，裝液量100mL時酶活最高為2050.781 U/mL。在100 mL～120 mL時隨裝液量的增加產(chǎn)酶量減少，酶活力降低，由此可知菌株WYQ-01產(chǎn)酶最佳裝液量為100 mL，為錐形瓶容積體積的40%。裝液量主要影響菌株生長對培養(yǎng)基中溶氧量需求，由此可見菌株WYQ-01在生長、產(chǎn)酶過程均需要氧氣，為需氧微生物。

圖7 裝液量對菌株WYQ-01產(chǎn)酶的影響

2.3.3 轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酶的影響

搖床轉(zhuǎn)速設(shè)定為5 0 r/min、110 r/min、130 r/min、160 r/min和 200 r/min，25 ℃ pH 7.0 裝液量100 mL的產(chǎn)酶培養(yǎng)基以3%的接種量接種培養(yǎng)28 h測酶活。由圖8可知，轉(zhuǎn)速介于50 r/min～160 r/min，隨著轉(zhuǎn)速增加，酶活力隨之增大，當(dāng)轉(zhuǎn)速為160 r/min時產(chǎn)酶量最大，酶活力最高為2112.056 U/mL。之后轉(zhuǎn)速再增大產(chǎn)酶量下降， 130 r/min和200 r/min時，酶活分別為1832.491 U/mL和1847.809，仍具有85 %左右酶活力，說明菌株在有氧條件下生長較好，容易產(chǎn)酶。因此只有在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的溶解氧達(dá)到最適條件，才能使菌株產(chǎn)酶量達(dá)到最大，酶活力最大。大幅度提高振蕩速度提高通氣量和溶氧量，提高生產(chǎn)成本又降低產(chǎn)酶量。

圖8 轉(zhuǎn)速對菌株WYQ-01產(chǎn)酶的影響

2.3.4 起始pH對產(chǎn)酶的影響

以3%的接種量取種子培養(yǎng)液接種在pH分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，25℃ 160 r/min振蕩培養(yǎng)28 h后測定酶活。由圖9可知，在pH 5.0～7.0之間，隨著pH的升高，產(chǎn)酶量增大，pH 7.0時產(chǎn)酶量最大，酶活力最高為2081.418 U/mL。在pH 7.0～9.0之間，隨pH的再升高，產(chǎn)酶量減少，酶活力卻快速降低。由此可知菌株WYQ-01酶活的最適pH為7.0左右。pH影響微生物生活環(huán)境中營養(yǎng)物質(zhì)的供給、菌體細(xì)胞膜的帶電性質(zhì)、細(xì)胞膜的通透性、穩(wěn)定性和膜對物質(zhì)的吸收能力，進(jìn)而影響微生物的生長及生理代謝，影響微生物產(chǎn)生代謝產(chǎn)物低溫β-甘露聚糖酶。

圖9 起始pH對菌株WYQ-01產(chǎn)酶的影響

2.3.5 接種量對產(chǎn)酶的影響

分別以1%、3%、5%、7%和10%接種量將種子接種于裝液量為100 mL的產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，25℃pH 7.0 160 r/min振蕩培養(yǎng)28 h后測酶活。由圖10可知，在接種量為1 %～3 %時，隨著接種量的增加，產(chǎn)酶量逐漸增加，酶活逐漸升高，3 %時酶活力最高，為1981.147 U/mL。接種量在5 %～10%時，隨著接種量增大，產(chǎn)酶量減少，酶活力降低，是因為菌體數(shù)量過多，菌體的生長及繁殖速度較快，營養(yǎng)物質(zhì)快速消耗，致使在產(chǎn)酶階段營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足，產(chǎn)酶量減少，酶活力降低，因此菌株WYQ-01產(chǎn)酶的最佳接種量為3 %。

圖10 接種量對菌株WYQ-01產(chǎn)酶的影響

3 結(jié)論

以大連星海公園海水、海泥為樣品，通過以魔芋粉為唯一碳源的鑒別培養(yǎng)基篩選生產(chǎn)低溫β-甘露聚糖酶菌株，得到產(chǎn)酶高穩(wěn)定性好的1株菌，據(jù)個體生物學(xué)特性和菌落特征初步分類鑒定為細(xì)菌，將其命名WYQ-01。菌株為桿菌，長2 μm、寬0.6 μm，革蘭氏陰性。菌株形成的單菌落表面光滑、濕潤、易于挑取、邊緣整齊、邊緣與中間厚薄不一、不透明、乳白色、直徑大小為0.8 cm。產(chǎn)生的低溫β-甘露聚糖酶為胞外酶，透明圈直徑大小為3 cm，透明圈與菌落直徑比為3:0.8。

從菌株產(chǎn)酶的單因素條件進(jìn)行研究：主要指產(chǎn)酶時間、溫度、裝液量、轉(zhuǎn)速、pH和接種量六個條件。實驗結(jié)果為：菌株WY-01培養(yǎng)28 h時酶活最高達(dá)2175.225 U/mL；最適產(chǎn)酶溫度25℃，酶活為2002.911 U/mL；最適裝液量為100 mL，酶活為2050.781 U/mL；最適振蕩轉(zhuǎn)速為160 r/min，酶活為2112.056 U/mL；最適產(chǎn)酶pH為7.0，酶活為2081.418 U/mL；最適接種量為3 %，酶活為1981.147 U/mL。在上述優(yōu)化后的條件下，WYQ-01菌株發(fā)酵生產(chǎn)低溫β-甘露聚糖酶酶活高達(dá)2275.265 U/mL。菌株WYQ-01在20℃時酶活是最適溫度25 ℃的80 %左右，10℃時的酶活是25℃的20%左右，表明菌株WYQ-01產(chǎn)生的低溫β-甘露聚糖酶在低溫環(huán)境中產(chǎn)酶量大、酶活力高且穩(wěn)定性較好，優(yōu)勢明顯。溫度35℃時酶活極速下降，體現(xiàn)出低溫在高溫下迅速失活的特性，該菌株產(chǎn)酶量大，酶活高是目前國內(nèi)張云光[16]研究低溫β-甘露聚糖酶的酶活70倍左右，具有潛在應(yīng)用前景。