響應(yīng)曲面法優(yōu)化酵母β-葡聚糖酶解工藝及產(chǎn)物分析

范紅梅，汪建明*，劉力

1(天津科技大學(xué) 食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津,300457) 2(北京彬原原商貿(mào)有限公司，北京,101111)

酵母β-葡聚糖是從啤酒酵母的細胞壁中提取的聚合物,具有增強哺乳動物免疫活力，抗感染，促進傷口愈合的功能，是一種生物效應(yīng)應(yīng)答劑[1-4]。但是酵母β-葡聚糖特殊的分子結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其溶解性差，降低了其在食品中的應(yīng)用。為解決這一問題，目前國內(nèi)外的學(xué)者對酵母β-葡聚糖進行了化學(xué)改性、物理改性和生物改性的研究[5-7]。生物改性方法主要是通過酶解作用降低酵母β-葡聚糖的分子量，從而提高溶解度。KERY[8]等人曾對酵母β-葡聚糖進行水解，但得率較低。酵母β-葡聚糖酶作用于酵母β-葡聚糖的糖苷鍵，使其糖苷鍵斷裂，降低酵母β-葡聚糖分子的聚合度，分子量減小，提高了酵母β-葡聚糖的溶解度。酵母β-葡聚糖酶包含的特異性內(nèi)切酶和外切酶分別作用于酵母β-葡聚糖分子的不同位點，將其降解為還原糖或寡糖[9]。酶解的效果受多種因素的影響，為了使酵母β-葡聚糖酶發(fā)揮最大活性，本試驗利用β-葡聚糖酶對酵母β-葡聚糖進行水解，考察了底物濃度、酶活濃度、反應(yīng)溫度和溶液pH對酶解反應(yīng)的影響,并對比了酵母β-葡聚糖和水溶性酵母β-葡聚糖的結(jié)構(gòu)和熱穩(wěn)定性的差異，為拓寬酵母β-葡聚糖的應(yīng)用范圍提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

酵母β-葡聚糖：唐山拓普生物科技有限公司；β-葡聚糖酶，酶活濃度為6 200 U/mL：丹尼斯克(中國)有限公司；標準酵母葡聚糖：Sigma公司；檸檬酸、磷酸氫二鈉、苯酚等均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2　儀器與設(shè)備

離心機，湘儀離心機儀器有限公司；RE-52AA循環(huán)水式旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；Lab-1B-50E真空冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；752型紫外可見分光光度計，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；HH-S4恒溫水浴鍋，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；GZX-9240MBE鼓風干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；IS50傅里葉紅外光譜儀，美國尼高利；Q50熱重分析儀，美國TA公司。

1.3　試驗方法

1.3.1酵母β-葡聚糖的酶解工藝

稱取酵母β-葡聚糖，分散在9 mL的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中，水浴鍋預(yù)熱10 min后加入β-葡聚糖酶。初始條件為底物質(zhì)量濃度1 g/dL、酶活濃度0.15 U/mL、溫度45 ℃、pH4.0。反應(yīng)1.5 h后沸水浴5 min滅酶活，3 500r/min 離心20 min，取上清液，得樣品，測可溶性總糖和還原糖。

1.3.2單因素試驗和響應(yīng)面試驗設(shè)計

其他條件不變，考察底物質(zhì)量濃度：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 g/dL；酶活濃度：0.05、0.10、0.15、0.20、0.30和0.40 U/mL；溫度：35、40、45、50、55和60 ℃；pH：3.0、3.5、4.0、4.5和5.0對水溶性酵母β-葡聚糖得率的影響。

依據(jù)單因素試驗和Box-Behnken的響應(yīng)面設(shè)計，確定水溶性酵母β-葡聚糖得率最大的條件，并進行驗證試驗，試驗表如表1。

表1　響應(yīng)面試驗因素水平表Table 1　Independent variable values

1.3.3酶解液中可溶性總糖含量的測定

按照苯酚-硫酸法[11]測定總糖的含量。

1.3.4酶解液中還原糖含量的測定

按照DNS法[10]測定還原糖的含量。

1.3.5水溶性酵母β-葡聚糖得率的計算[12]

反應(yīng)結(jié)束，酶解液經(jīng)3 500 r/min離心20 min，取1 mL上清液測其總糖和還原糖，計算水溶性酵母β-葡聚糖得率(公式(1))：

(1)

式中：m總為酶解液中總糖含量，g；m還為酶解液中還原糖含量，g；m0為添加酵母β-葡聚糖的質(zhì)量，g。

1.3.6酵母β-葡聚糖與水溶性酵母β-葡聚糖性質(zhì)分析

1.3.6.1熱重分析

將酵母β-葡聚糖和酶解后的水溶性酵母β-葡聚糖樣品置于熱重分析儀上，從室溫升至800 ℃，升溫速率為10 ℃/min，樣品質(zhì)量為3～4 mg，鉑坩堝，載氣為高純度氮氣，氣流量60 mL/min。

1.3.6.2紅外光譜分析

將酵母β-葡聚糖和酶解后水溶性酵母β-葡聚糖分別與KBr按質(zhì)量比1∶150混合壓片，進行紅外掃描，分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為16次，掃描區(qū)間4 000～400 cm-1。

2　結(jié)果與分析

2.1　水溶性酵母β-葡聚糖得率的影響因素

2.1.1底物質(zhì)量濃度對水溶性酵母β-葡聚糖得率的影響

固定酶濃度為0.15 U/mL，溫度為45 ℃，溶液pH為4.0，分別在0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 g/dL的梯度下，測得水溶性酵母β-葡聚糖得率(圖1)。由于β-葡聚糖酶的作用，酵母β-葡聚糖糖鏈發(fā)生斷裂，使不溶性的酵母β-葡聚糖水解為可溶性多糖。底物質(zhì)量濃度為1.0 g/dL時，水溶性酵母β-葡聚糖得率最大，當?shù)孜镔|(zhì)量濃度大于1.0 g/dL時，得率降低，這是由于β-葡聚糖具有強吸水性和持水性，隨著反應(yīng)體系中底物濃度的增大，溶液黏度也不斷增大，阻礙酶與底物接觸。因此，底物質(zhì)量濃度選擇1.0 g/dL為宜。

圖1　底物質(zhì)量濃度對水溶性酵母β-葡聚糖得率的影響Fig.1　Effects of substrate concentration on water-solubleyeast β-glucan yield

對每一個質(zhì)量濃度梯度的3組重復(fù)實驗數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果見表2。圖1標注的顯著性差異由Duncan法分析得到。由表2及圖1可知，底物質(zhì)量濃度為0.5 g/dL和2.0 g/dL的兩個處理間無顯著性差異，其他處理間存在顯著性差異。

表2　底物質(zhì)量濃度的方差分析Table 2　The analysis of variance table of substrateconcentration

2.1.2酶濃度對水溶性酵母β-葡聚糖得率的影響

固定底物質(zhì)量濃度為1.0 g/dL，溫度為45 ℃，溶液pH為4.0，分別在酶濃度0.05、0.10、0.15、0.20、0.30和0.40 U/mL的梯度下，測得水溶性酵母β-葡聚糖得率見圖2。由圖2可知，水溶性酵母β-葡聚糖得率隨著酶濃度的增大先增大后減小，在酶濃度為0.15 U/mL時可得率最大。隨著酶濃度的繼續(xù)增大，酶作用于已水解的葡聚糖，從而產(chǎn)生了大量的二糖、單糖等，導(dǎo)致水溶性酵母β-葡聚糖得率降低。因此，酶濃度選擇0.15 U/mL為宜。

圖2　酶濃度對水溶性酵母β-葡聚糖得率的影響Fig.2　Effects of enzyme concentration on water-solubleyeast β-glucan yield

對每一個濃度梯度的3組重復(fù)實驗數(shù)據(jù)進行方差分析，結(jié)果見表3，圖2標注的顯著性差異由Duncan法分析得到。由表3及圖2可知，酶濃度為0.05 U/mL和酶濃度為0.4 U/mL的兩個處理間無顯著性差異，酶濃度為0.05 U/mL和酶濃度為0.4 U/mL的兩個處理間無顯著性差異，酶濃度為0.1 U/mL和酶濃度為0.2 U/mL的兩個處理間無顯著性差異，其他處理間存在顯著性差異。

表3　酶濃度的方差分析Table 3　The analysis of variance table of enzymeconcentration

2.1.3溫度對水溶性酵母β-葡聚糖得率的影響

固定底物質(zhì)量濃度1.0 g/dL，酶活濃度0.15 U/mL，溶液pH為4.0，分別在溫度35、40、45、50、55和60 ℃的梯度下，測得水溶性酵母β-葡聚糖得率見圖3。由圖3可知，在45 ℃時水溶性酵母β-葡聚糖得率最大。隨著溫度升高，酶的活性降低，水溶性酵母β-葡聚糖的得率降低。

圖3　溫度對水溶性酵母β-葡聚糖得率的影響Fig.3　Effects of temperature on water-soluble yeastβ-glucan yield

對每一個溫度梯度的3組重復(fù)實驗數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果見表4，圖3標注的顯著性差異由Duncan法分析得到。由表4及圖3可知，溫度為50 ℃的處理與溫度為35 ℃和40 ℃的處理均無顯著性差異，其他處理間存在顯著性差異。

表4　溫度的方差分析Table 4　The analysis of variance table of temperature

2.1.4pH對水溶性酵母β-葡聚糖得率的影響

固定底物質(zhì)量濃度為1.0 g/dL，酶活濃度0.15 U/mL，溫度為45 ℃，分別在溶液pH為3.0、3.5、4.0、4.5和5.0的梯度下，測得水溶性酵母β-葡聚糖得率見圖4。由圖4可知，pH為4.0時水溶性酵母β-葡聚糖得率最大，當pH大于或小于4.0時影響酶促反應(yīng)速率，水溶性酵母β-葡聚糖得率下降。

圖4　pH對水溶性酵母β-葡聚糖得率的影響Fig.4　Effects of pH on water-soluble yeast β-glucan yield

對每一個pH梯度的3組重復(fù)實驗數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果見表5，圖4標注的顯著性差異由Duncan法分析得到。由表5及圖4可知，pH對水溶性酵母β-葡聚糖得率影響的處理間均存在顯著性差異。

表5　pH的方差分析Table 5　The analysis of variance table of pH

2.2　響應(yīng)面法優(yōu)化酵母β-葡聚糖酶解工藝

2.2.1響應(yīng)面模型分析

為了優(yōu)化酶解反應(yīng)工藝，在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取底物質(zhì)量濃度、酶活濃度、溫度和pH的最佳試驗范圍。依據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計原理，以水溶性酵母β-葡聚糖得率為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.0軟件設(shè)計了4因素3水平的響應(yīng)面試驗，共有29個試驗點。試驗設(shè)計和結(jié)果見表6，方差分析見表7。

表6　Box-Behnken設(shè)計方案及響應(yīng)值結(jié)果Table 6　Design and experimental results of RSM

利用軟件進行方差分析，可得到模型的二次多項回歸方程：

Y=39.90+0.96A+0.63B-0.90C+1.43D+1.95AB+0.68AC+0.88AD+0.50BC-0.57BD-2.5×10-3CD-2.85A2-2.44B2-2.24C2-1.98D2

式中：Y為水溶性酵母β-葡聚糖得率,%;A為底物濃度,g/dL;B為酶活濃度,U/mL;C為溫度,℃;D為pH。

該回歸模型的方差分析結(jié)果見表7，模型相關(guān)系數(shù)R2=0.919 8，響應(yīng)面回歸模型F值為11.46，顯著性檢驗p<0.000 1，表明模型極顯著；失擬項p為0.196 4>0.05，不顯著，表明實驗結(jié)果和數(shù)學(xué)模型擬合良好，因此可用該數(shù)學(xué)模型推測實驗結(jié)果。變異系數(shù)CV值為2.86%，變異系數(shù)較低，說明模型置信度高，響應(yīng)值水溶性酵母β-葡聚糖得率的變化有97.14%來源于變量(底物質(zhì)量濃度、酶活濃度、溫度和pH)，因此能夠較好地反映真實實驗值。各變量因素對水溶性酵母β-葡聚糖得率影響程度的大小順序依次為pH>底物質(zhì)量濃度>溫度>酶活濃度。

表7　回歸模型方差分析Table 7　Variance analysis of regression model

注：**表示p<0.01，差異極顯著；*表示p<0.05，差異顯著。

2.2.2因素交互作用分析

通過Design-Expert 8.0軟件對影響水溶性酵母β-葡聚糖得率的各因素之間的交互作用進行分析，繪制響應(yīng)面曲線圖，見圖5～10。通過圖可清晰地反映出響應(yīng)曲面的最高點以及各因素范圍間的交互作用對響應(yīng)值的影響。據(jù)此確定酵母β-葡聚糖的最佳酶解工藝條件。

由曲面彎曲的程度可知，底物濃度對可溶性多糖得率的影響最為顯著，其次是酶活濃度、溫度和pH。此外，酶活濃度和底物質(zhì)量濃度，pH和溫度，pH和酶活濃度以及pH和底物濃度的相互作用較為顯著，等高線為橢圓形。

圖5　底物質(zhì)量濃度和酶活濃度對水溶性酵母β-葡聚糖得率的交互影響Fig.5　Substrate concentration and enzyme activityconcentration on the yield of water-soluble yeast β-glucan

圖6　底物質(zhì)量濃度和溫度對水溶性酵母β-葡聚糖得率的交互影響Fig.6　Substrate concentration and temperature onthe yield of water-soluble yeast β-glucan

圖7　底物質(zhì)量濃度和pH對水溶性酵母β-葡聚糖得率的交互影響Fig.7　Substrate concentration and pH on the yield ofwater-soluble yeast β-glucan

圖8　酶活濃度和溫度對水溶性酵母β-葡聚糖得率的交互影響Fig.8　Enzyme activity concentration and temperatureon the yield of water-soluble yeast β-glucan

圖9　酶活濃度和pH對水溶性酵母β-葡聚糖得率的交互影響Fig.9　Enzyme activity concentration and pH on theyield of water-soluble yeast β-glucan

圖10　溫度和pH對水溶性酵母β-葡聚糖得率的交互影響Fig.10　Temperature and pH on the yield of water-solubleyeast β-glucan

2.2.3最佳優(yōu)化條件及驗證試驗

通過RSREG Procedure分析，可以產(chǎn)生一個最優(yōu)值，即底物濃度為1.18 g/100 mL，酶活濃度為0.16 U/mL，溫度為43.43 ℃，pH值4.19。在此條件下水溶性酵母β-葡聚糖得率為40.5939%。

為了再次驗證響應(yīng)面分析法的可靠性，選取條件底物質(zhì)量濃度為1.14 g/dL，酶活濃度為0.16 U/mL，溫度為44 ℃，pH為4.20，實際測得水溶性酵母β-葡聚糖得率39.89%，比回歸模型預(yù)測理論值低0.55%(小于5%)。因此響應(yīng)面分析優(yōu)化得到的酶解工藝條件準確可靠。段會軻等人研究了利用木霉菌株產(chǎn)的β-1,3-葡聚糖酶對酵母葡聚糖進行酶解，其可溶性多糖得率為52%，與本研究結(jié)果接近。本研究所用原料為商品用酵母β-葡聚糖，多糖含量為80%，所用酶亦不相同，因而與前人的研究結(jié)果略有差異。

2.3　酶解時間對可溶性多糖得率的影響

在底物質(zhì)量濃度為1.14 g/100 mL，酶活濃度為0.16 U/mL，溫度為44 ℃，pH為4.2的條件下，研究酶解時間對水溶性酵母β-葡聚糖得率的影響，結(jié)果如圖11所示。水溶性酵母β-葡聚糖得率隨著酶解時間的增長而呈現(xiàn)出先迅速升高后下降的趨勢，酶解時間1.5 h時，水溶性酵母β-葡聚糖得率最大，延長時間，水溶性酵母β-葡聚糖得率下降。隨著酶解時間的增長，葡聚糖酶不僅作用于不溶性酵母β-葡聚糖，也同時作用于已溶的多糖，導(dǎo)致水溶性酵母β-葡聚糖得率下降。由此確定酶解時間為1.5 h。

圖11　酶解時間對水溶性酵母β-葡聚糖得率的影響Fig.11　Effects of times on water-soluble yeast β-glucan yield

對每一個濃度梯度的3組重復(fù)實驗數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果見表8，圖11標注的顯著性差異由Duncan法分析得到。由表8及圖11可知，酶解時間對水溶性酵母β-葡聚糖得率影響的處理間均存在顯著性差異。

表8　酶解時間的方差分析Table 8　The analysis of variance table of time

2.4　酵母β-葡聚糖與水溶性酵母β-葡聚糖的性質(zhì)分析

2.4.1熱重分析

為了研究酵母β-葡聚糖與水溶性酵母β-葡聚糖的熱穩(wěn)定性與熱分解作用，進行了熱重分析(TGA分析)。熱重分析法是測量物質(zhì)的質(zhì)量與溫度關(guān)系。在加熱過程中得到的樣品累積量的積分型曲線即是TG曲線，它是由TGA分析得到的。樣品質(zhì)量的變化率由DTG曲線表示。

圖12　酵母β-葡聚糖和水溶性酵母β-葡聚糖的熱重分析圖譜Fig.12　TGA curves of yeast β-glucan and water-solubleyeast β-glucan

圖13　酵母β-葡聚糖和水溶性酵母β-葡聚糖的微分熱重分析圖譜Fig.13　DTG curves of yeast β-glucan and water-solubleyeast β-glucan

圖12和圖13分別顯示的是酵母β-葡聚糖和水溶性酵母β-葡聚糖的熱重分析圖譜和微分熱重分析圖譜。酵母β-葡聚糖和水溶性酵母β-葡聚糖均有兩個失重峰。酵母β-葡聚糖的第一個失重峰是由于水分損失所致的重量損失，出現(xiàn)在50 ℃左右，失重率5.58%。第二個失重峰出現(xiàn)在316～388 ℃，最高峰出現(xiàn)在360 ℃左右，此溫度稱為酵母β-葡聚糖的特征分解溫度，這表示樣品內(nèi)的揮發(fā)組分析出并且燃燒，樣品質(zhì)量損失率為94%。這說明酵母β-葡聚糖在該溫度范圍內(nèi)發(fā)生了劇烈的分解反應(yīng)。

同酵母β-葡聚糖相比，水溶性酵母β-葡聚糖的TG曲線同樣在50 ℃左右出現(xiàn)失重峰，失重率為6.47%。水溶性酵母β-葡聚糖的第二個失重峰出現(xiàn)在306～399 ℃，特征分解溫度為356 ℃左右，樣品質(zhì)量損失率為88%。酵母β-葡聚糖和水溶性酵母β-葡聚糖的特征分解溫度分別為360 ℃和356 ℃，終止分解溫度分別為780 ℃和740 ℃。熱重分析結(jié)果表明兩者的熱穩(wěn)定性差異不大，酶解對酵母β-葡聚糖的熱穩(wěn)定性基本無影響。

2.4.2紅外光譜分析

為了研究酵母β-葡聚糖與水溶性酵母β-葡聚糖的結(jié)構(gòu)差異，進行了紅外光譜分析。紅外光譜可以分析多糖的糖苷鍵構(gòu)型，確定多糖的結(jié)構(gòu)與種類。酵母β-葡聚糖與水溶性酵母β-葡聚糖的紅外吸收圖譜如圖14所示。

圖14　酵母β-葡聚糖和水溶性酵母β-葡聚糖的紅外光譜圖Fig.14　IR Spectrum of the sample of yeast β-glucanand water-soluble yeast β-glucan

由圖14可以看出，酵母β-葡聚糖和水溶性酵母β-葡聚糖的紅外光譜圖基本一致，圖譜顯示在890 cm-1處有特征峰，表明了其糖苷鍵為β構(gòu)型；2 920 cm-1的特征峰說明樣品具β-1,3鍵；1 460～1 042 cm-1附近為多糖的吸收帶；在3 431 cm-1處有吸收峰可以認為是O—H的伸縮振動峰；810 cm-1附近沒有吸收峰證明酵母β-葡聚糖和水溶性酵母β-葡聚糖的單糖組成成分無甘露糖。綜上，酵母β-葡聚糖和可溶性酵母β-葡聚糖的分子構(gòu)象相同。

3　結(jié)論

通過單因素和響應(yīng)面實驗確定酵母β-葡聚糖的酶解條件：底物質(zhì)量濃度為1.14 g/100 mL，酶活濃度為0.16 U/mL，溫度為44 ℃，pH為4.2，在此條件下水溶性酵母β-葡聚糖得率為39.89%，比回歸模型預(yù)測理論值低0.55%(小于5%)，表明該工藝條件準確可靠。此外，各變量因素對水溶性酵母β-葡聚糖得率影響程度的大小順序依次為pH>底物質(zhì)量濃度>溫度>酶活濃度。

通過熱重分析表明，酵母β-葡聚糖和水溶性酵母β-葡聚糖的特征分解溫度分別為360 ℃和356 ℃，終止分解溫度分別為780 ℃和740 ℃。酵母β-葡聚糖和水溶性酵母β-葡聚糖的熱穩(wěn)定性差異不大，酶解對酵母β-葡聚糖的熱穩(wěn)定性基本無影響。通過紅外光譜分析表明，酵母β-葡聚糖與水溶性酵母β-葡聚糖具有相似是紅外光譜，其糖苷鍵型為β構(gòu)型，且具有β-1,3鍵，分子構(gòu)象相同。

[1]OHNO N,MIURA T,MIURA N N,et al.Structure and biological activities of hypochlorite oxidized zymosan[J].Carbohydrate Polymers,2001,44(4):339-349.

[2]ELYAKOVA L,ISAKOV V,LAPSHINA L,et al.Enzymatic transformation of biologically active 1,3；1,6-β-D-glucan.Structure and activity of resulting fragments[J].Biochemistry(Moscow),2007,72(1):29-36.

[3]胡曉忠,明杰,甄寶貴,等.用酸堿法從面包酵母中提取β-1,3-D葡聚糖[J].工業(yè)微生物,2000,30(1):28-31.

[4]段會軻,熊善柏,劉海梅.酵母β-1,3-葡聚糖的酶法增溶及產(chǎn)物分析[J].食品科學(xué),2008,29(1):185-189.

[5]王強,劉曉,胡永金,等,釀酒酵母β-葡聚糖超聲修飾及其對小鼠免疫功能的影響[J].食品與生物技術(shù),2008,27(4):79-83.

[6]WANG Y F,ZHANG L N.Chain conformation of carboxymethylated derivatives of (1-3)-β-d-glucan fromPoriacocossclerotium[J].Carbohydrate Polymers,2006,65:504-509.

[7]王強,劉紅芝,鐘葵.多糖分子鏈構(gòu)象變化與生物活性關(guān)系研究進展[J].生物技術(shù)進展,2011,5(1):1-9.

[8]KERY V,KOGAN G,ZAJACOVA K,et al.Hydrolysis of yeast cell wall glucan by extracellular β-(1-3)-glucanase fromAspergillusniger[J].Enzyme Microbiology Technology,1991,13(1):87-90.

[9]韓晶，李寶坤，李開雄，等.β-葡聚糖酶的特性與應(yīng)用研究[J].中國釀造，2008(17):4-7.

[10]王俊麗,聶國興,李素貞,等.DNS法測定還原糖含量時最適波長的確定[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2010(4):115-118.

[11]張惟杰.復(fù)合多糖的生化研究技術(shù)[M].杭州:浙江大學(xué)出版社,1999.

[12]張學(xué)況,杜麗萍,王超,等.酶解法增溶酵母(1-3)-β-D-葡聚糖的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2012,38(7):48-52.