miRNA- 21與器官損傷和纖維化的關(guān)系及研究進(jìn)展

王偉，方申存，張海濤，王彩英，張映銘

(1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬南京市胸科醫(yī)院 內(nèi)鏡中心, 江蘇 南京 210009； 2. 東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬

微小RNAs(microRNAs，miRNAs)是一類長(zhǎng)度20～25個(gè)核苷酸的高度保守、內(nèi)源性非編碼小RNA，廣泛存在于植物、線蟲及人類的細(xì)胞，通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因的表達(dá)，在生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞增殖分化、腫瘤發(fā)生發(fā)展等一系列病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。近年來(lái)，針對(duì)miRNAs的各類研究在表觀修飾相關(guān)研究中仍占相當(dāng)部分。眾多已知miRNAs中，miRNA- 21持續(xù)受到關(guān)注。人類miRNA- 21位于TMEM49基因17q23的內(nèi)含子脆性區(qū)域，前體- miRNA- 21以自身引導(dǎo)區(qū)進(jìn)行獨(dú)立轉(zhuǎn)錄后成為成熟miRNA- 21[1]。已有多項(xiàng)研究表明，miRNA- 21在腎癌[2]、結(jié)腸癌[3]、肺癌[4]、乳腺癌[5]、口腔癌[6]、胰腺癌[7]等多種類型惡性腫瘤中表達(dá)水平升高，并負(fù)性調(diào)控各抑癌基因，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，故又被稱為癌基因微小RNA(oncomiRNA)。后于結(jié)腸癌組織中發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)的miRNA- 21并非來(lái)源于癌實(shí)質(zhì)細(xì)胞，而是源于環(huán)繞癌細(xì)胞周圍的人成纖維細(xì)胞[3]，其機(jī)制是miRNA- 21參與調(diào)控了上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transtion,EMT)。近來(lái)更多研究發(fā)現(xiàn)，miRNA- 21參與了生物體各重要臟器損傷和纖維化的發(fā)生發(fā)展，作者擬對(duì)這方面內(nèi)容以及miRNA- 21檢測(cè)技術(shù)作一綜述，旨在為器官纖維化的臨床診治策略提供新的思路。

1 miRNA- 21與臟器損傷和纖維化

1.1 miRNA- 21與心臟損傷和纖維化

缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)是導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷凋亡和臨床心力衰竭的重要病因之一。近年有關(guān)研究證實(shí)miRNA- 21對(duì)I/R有重要影響。Ning等[8]發(fā)現(xiàn)，成年鼠I/R繼發(fā)心肌纖維化模型中miRNA- 21表達(dá)顯著升高，且不受血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)這一心肌細(xì)胞纖維化重要調(diào)控因子的影響，提示miRNA- 21通過(guò)非Ang依賴方式調(diào)控了心肌細(xì)胞纖維化。隨著近來(lái)缺血后適應(yīng)(ischemic postconditioning，IPost)概念的提出，Tu等[9]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IPost小鼠模型中miRNA- 21表達(dá)上升，IPost可縮小I/R所導(dǎo)致的左心室梗死范圍，防止心肌細(xì)胞凋亡，改善心功能，敲減miRNA- 21后上述效應(yīng)明顯削弱。研究發(fā)現(xiàn)miRNA- 21通過(guò)下游PTEN/Akt信號(hào)通路活化來(lái)減少心肌細(xì)胞凋亡，該效應(yīng)可被PI3K抑制劑LY294002所抑制。此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)表明miRNA- 21參與IPost并體現(xiàn)出對(duì)抗I/R心肌損傷導(dǎo)致心功能障礙的作用，有望作為缺血性心肌保護(hù)的備選治療靶標(biāo)。更有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA- 21的表達(dá)還受到抗心絞痛藥物曲美他嗪(trimetazidine，TMZ)的調(diào)節(jié)。TMZ藥理作用是通過(guò)保護(hù)心肌細(xì)胞在缺氧缺血狀態(tài)下的能量代謝，阻止胞內(nèi)ATP下降，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，從而改善左室功能。Liu等[10]體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)TMZ處理的右室心肌細(xì)胞(RV myocardial cells, RVMCs)miRNA- 21呈高表達(dá)，細(xì)胞凋亡數(shù)下降；如以miRNA- 21特異性抑制劑轉(zhuǎn)染RVMCs細(xì)胞株，則會(huì)削弱TMZ的保護(hù)作用；該試驗(yàn)提示miRNA- 21對(duì)TMZ可能具有負(fù)向反饋?zhàn)饔茫蚰茏鳛槿毖杂沂倚募」δ芩ソ叩脑u(píng)估標(biāo)記。

miRNA- 21與心臟纖維化的關(guān)系已由小鼠模型試驗(yàn)得到證實(shí)，研究發(fā)現(xiàn)miRNA- 21在正常心肌中呈現(xiàn)弱表達(dá)，但在心衰狀態(tài)下心肌細(xì)胞中呈高表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miRNA- 21集中富集表達(dá)于心肌成纖維細(xì)胞[11- 12]；miRNA- 21的過(guò)表達(dá)促使ERK- MAPK活化，表明miRNA- 21也是ERK- MARK的重要調(diào)節(jié)信號(hào)，這對(duì)于心肌成纖維細(xì)胞的生存和活化具有關(guān)鍵作用[13]。也有試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)主動(dòng)脈橫向狹窄(transverse aortic constriction,TAC)達(dá)到左室壓力超負(fù)荷狀態(tài)制作小鼠心肌纖維化模型后，對(duì)小鼠注射miRNA- 21特異性反義寡核苷酸調(diào)節(jié)SPRY1表達(dá)和MAP激酶活化，可改善心肌纖維化[12]。

在臨床診斷方面，Nishi等[14]檢測(cè)了29例心血管手術(shù)后并發(fā)房顫及心肌纖維化患者的心房組織標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)miRNA- 21表達(dá)明顯升高，且上升程度與心房心肌細(xì)胞纖維化程度具有相關(guān)性(r=0.508，P<0.05)，故認(rèn)為miRNA- 21可能作為心血管術(shù)后并發(fā)房顫和心肌纖維化的臨床生物標(biāo)記。楊壽娟等[15]發(fā)現(xiàn)冠心病患者外周血中miRNA- 21的表達(dá)水平與冠脈狹窄程度有正相關(guān)性，而急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)患者血miRNA- 21高表達(dá)的檢測(cè)敏感度為68.85%，與CK、CK- MB、cTnI診斷AMI具有相似敏感度，故認(rèn)為miRNA- 21有望作為AMI新的診斷指標(biāo)。

在疾病治療方面，Zhou等[16]以免疫磁珠分離制備純小鼠Sca- 1+干細(xì)胞，分為空白對(duì)照、上調(diào)miRNA- 21、下調(diào)miRNA- 21和陰性對(duì)照4組，進(jìn)行流式細(xì)胞儀、qRT- PCR、Transwell實(shí)驗(yàn)和MTT法檢測(cè)，進(jìn)行ATA- 4、MEF2C、TnI和βMHC分化相關(guān)基因的表達(dá)分析。結(jié)果表明：Sca- 1+干細(xì)胞分離制備成功(占總細(xì)胞數(shù)87.4%)，上調(diào)RNA- 21組的miRNA- 21表達(dá)水平明顯升高(均P<0.05)，且能調(diào)控表達(dá)增殖、遷徙和分化的下游基因如GATA- 4、MEF2c、β- MHC；直接上調(diào)MIRNA- 21可以促進(jìn)Sca- 1+干細(xì)胞增殖和遷移，幫助提高干細(xì)胞修復(fù)受損心肌的能力，該結(jié)果提示miRNA- 21有可能作為直接修復(fù)心肌細(xì)胞損傷和功能恢復(fù)的治療策略之一。

1.2 miRNA- 21與腎臟損傷和纖維化

腎臟纖維化是由各種急慢性腎病或體內(nèi)外致病因素刺激，導(dǎo)致腎固有細(xì)胞受損，后期大量膠原沉積造成腎實(shí)質(zhì)硬化、瘢痕形成，腎臟完全喪失功能的病理狀態(tài)，臨床尚缺乏特效治療。近來(lái)不少文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)miRNA- 21參與調(diào)控腎纖維化的發(fā)生發(fā)展。Bao等[17]發(fā)現(xiàn)IgA腎病患者的腎小球足細(xì)胞和小管間質(zhì)細(xì)胞中miRNA- 21表達(dá)明顯升高，PTEN表達(dá)下降，Akt磷酸化水平增高，出現(xiàn)纖維化病理改變，特異性抑制miRNA- 21則上述效應(yīng)緩解。Lu等[18]制作小鼠糖尿病模型，結(jié)果顯示高葡萄糖培養(yǎng)狀態(tài)下的鼠腎小球系膜細(xì)胞miRNA- 21表達(dá)升高，隨之Ⅰ型膠原發(fā)生沉著，腎間質(zhì)出現(xiàn)明顯纖維化；特異性抑制miRNA- 21后，下游PTEN、Akt、mTOR信號(hào)表達(dá)受抑制，上述效應(yīng)明顯減輕。該實(shí)驗(yàn)認(rèn)為miRNA- 21通過(guò)PTEN/Akt/mTOR軸，促進(jìn)DN腎小球系膜細(xì)胞增殖并繼發(fā)纖維化，故考慮miRNA- 21可作為反映病情嚴(yán)重程度的一個(gè)有效標(biāo)記物。Zhou等[19]觀察單側(cè)輸尿管梗阻的小鼠模型發(fā)現(xiàn)，腎后梗阻病變?cè)缙谀I小管細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換和胞外基質(zhì)的沉積僅呈局部、零散樣分布，但很快纖維化病變即擴(kuò)大加劇，這一改變單以腎后梗阻、腎小管壓力高并不能解釋。進(jìn)一步探究發(fā)現(xiàn)已損傷的腎小管細(xì)胞可自身分泌miRNA- 21，通過(guò)微囊泡形式傳送至其它小管細(xì)胞，這提示腎小管上皮細(xì)胞miRNA- 21的微囊泡傳遞可能是參與調(diào)控腎后性纖維化的一種新方式。miRNA- 21不僅在腎性、腎后性繼發(fā)纖維化中發(fā)揮影響，在腎缺血腎前性急性腎損傷中也呈現(xiàn)高表達(dá)。馬龍等[20]對(duì)小鼠腎I/R模型進(jìn)行miRNA篩選和驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)miRNA- 21在損傷20～30 min直至再灌注24 h后均維持高水平表達(dá)，與尿素氮(BUN)、中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(neutrophil gelatinase- associated lipocalin，NGAL)的變化趨勢(shì)一致，提示miRNA- 21可能作為腎I/R及早期纖維化的重要病情標(biāo)志。鐘瑜等[21]體外培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞(NRK- 52E)，采用TGF- β1誘導(dǎo)制作細(xì)胞纖維化模型，以骨形態(tài)發(fā)生蛋白- 7(bone morphogenetic protein- 7，BMP- 7)處理細(xì)胞，檢測(cè)纖維連接蛋白(fibronectin1，F(xiàn)N1)和miRNA- 21的表達(dá)。結(jié)果表明miRNA- 21和TGF- β1的表達(dá)與腎小管上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化程度呈正相關(guān)，該過(guò)程中BMP- 7和Smad1的表達(dá)上升，Smad6表達(dá)下降，提示miRNA- 21和BMP- 7上調(diào)促進(jìn)了腎小管上皮細(xì)胞EMT導(dǎo)致纖維化。Yu等[22]研究發(fā)現(xiàn)，體外TGF- β1可以誘導(dǎo)纖連蛋白(FN)分泌和NRK- 52E細(xì)胞株的凋亡，隨之miRNA- 21出現(xiàn)高表達(dá)并能改善FN分泌，對(duì)抗NRK- 52E細(xì)胞凋亡，敲減miRNA- 21后則失去此作用，此結(jié)果提示TGF- β1是miRNA- 21表達(dá)升高和FN分泌的強(qiáng)誘導(dǎo)劑，miRNA- 21也可反向作用于TGF- β1引起的細(xì)胞凋亡和FN分泌，故是調(diào)控腎纖維化發(fā)生發(fā)展的重要因素。

1.3 miRNA- 21與肺臟損傷和纖維化

肺纖維化是各種致病因素導(dǎo)致肺功能嚴(yán)重?fù)p害的常見疾病[23],業(yè)已發(fā)現(xiàn)下列miRNAs可能與肺纖維化相關(guān)，其中Let- 7d、miR- 200、miR- 15、miR- 29、miR- 146、miR- 154、miR- 23a、miR- 26a/b等在肺纖維化進(jìn)程中表達(dá)下調(diào)；而miRNA- 21、miR- 155等是少數(shù)表達(dá)上調(diào)的miRNAs[24- 25]。與其它肺纖維化相關(guān)的miRNAs相比，miRNA- 21具有如下特點(diǎn)：(1)在肺纖維化動(dòng)物模型及纖維化組織中均出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)[26- 28]；(2)肺成纖維細(xì)胞內(nèi)TGFβ1能以劑量、時(shí)間依賴的方式上調(diào)miRNA- 21；后者過(guò)表達(dá)又可反饋性增強(qiáng)肺纖維母細(xì)胞內(nèi)TGF- β1的促纖維化作用，與TGF- β1形成前饋環(huán)路導(dǎo)致肺纖維化效應(yīng)的放大，促進(jìn)EMT，細(xì)胞外基質(zhì)不斷沉積，最終引起肺纖維化[1,29- 31]，故miRNA- 21的表達(dá)水平變化可能反映肺纖維化發(fā)生和發(fā)展的動(dòng)態(tài)進(jìn)程；(3)Li等[32]采用qRT- PCT法檢測(cè)65例特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary interstitial fibrosis，IPF)患者血清miRNA- 21，結(jié)果提示IPF患者血清miRNA- 21明顯高于健康對(duì)照組，且與用力肺活量(forced vital capacity，F(xiàn)VC)和影像改變具有相關(guān)性，而同在IPF動(dòng)物模型中上調(diào)的miRNA- 155卻未見類似臨床上改變，提示miRNA- 21在人肺纖維化進(jìn)程中扮演重要角色，有望作為人肺纖維化的臨床評(píng)估標(biāo)記。Pandit等[33]發(fā)現(xiàn)miRNA- 21、miRNA- 155在IPF患者病變組織中均上調(diào)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示特異性抑制miRNA- 21可減輕小鼠肺纖維化，抑制miRNA- 155和miRNA- 29表達(dá)卻僅能在體外發(fā)揮類似作用，表明miRNA- 21更適宜作為評(píng)估IPF病情嚴(yán)重程度和預(yù)后的一種穩(wěn)定可測(cè)生物標(biāo)記。

1.4 miRNA- 21與肝臟損傷和纖維化

肝纖維化是對(duì)各種因素引起慢性肝臟損傷的一種代償性反應(yīng)，輕度者可逆轉(zhuǎn)，如刺激因素持續(xù)則易繼發(fā)肝硬化。Zhao等[34]檢測(cè)發(fā)現(xiàn)肝硬化患者血清和病變肝組織的miRNA- 21表達(dá)水平顯著升高，與EMT和纖維化程度相關(guān)；此時(shí)小鼠肝硬化模型中的肝星狀細(xì)胞SPRY2和HNF4α表達(dá)下調(diào)，該效應(yīng)受miRNA- 21負(fù)向調(diào)控，故miRNA- 21也可作為肝纖維化病情標(biāo)記和干預(yù)治療的潛在靶標(biāo)。血吸蟲感染是導(dǎo)致肝纖維化的重要病因之一，He等[35]通過(guò)用高嗜肝腺病毒血清型8(recombinant AAV8，rAAV8)處理血吸蟲小鼠肝纖維化模型，發(fā)現(xiàn)IL- 13和TGF- β1可誘導(dǎo)miRNA- 21表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)肝星狀細(xì)胞活化，進(jìn)一步導(dǎo)致肝纖維化；如持續(xù)、有效地抑制miRNA- 21的過(guò)表達(dá)，則可逆轉(zhuǎn)以Smad7蛋白表達(dá)增強(qiáng)為特征的肝纖維化。

1.5 miRNA- 21與其它器官組織纖維化

miRNA- 21除參與調(diào)控上述重要臟器損傷和纖維化的發(fā)生發(fā)展外，Tong等[36]研究發(fā)現(xiàn)miR- 21調(diào)控甲狀腺相關(guān)眼病(thyroid- associated ophthalmopathy，TAO)繼發(fā)后期纖維化的機(jī)制。研究所用眼眶成纖維細(xì)胞來(lái)源于26例TAO患者和10例志愿者捐贈(zèng)培養(yǎng)而成，試驗(yàn)觀察細(xì)胞增殖、凋亡和分化，檢測(cè)分析miRNA- 21、TGF- β1的表達(dá)以及由TGF- β1誘導(dǎo)而產(chǎn)生的膠原含量。結(jié)果表明，TAO組細(xì)胞miRNA- 21表達(dá)明顯高于對(duì)照組，miR- 21可促進(jìn)TAO眼眶成纖維細(xì)胞的增殖、分化，減少其凋亡。不僅如此，miR- 21的過(guò)表達(dá)也促進(jìn)了Ⅰ型膠原mRNA的表達(dá)和膠原總量的增加。同時(shí)，miRNA- 21通過(guò)促進(jìn)Smad3磷酸化反饋性活化TGF- β1/Smad信號(hào)通路，使得TAO眼病的纖維化程度進(jìn)一步加重。

2 miRNA- 21在臨床診斷和治療中的研究進(jìn)展

上述表明，miRNA- 21可以作為幫助診斷、評(píng)估病情和預(yù)后的生物標(biāo)記物。然而，盡管高通量芯片(包括固相微陣列芯片和luminex- xMAP液態(tài)芯片)技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和經(jīng)典Northern印跡技術(shù)等已為人周知，但臨床纖維化患者體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜多變，如何快速、高選、超靈敏、穩(wěn)定地檢測(cè)出目標(biāo)miRNA仍有待技術(shù)手段層面的進(jìn)一步研究。近年來(lái)納米技術(shù)迅速發(fā)展，在miRNA- 21的檢測(cè)方面更趨深入。Kor等[37]采用高特異性結(jié)構(gòu)響應(yīng)的雙功能硫醇和生物素設(shè)計(jì)制作與納米金共軛的寡核苷酸探針，測(cè)試模擬生物體內(nèi)源的miRNAs-miRNA mimics，不僅提高miRNA- 21的檢測(cè)靈敏度，也可增強(qiáng)內(nèi)源性miRNA的功能。Zhu等[38]報(bào)道了一種新穎的兩步法構(gòu)建金納米棒的官能化的聚二乙炔(PDA)微管進(jìn)行miRNA- 21的檢測(cè)。該方法利用波導(dǎo)性質(zhì)、調(diào)整激發(fā)和耦合位置減少生物樣品的自體熒光，經(jīng)位移反應(yīng)、冷凝集富集法等選出高同源性miRNA- 21 PDA微管系統(tǒng)，檢測(cè)精度最低為0.01 nm，可直接應(yīng)用于人體血清中特異性miRNA的檢出，安全有效、攜帶方便。Miao等[39]則針對(duì)miRNA- 21采用氧化還原劑和銥合成催化一種DNA復(fù)合物，以亞甲藍(lán)標(biāo)記后制成探針修飾到納米金粒子表面，通過(guò)電化學(xué)信號(hào)變化和生物分析傳感器可超靈敏地測(cè)出miRNA- 21(FM1.6)，該方法也適宜于人血清樣品。Fang等[40]采用一種鋅指蛋白(jasmonate ZIM- domain ZNF346, JAZ ZNF346)選擇性結(jié)合的DNA捕獲探針，能將miRNA- 21與DNA- RNA形成“三明治”形式結(jié)合，達(dá)到超靈敏度和高特異性的檢測(cè)效果，該方法對(duì)miRNA- 21的10倍稀釋的血清檢測(cè)范圍是2～30 FM，易于擴(kuò)增，是檢測(cè)體液miRNA- 21的一種可行方式。Rafiee等[41]嘗試采用單鏈DNA成功固定探針和雜交的靶miRNA序列，通過(guò)電化學(xué)阻抗(EIS)譜、循環(huán)伏安法(CV)、微分脈沖伏安法(DPV)技術(shù)記錄氧化亞甲藍(lán)的時(shí)段峰值電流增加幅度。據(jù)此測(cè)出的miRNA- 21相對(duì)低限是84.3 FM。miRNA- 21主要通過(guò)與mRNAs直接作用抑制翻譯或去穩(wěn)定化，導(dǎo)致miRNAs失調(diào)，引發(fā)多種疾病。目前使用較廣的經(jīng)化學(xué)修飾的反義寡核苷酸鏈(antisense oligonucleotides, ASO)雖可直接抑制miRNA功能，但其細(xì)胞膜穿透力差，且會(huì)在內(nèi)涵體中聚集，脫靶率高，因此發(fā)展化學(xué)小分子抑制劑對(duì)于調(diào)控miRNA的功能有重要意義。Yan等[42]報(bào)道了他們所設(shè)計(jì)的雙功能小分子抑制劑，這里所指的雙功能之一是可以高特異性與pre- miRNA結(jié)合，另一則是Dicer酶的小分子抑制劑，當(dāng)與Dicer達(dá)到一定距離時(shí)則可有效抑制酶活性，阻止miRNA的生物合成。該研究選擇miRNA- 21為研究對(duì)象，利用kanamycin的衍生物KOF為標(biāo)準(zhǔn)pre- miRNA- 21的結(jié)合小分子，通過(guò)熒光偏振法篩選到能和pre- miRNA- 21結(jié)合的小分子NF，同時(shí)選擇了一個(gè)Dicer的小分子抑制劑，將兩部分結(jié)合并合成雙功能miRNA- 21的小分子抑制劑，經(jīng)過(guò)在HEK293T細(xì)胞中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)可有效抑制miRNA- 21的產(chǎn)生。

3 總結(jié)和展望

上述研究表明，miRNA- 21在臟器損傷和纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制大致如下：各種損傷因素包括TGF- β等誘導(dǎo)—miRNA- 21表達(dá)上調(diào)—下游以PTEN為代表的蛋白和信號(hào)分子活化—調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞或其它效應(yīng)細(xì)胞的凋亡、增殖、活化、分化、遷移等表型改變—產(chǎn)生EMT/EndMT，基質(zhì)和膠原增多沉積等各種前纖維化病理改變，最終導(dǎo)致臟器纖維化。在此過(guò)程中，miRNA- 21和部分下游因子還可反饋調(diào)控TGF- β等誘導(dǎo)物，形成復(fù)雜的分子間“對(duì)話”(crosstalk)網(wǎng)絡(luò)，這些表明miRNA- 21對(duì)臟器損傷和纖維化具有重要調(diào)控作用。近年來(lái)由于檢測(cè)和干預(yù)技術(shù)方法的發(fā)展，miRNA- 21不僅能夠用于臨床診斷、評(píng)估病情，也有望進(jìn)一步臨床轉(zhuǎn)化，成為纖維化疾病未來(lái)的治療靶標(biāo)。

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