傳統(tǒng)發(fā)酵食品中耐胃腸道環(huán)境乳酸菌的篩選及其在酸乳發(fā)酵中的應用

孫敏，袁鳳霞，曹曉虹，劉建利，王軍節(jié)，張琇,李靖宇，覃璐琪，鄧鵬程，王曉丹

(北方民族大學 生物科學與工程學院，發(fā)酵釀造工程生物技術(shù)國家民委重點實驗室，寧夏特殊生境微生物資源開發(fā)與利用重點實驗室，寧夏 銀川，750021)

目前，用于酸乳發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)的保加利亞乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckiisubsp. bulgaricus)和嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)等菌株，只是發(fā)酵特性優(yōu)良的菌種，而非益生乳酸菌[1-2]。胃是重要的消化器官，胃液的強酸性環(huán)境和其中的蛋白酶共同構(gòu)成了阻止大多數(shù)微生物進入腸道的天然屏障，腸道pH 8.0的弱堿性環(huán)境及其分泌的膽汁、胰蛋白酶也對外源微生物有拮抗作用。因此，耐受胃腸道環(huán)境，是益生乳酸菌的最基本特性。而乳酸菌胃腸道環(huán)境耐受性的研究大多僅僅集中菌株篩選，很少同時兼顧考察其優(yōu)良發(fā)酵特性的研究[3-11]。本課題組前期已從新疆、西藏、青海、內(nèi)蒙、甘肅、云南等全國20個省份的少數(shù)民族傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離得到大量的乳酸菌，本研究擬從中篩選耐胃腸道環(huán)境的乳酸菌菌株，并進行酸乳發(fā)酵試驗，為開發(fā)益生優(yōu)良酸乳發(fā)酵菌劑提供候選菌種和理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1乳酸菌株

本實驗室保存的從新疆、西藏、青海、內(nèi)蒙、甘肅、云南等全國20個省份的酸乳、奶酪、奶豆腐、奶酒、曲拉、乳扇、乳餅、漿水、酵子、泡菜、酸菜等少數(shù)民族傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離的乳酸菌，隨機選取58株菌進行實驗；保加利亞乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckiisubsp. bulgaricus)，寧夏夏進乳業(yè)股份有限公司惠贈。

1.1.2實驗試劑

胰蛋白酶，北京拜耳迪生物公司；胃蛋白酶、牛膽鹽，Biotopped公司;胰蛋白胨、酵母抽提物英國Oxoid公司；牛肉浸粉，青島海博生物公司；細菌基因組提取試劑盒，康為世紀生物科技有限公司；2×EasyTaqPCR SuperMix (+dye)，北京全式金生物技術(shù)有限公司；檸檬酸二銨、檸檬酸銨、蔗糖、碘、三氯乙酸、鄰苯二胺、HCl、NaHSO3、酚酞、NaOH、酒精、瓊脂糖、CaCl2、NaCl、Na2HPO4、NaH2PO4、無水乙醇、KOH,天津市大茂化學試劑廠,均為分析純；純牛奶,伊利乳業(yè)有限責任公司。

1.1.3溶液

酸溶液[12-15]：用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)生理鹽水為pH 3.0，于121 ℃下滅菌20 min。

膽鹽溶液[12-13,15]：準確稱取0.3 g牛膽鹽，加生理鹽水溶解定容至100 mL，于121 ℃下滅菌20 min。

人工模擬胃液[12,14,16-17]：稱取0.3 g胃蛋白酶，溶于100 mL 50 g/L NaCl溶液中，用1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)為pH3.0，經(jīng)微孔濾膜過濾除菌后備用。

人工模擬胰液[17-18]：稱取0.1 g胰蛋白酶，溶于100 mL 50 g/L NaCl溶液中，用1 mol/L的NaOH溶液調(diào)整為pH 8.0，經(jīng)微孔濾膜過濾除菌后備用。

1.1.4培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基(1 L)：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、檸檬酸二銨2 g、牛肉浸粉10 g、無水乙酸鈉5 g、葡萄糖20 g、吐溫80 1 mL、MgSO40.58 g、K2HPO42.6 g、MnSO40.19 g，調(diào)節(jié)pH值為6.2～6.4之間。

1.1.5引物

27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG

1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT

由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.1.6實驗儀器

TMS-PRO型質(zhì)構(gòu)儀,美國FTC公司;NDJ-8S黏度計,上海庚庚儀器設備公司;S1000型快速梯度PCR儀，美國Bio-Rad公司；Q/BKYY15-2000型微型旋渦混合器、1-14型臺式高速冷凍離心機，Sigma公司；SW-CJ-2J型，雙人型超凈工作臺蘇州凈化設備有限公司；紫外分光光度計，美國賽默飛世爾科技公司；HH-4型，水浴鍋浙江余姚金電儀表有限公司；LDZX-50KBS型壓力蒸汽滅菌器；ZWY-100H恒溫培養(yǎng)振蕩器；SD303-4A型數(shù)顯電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設備有限公司。

1.2　實驗方法

1.2.1乳酸菌的活化

取保藏的菌株接入MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃，100 r/min搖床培養(yǎng)24 h，備用。

1.2.2乳酸菌菌株腸胃道耐受性實驗

參考文獻[3-5]方法，稍作改動。將活化后的菌株按2%的接種量接到MRS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后，吸取培養(yǎng)液2 mL，12 000 r/min離心2 min，收集菌體，加入2 mL的無菌生理鹽水重懸，準確吸取0.5 mL菌懸液分別加入4.5 mL酸溶液、膽鹽溶液、人工模擬胃液和人工模擬胰液和生理鹽水；37 ℃，100 r/min搖床培養(yǎng)4 h后，取500 μL處理液接種到5 mL的培養(yǎng)基中，于37 ℃ 100 r/min搖床培養(yǎng)8 h后，在600 nm處測量其吸光度值，按照以下公式計算存活率，以保加利亞乳桿菌存活率為對照(CK)。

(1)

式中：A，生理鹽水吸光度值；B，各處理液吸光度值

1.2.3菌懸液制備

4 ℃，6 000 r/min離心活化的乳酸菌培養(yǎng)液5 min，棄去上層，加入無菌生理鹽水制成濃度大于1×108CFU/mL菌懸液。

1.2.4酸乳的發(fā)酵

取滅菌后的玻璃瓶，每瓶加入30 mL含蔗糖的牛奶(100 g/L)，高壓滅菌鍋95 ℃滅菌5 min，待冷卻后，接入乳酸菌菌懸液5 mL，40 ℃培養(yǎng)記錄凝乳時間，凝乳后4 ℃冷藏24 h，進行后續(xù)酸乳特性評價，以保加利亞乳桿菌發(fā)酵酸乳為對照(CK)。

1.2.5酸乳特性評價

1.2.5.1感官評價

參考生慶海等[19]方法，制定感官品評表，將凝乳后的酸乳取出后，隨機選8～15名學生依據(jù)感官評價標準對其氣味、質(zhì)地、口感3個指標進行感官評定，記錄數(shù)據(jù)，計算平均值。

表1　酸乳感官評價打分表Table 1　The table of sensory evaluation scores on yoghourt

1.2.5.2持水力測定

參考張?zhí)m威[20]的方法，準確稱取發(fā)酵后的酸乳15 g，4 500 r/min離心10 min，取上清液，稱取質(zhì)量。

(2)

1.2.5.3質(zhì)構(gòu)特性測定

參考文獻[21-23]，測試探頭型號為TMS-75 mm圓盤擠壓探頭P/75。測試條件如下：測前速率為30 mm/min；測后速率與測前速率一致；兩次壓縮之間的停留間隔：0 s；采樣速度：10 Hz；最小觸發(fā)力：0.3 N。

1.2.5.4黏度測定

轉(zhuǎn)子為1～4號，轉(zhuǎn)速在6～60 r/min，測量范圍在(500～400 000)mPa·s。將40 mL待測酸乳于50 mL塑料離心管中，選擇合適的轉(zhuǎn)子置于酸乳中，調(diào)整轉(zhuǎn)速，使檢測值位于轉(zhuǎn)子檢測范圍值中間，注意旋轉(zhuǎn)時不要與管壁接觸。

1.2.5.5滴定酸度測定

按照GB/T 5413—1997[24]，取250 mL三角瓶，加4 ℃存放1 d、3 d、7 d的酸乳5 g、40 mL冷卻煮沸水和5滴已經(jīng)配好的酚酞酒精溶液(質(zhì)量濃度為5 g/L)，充分搖勻，用NaOH標準溶液(濃度為0.100 0 mol/L)滴定至微紅色，在30 s內(nèi)顏色不消失即為滴定終點，記錄消耗的NaOH標準滴定溶液體積。將所得結(jié)果代入公式(3)計算滴定酸度。

式中：X，發(fā)酵乳樣品的酸度，°T；c，NaOH標準溶液的摩爾濃度，mol/L；V，滴定時消耗NaOH標準溶液體積，mL；m，發(fā)酵乳樣品的質(zhì)量，g；0.1，酸度理論定義NaOH的摩爾濃度，mol/L。

1.2.6數(shù)據(jù)處理與分析

圖表在Excel中生成，采用SPSS 11.0軟件ANOVA對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析，用LSD進行多重比較。

1.2.7菌株分子鑒定

參照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書；PCR擴增16S rDNA反應體系為(50 μL)：10×PCR Mix 25 μL、10 μmol/L的上下游引物各1 μL、模板DNA 1μL、ddH2O 22μL。取3 μL PCR產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖電泳檢測，剩余PCR擴增產(chǎn)物由南京金斯瑞生物公司進行測序。將測序序列在EZBio Cloud數(shù)據(jù)庫中比對鑒定。參考凌空等[25]的方法，以Bacillussubtilis16S rDNA序列(X60646.1)為外群，建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2　結(jié)果與分析

2.1　乳酸菌菌株腸胃道耐受性結(jié)果

在pH 3.0的酸溶液中，保加利亞乳桿菌(CK)存活率為35.75%，58株乳酸菌存活率在7%～99%之間，10%以下的有9株菌，10%～20%的有24株菌，20%～30%的有9株菌，30%～60%的有8株菌，60%～90%的有5株菌，90%以上的有3株菌，分別是菌株“新A22”(99.14%)、“新E6”(94.50%)和“新E10”(91.67%)；在膽鹽溶液中，保加利亞乳桿菌(CK)存活率為55.88%，各菌株的存活率10%～98%之間，10%～20%的有9株菌，20%～40%的有7株菌，40%～60%的有25株菌，60%～90%的有14株菌，90%以上的有3株菌，分別是菌株“奶疙瘩3”(97.72%)、“蘭州2”(96.34%)和“甘景4”(96.29%)；在人工模擬胃液中，保加利亞乳桿菌(CK)存活率為36.24%，各菌株的存活率8%～90%之間，10%以下的有11株菌，10%～20%的有25株菌，20%～40%的有10株菌，40%～70%的有4株菌，70%～80%的有6株菌，80%以上的有2株菌，分別是菌株“新A22”(89.46%)和“新B4”(87.53%)；在人工模擬胰液中，保加利亞乳桿菌(CK)存活率為87.82%，各菌株存活率均較高，介于30%～400%之間，甚至出現(xiàn)胰液會促進部分菌株的生長繁殖的情況，80%以下的只有3株菌，80%～90%的也只有4株菌，90%～100%的有15株菌，100%～150%的有32株菌，150%以上的有3株菌，分別是“陜渭7”(365.74%)、“平?jīng)?”(182.48%)和“奶疙瘩3”(163.51%)，說明腸液中對菌株存活率影響較大的是膽鹽而非胰蛋白酶。由于同一菌株在4種溶液中存活率差距較大，因此選擇在各個處理溶液中存活率都達到了45%以上有“新E6”、“克1”、“新A22”、“新E10”、“銀川1”、“新B4”、“鮮豆腐8”這7株菌(圖1)，將這7株菌作為進一步試驗候選菌株。

2.2　評估益生性菌株應用于發(fā)酵酸乳的潛力

2.2.1凝乳時間

將篩選到的7株菌與對照菌株保加利亞乳桿菌都用于酸乳發(fā)酵后，發(fā)現(xiàn)樣品在6 h都出現(xiàn)部分凝乳，7 h都完全凝乳，并未出現(xiàn)顯著差異。

圖1　菌株在酸溶液、膽鹽溶液、人工模擬胃液、人工模擬胰液中的存活率Fig.1　The survival rate of lactic acid bacteria strains inacid solution, bile solution, simulating gastric juice andsimulating intestinal fluids

2.2.2感官評價結(jié)果

感官評價是酸乳品質(zhì)測評的重要手段，將這7株菌株與對照菌保加利亞乳桿菌(CK)用于酸乳發(fā)酵后，對質(zhì)地、氣味和口感方面進行評價，對照菌保加利亞乳桿菌發(fā)酵的酸乳(CK)得分達到了90分，與我們篩選菌株有顯著差異，保加利亞乳桿菌做為長期篩選穩(wěn)定的工業(yè)菌株，其酸乳發(fā)酵特性非常優(yōu)良。7株供試菌中，達到80分以上的有5株菌， 2株菌得分70～80分之間(銀川1、新B4)。選擇80分以上的“鮮豆腐8”、“新E6”、“克1”、“新A22”、“新E10”等5株菌作為后續(xù)試驗供試菌株(表2)。

表2　菌株發(fā)酵酸乳感官評價得分Tbale 2　Sensory evaluation scores on yoghourt fermentedwith lactic acid bacteria strains

注：小寫字母表示0.95水平檢驗。

酸乳持水力大小指酸乳保質(zhì)期內(nèi)乳清析出的多少，反映不同質(zhì)地酸乳對乳清的截留能力，越大表示酸乳質(zhì)地越優(yōu)。6株菌持水力值均在在10%～50%之間，對照(CK)的持水力為28.99%，其中最大的為“克1”，達到了35.31%，其余“新A22”、“新E6”、“鮮豆腐8”、“新E10”等4株菌發(fā)酵酸乳差異不顯著，但均比對照(CK)顯著小(圖2)。

圖2　菌株發(fā)酵酸乳持水力Fig.2　Holding water capacity of yoghourt fermentedwith lactic acid bacteria strains注：小寫字母表示0.95水平檢驗。圖3、圖4、圖5、圖6.

2.2.3質(zhì)構(gòu)分析結(jié)果

感官評價法一般采用暫時的評分系統(tǒng)，局限性很大，而且這種評定費時費力，受評價員的情緒、健康狀況等多種因素影響，穩(wěn)定性不足。質(zhì)構(gòu)儀通過模擬人的口腔咀嚼功能，用具體的數(shù)據(jù)，客觀地將人的觸覺感受分解成硬度、咀嚼性、彈性、內(nèi)聚性、膠黏性等幾個部分，5株菌發(fā)酵酸乳樣品質(zhì)構(gòu)數(shù)據(jù)如圖3～圖5所示。

圖3　菌株發(fā)酵酸乳破裂力、內(nèi)聚力、咀嚼性測定結(jié)果Fig.3　Rupture force, cohesiveness and chewiness of yoghourtfermented with lactic acid bacteria strains

圖4　菌株發(fā)酵酸乳膠黏性、最大黏附力、硬度Fig.4　Tackiness, the maximum adhesion force and hardnessof yoghourt fermented with lactic acid bacteria strains

圖5　菌株發(fā)酵酸乳彈性Fig.5　Elasticity of yoghourt fermented with lactic acidbacteria strains

破裂力反映了樣品表面脆性，通過測定這5株菌發(fā)酵酸乳的破裂力，菌株“新E6”、“新E10”發(fā)酵酸乳的破裂力較大，和對照(CK)差異性不顯著；內(nèi)聚力反映了模擬咀嚼樣品時，樣品抵抗受損、緊密連接，試圖保持完整的能力，結(jié)果顯示菌株“新E6”發(fā)酵酸乳的內(nèi)聚力最大，與對照(CK)差異性不顯著，而其他4株發(fā)酵酸乳內(nèi)聚力顯著低于對照(CK)和菌株“新E6”發(fā)酵酸乳；咀嚼性反映了入口后的整體口感，對照(CK)最高，菌株“新E6”發(fā)酵酸乳的咀嚼性次之；膠黏性等于硬度與凝聚性的乘積，用于描述半固態(tài)物質(zhì)的特性，結(jié)果顯示菌株“新E6”發(fā)酵酸乳的膠黏性是最大的，高于對照(CK)；而在反映了樣品在被模擬口腔咀嚼時，對上腭、牙齒、舌頭等接觸面黏著的性質(zhì)的最大粘附力中，菌株“新E6”與“新E10”發(fā)酵酸乳的最大粘附力較大，但略低于對照(CK)，其他3株菌最大粘附力較?。挥捕确从沉怂崛槟虖姸?，對照(CK)也是最高，菌株“新E6”發(fā)酵酸乳次之；彈性反映了試樣如果受到徹底擠壓，在一段時間內(nèi)變形恢復的能力，結(jié)果顯示5株菌發(fā)酵酸乳彈性無顯著差異且低于對照(CK)。綜合7個質(zhì)構(gòu)指標，對照(CK)大部分指標較優(yōu)，菌株“新E6”發(fā)酵酸乳次之。

2.2.4黏度測定結(jié)果

通過黏度計來測定5株菌發(fā)酵酸乳粘度，各現(xiàn)菌株間的黏度差異顯著(圖6)，對照酸乳(CK)的黏度最大，達到了5 984 mPa·s，菌株“新E6”發(fā)酵酸乳黏度次之，達到了5 565 mPa·s，菌株“新E10”發(fā)酵酸乳黏度最小，只有1 113 mPa·s。

圖6　菌株發(fā)酵酸乳粘度Fig.6　Viscosity of yoghourt fermented with lactic acidbacteria strains

2.2.5滴定酸度和后酸度檢測結(jié)果

發(fā)酵結(jié)束后酸乳，滴定酸度要適中，發(fā)酵7 h后的樣品，菌株“鮮豆腐8”發(fā)酵酸乳酸度最高，菌株“新E6”發(fā)酵樣品和對照(CK)無顯著差異，其余3株菌發(fā)酵酸乳滴定酸度較低；冷藏保存7d后，菌株“新E6”發(fā)酵樣品和對照(CK)的后酸變化較小，顯著低于其他4株菌發(fā)酵的酸乳(表3)。

2.3　“新E6”菌株分子生物學鑒定

綜合各個指標，菌株“新E6”發(fā)酵酸乳各方面較優(yōu)，因此，“新E6”菌株既對胃腸道環(huán)境耐受性較強，同時應用在酸乳發(fā)酵中潛力也較大。“新E6”菌落灰白不透明、表面光滑，顯微鏡下細胞球形或卵圓形，成對或短鏈(圖7)。提取該菌株基因組DNA，采用PCR擴增16S rDNA序列。測序后獲得約1 500 bp序列，將該序列在Ezbiocloud中比對，結(jié)果顯示“新E6”的16S rDNA序列與EnterococcusduransNBRC 100 479(Type)的16S rDNA序列相似度高達99%，用該序列和Enterococcus屬其他種的16S rDNA用ML法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹上，顯示“新E6”與堅強腸球菌(E.durans)聚在一起(圖7)，因此，“新E6”分類地位屬堅強腸球菌(E.durans)菌株。

表3　菌株發(fā)酵酸乳滴定酸度Table 3　Titratable acidity of yoghourt fermented withlactic acid bacteria strains

注：小寫字母表示0.95水平檢驗

圖8　基于16S rDNA用ML法構(gòu)建Enterococcus屬系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.8　The phylogenetic tree of genus Enterococcusbased on 16S rDNA sequences

3　討論

益生菌通過人體胃部，到達腸道部位，黏附于腸道上皮細胞，從而實現(xiàn)定植，發(fā)揮對人體或動物宿主的有益功效。胃液和腸液構(gòu)成人體的“生物屏障”，益生菌必通過胃腸道后幸存下來，才能在體內(nèi)發(fā)揮它的益生功能。食物通過胃的時間一般為1～3 h，通過小腸的時間約為1.5 h[26]。本實驗選取了4 h作為耐受性測試時間，大于食物在胃腸道中通過時間，其篩選菌株耐受時間一定滿足人體自然胃腸道要求。

pH值是影響微生物生長一個重要因素，所以益生乳酸菌的理想特性包括其酸性條件下耐受力。胃液酸性很強，空腹時pH值為0.9～1.8，受食物酸性的影響，進食過程中pH值在1.8～5.0波動，通常pH值維持在3.0左右[27]。因此，耐受pH 3.0是乳酸菌重要益生特性，本試驗設計在pH 3.0酸性條件下研究分離株的耐酸性能。結(jié)果表明，大多數(shù)乳桿菌分離株在pH 3.0酸性條件下培養(yǎng)4 h活力減少50%以上，酸性條件對菌株有明顯抑制或殺滅作用。

由于膽鹽會瓦解細胞膜結(jié)構(gòu)并導致膜蛋白解離，使細胞內(nèi)容物滲漏，導致細胞死亡。因此，耐膽鹽能力被認為是乳酸菌能否在人體胃腸道定殖、生長、代謝，并發(fā)揮生理功能的重要指標。在腸道內(nèi)膽鹽濃度不是一成不變的，在第1 h內(nèi)，膽鹽濃度在1.5%～2%，最后降低到約0.3%。研究表明，健康人體腸道最大膽鹽濃度為0.3%，0.3%膽鹽濃度被認為是耐膽鹽菌株的篩選臨界濃度[28]。本項目以0.3%牛膽汁中處理4 h進行篩選菌株膽鹽耐受特性研究，選出的大多數(shù)乳酸菌分離株表現(xiàn)出對膽鹽的較強耐受力。

胃腸道除酸堿極端外，還含有各種酶類(主要是胃蛋白酶和胰蛋白酶)，相比對胃蛋白酶的影響，本研究中大多數(shù)分離菌株耐受胰酶溶液。供試菌株在模擬胰液中培養(yǎng)4 h，表現(xiàn)相對高的存活率，細胞數(shù)減少均較小，甚至沒有減少反而增加，說明腸道中殺死外來菌的主要是膽鹽而不是胰蛋白酶。這一結(jié)果與張麗[15]和CHARTERIS等[29]研究報道一致。

益生乳酸菌發(fā)揮益生作用的前提必須是到達人體腸道并定植后才能發(fā)揮其生理功效，而人們?nèi)粘z入乳酸菌途徑主要是通過食用各種發(fā)酵乳制品和口服乳酸菌制劑，這樣進入人體的乳酸菌必然要經(jīng)過消化系統(tǒng)的考驗。對胃腸道耐受性分析只是益生菌篩選的第一步，益生菌要求特性還有許多。另外，實驗篩選的胃腸道耐受能力和酸乳發(fā)酵能力均較優(yōu)的菌株“新E6”為堅強腸球菌(E.durans)，它不屬于國家批準可用于食品的菌種。因此“新E6”如果要開發(fā)為益生菌，后續(xù)試驗還需進行菌耐藥性、抗腸道病原菌活性、黏膜細胞黏附性、安全性等特性深入研究。

實驗篩選的胃腸道耐受能力和酸乳發(fā)酵能力均較優(yōu)的菌株“新E6”，在胃腸道耐受性方面明顯優(yōu)于對照，在酸乳發(fā)酵性能方面，并沒有表現(xiàn)得比對照菌株保加利亞乳桿菌顯著優(yōu)良，甚至在某些方面弱于對照菌。其原因可能由于商業(yè)化工業(yè)用保加利亞乳桿菌是經(jīng)過多年選育而成，在酸乳發(fā)酵方面的表現(xiàn)穩(wěn)定而優(yōu)秀，“新E6”屬于自然分離菌，并未經(jīng)過選育，并且分類屬腸球菌屬，該屬內(nèi)菌株酸乳發(fā)酵性能整體不如保加利亞乳桿菌所在的乳桿菌屬(Lactobacillus)。

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