固相微萃取結(jié)合氣-質(zhì)聯(lián)用確定北京干黃醬中關(guān)鍵香氣成分

趙星賀，黃佳，劉玉平*

1(清華大學(xué)附屬中學(xué)朝陽學(xué)校，北京，100027) 2(北京工商大學(xué) 食品學(xué)院，北京，100048)

香氣是食品與調(diào)味品的重要感官指標(biāo)，目前關(guān)于北京干黃醬的香氣研究的文獻(xiàn)報道較少。石華治等采用同時蒸餾萃取法 (simultaneous distillation and extraction，SDE)提取了天源醬園中揮發(fā)性成分，經(jīng)過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)分析，共鑒定出33種成分[1]；苗志偉等采用相同的方法提取與分析了5種干黃醬中的揮發(fā)性成分，鑒定出69種成分[3]；劉永國等采用水蒸氣蒸餾(steam distillation，SD)提取結(jié)合氣-質(zhì)聯(lián)機(jī)分析了干黃醬中揮發(fā)性成分，從中共鑒定出38種成分[4]。采用SDE與SD提取揮發(fā)性成分時，樣品與水混合加熱，會生成某些新成分。由于固相微萃取(solid phase microextraction，SPME)具有樣品用量少、操作簡便、使用成本低、快速、不用溶劑等優(yōu)點(diǎn)[5]，近年來在提取醬類調(diào)味品中的揮發(fā)性成分中得到普遍使用[6-7]。目前關(guān)于干黃醬中香氣成分的報道主要是關(guān)于其中所含的揮發(fā)性成分，這些成分是否具有香氣活性，是否是干黃醬的關(guān)鍵香氣成分尚未進(jìn)行確定。本文采用固相微萃取法提取北京產(chǎn)干黃醬中的揮發(fā)性成分，利用氣相色譜-質(zhì)譜-嗅聞聯(lián)用儀(GC-MS-O)對其中的揮發(fā)性成分及香氣活性物質(zhì)進(jìn)行鑒定，利用香氣活性值確定其中的關(guān)鍵香成分，以期為生產(chǎn)企業(yè)改進(jìn)生產(chǎn)工藝提供參考。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

仙源牌干黃醬(原料：非轉(zhuǎn)基因大豆、水、小麥粉、食用鹽、食品添加劑-山梨酸鉀)，凈含量250 g，塑料袋包裝，北京通州釀造廠生產(chǎn)，生產(chǎn)日期2017年7月13日；C6～C30正構(gòu)烷烴(色譜純)，美國Supelco公司；苯乙醇、麥芽酚、乙酸、3-甲基丁酸、2-甲基丁酸乙酯、3-甲基丁醛、壬醛、3-甲硫基丙醛、2,3-丁二酮、2-乙?；秽?、二甲基三硫和2-甲氧基苯酚(均為分析純)，北京百靈威科技有限公司；丙酸乙酯與辛醛(分析純)，北京華威銳科化工有限公司；苯乙醛和1-辛烯-3-酮(分析純)，上海麥克林生化科技有限公司；2-甲基丙酸乙酯(分析純)，adamas公司；丁酸乙酯(分析純)，梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；茴香腦(分析純)，上海源葉生物科技有限公司；甲硫醇(質(zhì)量濃度為2 000 μg/mL的甲苯溶液)，Accu Standard公司。

1.2　儀器與設(shè)備

7890B氣相色譜-5977A質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷侖公司，，-sniffer3000嗅覺檢測器，德國Gerstel公司；2 cm長50 μm/30 μm DVB/CAR/PDMS (灰色)萃取纖維、手動固相微萃取手柄，美國Supleco公司；DF-lO1S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器責(zé)任有限公司。

1.3　實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1固相微萃取法提取干黃醬中的揮發(fā)性成分

在40 mL固相微萃取專用瓶中依次加入10 g干黃醬、15 mL飽和食鹽水和30 μL(質(zhì)量濃度為56.872 5 μg/L)的內(nèi)標(biāo)2-辛醇，在45 ℃水浴中平衡20 min。將2 cm長的灰色萃取纖維在GC-MS的氣相色譜儀進(jìn)樣口中在250 ℃下老化至無雜峰，將萃取纖維插入裝有干黃醬的固相微萃取專用瓶中，吸附40 min；拔出萃取纖維，插入氣相色譜儀進(jìn)樣口中，在250 ℃下解吸附5 min。

1.3.2GC-MS分析條件

氣相色譜條件：使用DB-WAX(30.0 m×250 μm，0.25 μm)極性色譜柱；采用程序升溫，起始溫度為40 ℃，保持2 min，以8 ℃/min 的速率升至80 ℃，之后以4 ℃/min 的速率升至100 ℃，最后以6 ℃/min 的速率升至230 ℃，保持5 min；載氣He，載氣流量1.0 mL/min。

共和縣處于藏區(qū)，人們的飲食習(xí)慣主要是面食、青稞炒面以及肉類為主，對于蔬菜的需求量不是太大。2017年，共和縣蔬菜產(chǎn)量分布如下：

質(zhì)譜條件：電子電離(EI)源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，掃描模式為Scan，掃描質(zhì)量范圍33～350 u。

嗅覺檢測器條件：從色譜柱流出的餾分以1∶1的體積比分別進(jìn)入嗅覺檢測器和質(zhì)譜檢測器，傳輸線的溫度是250 ℃。嗅聞口溫度220 ℃。

1.3.3正構(gòu)烷烴保留時間的確定及保留指數(shù)的計算

取0.2 μL C7～C30正構(gòu)烷烴的正己烷溶液，在1.3.2的GC-MS條件下進(jìn)行分析，得到C6～C30正構(gòu)烷烴的保留時間，用于保留指數(shù)的計算。保留指數(shù)按公式(1)計算：

(1)

式中:tn為具有n個碳原子的正構(gòu)烷烴的保留時間；t(n+1)為具有(n+1)個碳原子的正構(gòu)烷烴的保留時間；ti為待測組分的保留時間, 且tn

1.4　定性定量分析

定性分析：揮發(fā)性成分的定性采用質(zhì)譜、保留指數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)品3種方法。

定量分析：采用2-辛醇為內(nèi)標(biāo)，進(jìn)行半定量，香氣活性成分的含量(μg/kg)按公式(2)計算：

(2)

2　結(jié)果與分析

2.1　揮發(fā)性成分與香氣活性物質(zhì)的鑒定

經(jīng)過萃取纖維萃取得到的揮發(fā)性成分經(jīng)GC-MS-O分析，得到的總離子流圖如圖1所示，通過計算保留指數(shù)、檢索NIST11L譜庫、采用標(biāo)準(zhǔn)品對有香氣活性的物質(zhì)進(jìn)行比對，具體鑒定結(jié)果見表1。

圖1　通過固相微萃取提取到的北京干黃醬中揮發(fā)性成分總離子流圖Fig.1　Total ion chromatogram of volatile components inBeijing dry yellow soybean sauce obtained by SPME

從表1可以看出，共鑒定出53種成分，其中醇類7種，酸類6種，酯類9種，醛類10種，酮類8種，吡嗪類5種，含硫化合物4種，酚類2種，其他2種。在這些成分中有44種在質(zhì)譜檢測器上有響應(yīng)，有20種在嗅覺檢測器上能夠被嗅聞到；兩種檢測器都能檢測到的有11種。

從目前對醬的風(fēng)味成分分析的文獻(xiàn)報道可以看到，它們基本上都是報道醬中的揮發(fā)性成分[1,3,4,6,8-9]，而關(guān)于其中的香氣活性成分(即通過嗅覺檢測器能夠嗅聞到的成分)的報道則很少[10-11]。從表1可知，揮發(fā)性成分的含量多少不是判別該成分是否是重要香氣成分的決定因素，鑒定出來的多數(shù)揮發(fā)性成分不是香氣活性物質(zhì)；鑒定出來的香氣活性物質(zhì)中有一半以上的成分在質(zhì)譜檢測器上沒有響應(yīng)，因此只根據(jù)GC-MS的結(jié)果判斷某一成分是否對香氣有貢獻(xiàn)是很片面的。如何對這些具有香氣活性而在質(zhì)譜檢測器上沒有響應(yīng)(在總離子流圖上沒有色譜峰)的成分進(jìn)行定量，需要進(jìn)行深入研究。

嗅聞干黃醬樣品時，能夠嗅聞到醬香、焦糖香、甜香、酸香、煙熏香、腌咸菜等，這些香氣屬性與鑒定出來的香氣活性物質(zhì)是相關(guān)的，如3-甲硫基丙醛賦予了干黃醬醬香，它在水中的香氣閾值很低(0.43 μg/kg[12])，極易被嗅覺檢測到；麥芽酚與2-甲基丁醛賦予了干黃醬焦糖香;酸香是由乙酸與3-甲基丁酸賦予的;2-甲氧基苯酚賦予了干黃醬煙熏香;二甲基三硫賦予了腌咸菜的氣息。在樣品中鑒定出5種吡嗪類化合物，都沒有嗅聞到它們的香氣。由于在分析過程中為了鑒定每種成分采用氣相色譜將它們分開，可能由于每種成分的閾值較高且含量低，不能被嗅覺檢測到；而在實(shí)際樣品中它們混合在一起以后某種香氣屬性的閾值可能達(dá)到嗅覺的檢測范圍，對干黃醬的香氣具有一定貢獻(xiàn)。對于表1中鑒定出來的一類物質(zhì)都沒有被嗅聞到它們的香氣的，在以后的研究中將采用添加實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步確定它們對干黃醬的香氣貢獻(xiàn)大小。

續(xù)表1

類型保留時間/min化合物名稱CAS號匹配度保留指數(shù)計算值文獻(xiàn)值定性方法含量μg/kg嗅聞到的香氣特征吡嗪類10.76甲基吡嗪109-08-09012491256MS,RI20.22-12.172,5-二甲基吡嗪123-32-09113081314MS,RI10.90-12.322,6-二甲基吡嗪108-50-98713151320MS,RI42.82-13.732-乙基-6-甲基吡嗪13925-03-68613721382MS,RI4.52-14.20三甲基吡嗪14667-55-19113911395MS,RI18.21-5種96.67含硫類2.56甲硫醇74-93-1679675RI,S,O臭蘿卜2.81二甲基硫醚75-18-394736746MS,RI44.82-6.75二甲基二硫624-92-09710571071MS,RI,S45.61-13.56二甲基三硫3658-80-89013651378MS,RI,S,O7.84腌咸菜4種98.27酚類23.172-甲氧基苯酚90-05-19618301823MS,RI,S,O91.84煙熏香25.56苯酚108-95-29419711973MS,RI12.27-2種104.11其他類9.31D-檸檬烯5989-27-5991186MS11.11-22.72茴香腦104-46-19318041815MS,RI4.87茴香2種15.98

注：表中MS表示質(zhì)譜定性，RI表示保留指數(shù)定性(保留指數(shù)的文獻(xiàn)值來自http://webbook.nist.gov/chemistry/cas-ser.html)，S表示采用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定性，O表示通過比對與標(biāo)準(zhǔn)品的香氣定性；“-”表示沒有嗅聞到香氣。

鑒定出來的這些揮發(fā)性成分主要有以下5種生成途徑：一是通過微生物新陳代謝所產(chǎn)生。在制作干黃醬時，微生物代謝會產(chǎn)生一些揮發(fā)性成分(或者微生物釋放出一些能夠分解原料產(chǎn)生揮發(fā)性成分的酶)，如乳酸菌會代謝出乙酸[13]；二是通過不飽和脂肪酸的降解產(chǎn)生。制作干黃醬的原料大豆中含有油酸、亞油酸、亞麻酸等不飽和脂肪酸[14]，這些不飽和脂肪酸可以發(fā)生氧化降解生成己醛、辛醛、壬醛、1-辛烯-3-酮等[15]；三是氨基酸的降解。制作干黃醬的原料大豆和小麥粉中都含有氨基酸，氨基酸發(fā)生降解產(chǎn)生了揮發(fā)性成分，如3-甲基丁醛可由亮氨酸降解產(chǎn)生[11]，3-甲硫基丙醛和甲硫醇可由蛋氨酸降解產(chǎn)生[16]；四是通過美拉德反應(yīng)產(chǎn)生。鑒定出來的吡嗪、吡咯、呋喃類化合物都可以通過美拉德反應(yīng)產(chǎn)生[17-18]；五是通過原料揮發(fā)性成分之間的反應(yīng)產(chǎn)生。有的微生物代謝會產(chǎn)生脂肪酶，脂肪酶催化醇與酸的反應(yīng)，產(chǎn)生酯類揮發(fā)性成分；六是原料帶入。生產(chǎn)醬時會使用少量的辛香料，由此帶入一些揮發(fā)性成分，如鑒定出來的茴香腦和檸檬烯可能就是由此。

目前文獻(xiàn)報道的提取北京干黃醬中的揮發(fā)性成分所用的方法是SDE[1,3]與SD[4]，從SDE提取物中鑒定出來的揮發(fā)性成分中酯類最多(有22種，只有乙酸乙酯、十六酸甲酯和十六酸乙酯3種在SPME提取物中鑒定出來)，而未鑒定出脂肪醇類物質(zhì)[3]，在鑒定出的酯類中有一半以上為高級脂肪酸的低級醇酯，這與采用SDE提取揮發(fā)性成分時加熱有關(guān)；加熱會有利于一些沸點(diǎn)相對較高的成分的提取，同時也會使一些成分變化(如醇與酸反應(yīng)生成酯，醇氧化生成醛或酸)；在SPME提取物中鑒定出來的酯類主要是分子量較低的脂肪酸的乙酯。從SD提取物中鑒定出來的38種揮發(fā)性成分中醛類和酸各有10種[4]，在這20種成分中只有8種在SPME提取物也鑒定出來。在SPME的提取物中鑒定出來的甲硫醇、二甲基硫醚和二甲基三硫在SDE和SD中都沒有鑒定出來，甲硫醇、二甲基硫醚沸點(diǎn)較低，在SDE與SD提取過程中隨著溶劑的去除它們也被去除了；二甲基三硫不穩(wěn)定，受熱容易脫硫生成二甲基二硫。

2.2　關(guān)鍵香氣成分的確定

通過采用GC-MS-O可以從眾多揮發(fā)性成分中篩選出香氣活性成分，為了確定關(guān)鍵香氣成分，需要計算香氣活性物質(zhì)的香氣活性值(odor activity value, OAV)。香氣閾值是指香氣活性物質(zhì)能夠被人的嗅覺所能嗅聞到的最低濃度；香氣活性值是指香氣活性物質(zhì)的濃度與其香氣閾值的比值，只有那些OAV大于1的香氣活性物質(zhì)才是關(guān)鍵香氣成分[19]。為了確定干黃醬中的關(guān)鍵香成分，計算了香氣活性物質(zhì)的OAV，所得結(jié)果如表2所示。

表2　北京干黃醬中香氣活性物質(zhì)的香氣活性值Table 2　Odor activity values of aroma-active compoundsin Beijing dry yellow soybean sauce

從表2所得結(jié)果可知，鑒定出來的香氣活性物質(zhì)中多數(shù)為關(guān)鍵香氣成分，它們對干黃醬的特征香氣起到了重要作用，其中3-甲基丁醛具有最高的OAV(為2 642.4)，其次為二甲基三硫與2-甲氧基苯酚，它們的OAV分別為791.9和109.3。

2.3　非香氣活性成分的香氣活性值的計算

為了確定干黃醬中鑒定出來的非香氣活性物質(zhì)中是否有OAV大于1的物質(zhì)，計算了沒有嗅聞到香氣的揮發(fā)性成分的OAV，所得結(jié)果見表3。

從表3可知，33種未被嗅聞到香氣的揮發(fā)性成分中，有20種成分的閾值有文獻(xiàn)報道，經(jīng)過計算只有3種成分的OAV大于1，這3種成分分別是二甲基硫醚、二甲基二硫醚和己醛；它們的OAV大于1，而沒有被嗅聞到香氣的主要原因有以下3點(diǎn)，一是文獻(xiàn)報道的閾值測定方法不同，所得結(jié)果有一定差別，如在文獻(xiàn)[22]中報道的己醛的閾值為4.1～22.8 μg/kg，而文獻(xiàn)[12]中報道的是2.4 μg/kg；二是揮發(fā)性香成分的閾值大小與其所在基質(zhì)關(guān)系很大，為了便于比較在此選用的都是在水中的閾值，該閾值小于在實(shí)際食品基質(zhì)中的閾值；三是揮發(fā)性成分通過氣相色譜進(jìn)行分離時，有時會出現(xiàn)餾分共流出現(xiàn)象，如果共流出的香氣成分之間發(fā)生相互抑制[24]，香氣強(qiáng)度會減弱，不能被嗅聞到。這3種成分是否是干黃醬的關(guān)鍵香氣成分，尚需進(jìn)一步研究。

表3　北京干黃醬中非香氣活性物質(zhì)的香氣活性值Table 3　Odor activity values of non-aroma-activecompounds in Beijing dry yellow soybean sauce

注：“-”表中沒有查找到該成分的閾值。

3　結(jié)論

采用固相微萃取結(jié)合GC-MS-O，對北京干黃醬中的揮發(fā)性成分進(jìn)行提取與分析，共鑒定出53種成分，其中醇類7種，酸類6種，酯類9種，醛類10種，酮類8種，吡嗪類5種，含硫化合物4種，酚類2種，其他2種。在鑒定出來的53種成分中具有香氣活性的物質(zhì)有20種。經(jīng)過計算，香氣活性物質(zhì)的活性值確定出3-甲基丁醛、二甲基三硫、2-甲氧基苯酚、苯乙醛、丁酸乙酯、壬醛和3-甲基丁酸為干黃醬的關(guān)鍵香氣成分。

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