動植物蛋白源協(xié)同增強wistar大鼠抗疲勞能力

任廣旭,伊素芹,張鴻儒,王靖*

1(農(nóng)業(yè)部食物與營養(yǎng)發(fā)展研究所，北京，100081) 2(中國農(nóng)業(yè)科學院雙蛋白工程研究中心，北京，100081)3(農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與營養(yǎng)功能風險評估試驗室，北京，100081)

過量運動和不規(guī)律作息均能造成不同程度的疲勞。運動型疲勞是連續(xù)性超負荷運動刺激所引發(fā)的一種生理現(xiàn)象[1]。第五屆國際運動生化學會將疲勞定義為機體生理過程不能維持其機能在特定水平上或不能維持預定的運動強度。劇烈運動機體需要消耗大量能量物質(zhì)，細胞從有氧呼吸提供能量轉(zhuǎn)換成無氧酵解供能。隨著運動時間和強度的增加，機體產(chǎn)生大量乳酸、內(nèi)環(huán)境酸堿度和滲透壓失調(diào)，最終導致機體不能有效維持現(xiàn)有的運動強度，出現(xiàn)力竭現(xiàn)象。因此，通過營養(yǎng)補充使機體快速消除疲勞，提高運動能力是當今運動科學、醫(yī)學和食品科學關(guān)注的焦點。大豆蛋白和乳清蛋白均屬于優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，具有多種生物調(diào)節(jié)功能[2]。研究揭示以大豆蛋白和牛乳蛋白組成的混合白能夠有效促進運動后骨骼肌細胞內(nèi)氨基酸轉(zhuǎn)運及蛋白合成[3-4]。單一蛋白源以及混合蛋白對運動疲勞的影響目前尚不清楚，本研究將利用wistar大鼠負重游泳模型對此進行分析。

1　材料與方法

1.1　動物與分組

6周齡SPF級雄性wistar大鼠18只，購于北京維通利華實驗動物有限公司，實驗動物合格證NO.11400700105348、生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2010-0001。采用IVC大鼠飼養(yǎng)系統(tǒng)，12 h光照周期，嚴格遵守中國動物實用指南。體重202～226 g，隨機分為3組：乳清蛋白組、大豆分離蛋白組和雙蛋白組。

1.2　動物模型

運動模型采用wistar大鼠一次性力竭游泳模型。將大鼠置于2倍于身長的游泳筒[水溫(25±0.5) ℃]中游泳，尾部負重自身體重10%的鉛皮，記錄大鼠自游泳開始至力竭發(fā)生的時間(s)，力竭判斷標準為大鼠全身沉入水中10 s后仍不能通過努力返回水面[5-6]。

1.3　主要材料

大豆分離蛋白：采購于山東禹王集團，食品級大豆分離蛋白，干蛋白質(zhì)含量>90%。乳清蛋白：采購于美國Hilmar，食品級乳清蛋白，干蛋白質(zhì)含量為94.6%。SPF級維持飼料，購于北京科奧協(xié)力飼料有限公司。

1.4　實驗設計

實驗用wistar大鼠被隨機分成3組，并通過耳標進行標記。首先，對所有大鼠進行為期1周的適應性飼喂，第2周檢測實驗大鼠體重，計算負重游泳所需鉛皮重量。每周一進行1次性力竭訓練，周二～周五進行2/3力竭時間的普通游泳運動。運動后分別對3組大鼠進行灌胃處理(濃度100 mg/mL，2 mL/只)。連續(xù)飼喂6周，第7周(周一)一次性力竭后灌胃，分別在灌胃后第30、60、90、120和150 min采集尾靜脈血。

1.5　檢測指標

血液生理生化測定：按照實驗設計采集完不同時間點的尾靜脈血，收集血清檢測肌酸激酶(CK)和乳酸脫氫酶(LDH)。肌酸激酶(CK)和乳酸脫氫酶(LDH)活性測定使用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒，并且按照實試劑盒說明書所示程序進行操作。一次性力竭時間測定：第7周記錄每只大鼠力竭的時間。

1.6　統(tǒng)計分析

采用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)分析，p<0.05為差異就有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1　大鼠體重變化情況

本實驗選擇體重均一的SPF級wistar大鼠，每只大鼠每天定量飼喂20 g SPF級大鼠維持飼料，自由飲水。在負重游泳訓練后，每組大鼠分別通過灌胃攝入等量的蛋白質(zhì)(乳清蛋白、大豆分離蛋白和雙蛋白)。經(jīng)過6周的靜水游泳訓練及蛋白灌胃處理，第7周檢測各組大鼠體重。檢測結(jié)果表明，各蛋白干預組之間大鼠體重沒有明顯的統(tǒng)計學差異(表1)，乳清蛋白干預組大鼠平均體重為360.83 g，略高于大豆分離蛋白組(平均體重339.83 g)和雙蛋白組(平均體重344.50 g)。

表1　wistar大鼠體重變化情況表Table 1　The weight change of wistar rats (n=6，±s)

2.2　雙蛋白對大鼠一次性力竭時間的影響

根據(jù)第7周3組大鼠體重數(shù)值，按照體重10%負重原則計算尾部鉛皮重量，分別對每組大鼠進行負重游泳運動。記錄每只大鼠達到力竭狀態(tài)的時間，乳清蛋白組平均力竭時間為88 s，標準差為21.7、大豆分離蛋白組平均力竭時間為99.8 s，標準差為10.7、雙蛋白組平均力竭時間為135.8 s標準差為16.2。統(tǒng)計學分析雙蛋白組大鼠達到力竭狀態(tài)的品均時間顯著高于乳清蛋白組和大豆分離蛋白組(p<0.05)，乳清蛋白組與大豆分離蛋白組之間平均力竭時間沒有統(tǒng)計學差異。

圖1　大鼠負重游泳力竭時間Fig.1　The exhaustive swimming time

2.3　雙蛋白對運動后大鼠肌酸激酶的影響

肌酸激酶是機體ATP-CP系統(tǒng)代謝的關(guān)鍵酶，它能夠催化ATP生產(chǎn)ADP和磷酸肌酸，為細胞提供運動所需的能量[7]。肌酸激酶在運動過程中變化比較敏感，其含量的多少常用于評價運動的強度大小。經(jīng)過6周的運動飼喂干預實驗，第7周每組大鼠進行一次性力竭負重游泳運動，分別在0、30、60、90、120、150 min采集尾靜脈血，檢測肌酸激酶的含量。運動前(0 min)3組大鼠肌酸激酶本底水平相同沒有明顯的統(tǒng)計學差異，“運動+蛋白干預”后30、90 min各組肌酸激酶含量明顯高于60、120 min。3組之間肌酸激酶變化趨勢一致，表明各組大鼠運動強度基本一致(表1)。

2.4　雙蛋白對運動后大鼠乳清脫氫酶的影響

乳酸是體內(nèi)糖原在缺氧條件下氧化分解的代謝產(chǎn)物，乳酸的堆積是導致運動疲勞的物質(zhì)之一。乳酸脫氫酶廣泛存在于機體組織細胞中，能夠催化乳酸與丙酮酸之間轉(zhuǎn)換。結(jié)果顯示，游泳運動前，3組大鼠乳清脫氫酶活性相同沒有統(tǒng)計學差異，“運動+蛋白”干預后第30 min雙蛋白組乳酸脫氫酶活性明顯升高，而乳清蛋白組與大豆分離蛋白組升高趨勢一致，顯著低于雙蛋白組(p<0.05)。隨后到第60 min，雙蛋白組乳酸脫氫酶活性急劇降低至與其他2組一致水平。從60～150 min 3組大鼠血清乳酸脫氫酶活性沒有明顯差異，150 min時各組大鼠基本恢復到靜息狀態(tài)(圖2)。

表2　wistar大鼠肌酸激酶動態(tài)變化情況表Table 2　Analysis of creatine kinase(n=6，±s)

圖2　大鼠乳酸脫氫酶活性動態(tài)變化Fig.2　The dynamic change of lactic acid dehydrogenase

3　討論

運動性疲勞不僅僅發(fā)生在職業(yè)運動員群體之中，當今大學生、都市健身人群及普通上班族中都存在運動性疲勞。導致運動疲勞的機制尚不清楚，學術(shù)界目前存在以下幾種學說[8]：(1)能量衰竭學說。主要認為在運動過程中機體消耗大量的能量物質(zhì)，這些物質(zhì)不能及時得到補充，從而造成疲勞。(2)代謝產(chǎn)物堆積學說。主要認為運動過程中機體從有氧功能轉(zhuǎn)化成無氧酵解，機體產(chǎn)生大量乳酸和氨[9]，造成機體穩(wěn)態(tài)失調(diào)。(3)自由基攻擊學說。主要認為運動能力消耗伴隨大量自由基產(chǎn)生，機體不能及時清除使自由基與生物膜多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧反應，造成細胞膜流動性和通透性發(fā)生改變。如果不能及時消除運動產(chǎn)生的疲勞，容易影響患者身心健康?，F(xiàn)存消除運動性疲勞的方法主要有物理療法和藥物療法，這些療法都存在一些弊端。以按摩為代表的物理療法只能短暫緩解運動疲勞，不能長期改變疲勞狀態(tài)。藥物療法耗時，往往對身體也會產(chǎn)生一些副作用。因此，如何通過飲食緩解運動性疲勞成為食品科學、運動科學和醫(yī)學領(lǐng)域所關(guān)注的焦點。

負重游泳運動模型通常應用在運動營養(yǎng)研究領(lǐng)域[10]。因此，本研究將利用wistar大鼠構(gòu)建負重游泳運動模型，開展乳清蛋白，大豆蛋白以及混合蛋白的功能評價。研究顯示肌肉蛋白的堆積主要發(fā)生在運動后的恢復期，因此本研究所涉及的蛋白營養(yǎng)干預都在運動訓練完成后，通過灌胃的方式進行[11]。自然膳食參照陳巍兩年飼喂試驗中wistar大鼠的攝食量[12]，最終確定每只大鼠每天維持飼料為20 g，使得6周運動營養(yǎng)干預期間大鼠日常膳食攝入量保持一致。第7周，通過檢測發(fā)現(xiàn)所有大鼠體重一致，這種體重的均一除了認為的控制食物的攝入量，還有每周持續(xù)性的游泳運動有關(guān)，因此研究發(fā)現(xiàn)這種運動能夠穩(wěn)定大鼠的體重[13]。前期研究發(fā)現(xiàn)按照體重10%計算負重游泳鉛皮重量，所達到的效果最好[14]。整個實驗采取雙盲法，即力竭時間獲取由獨立的技術(shù)人員獲取，以保證實驗數(shù)據(jù)的客觀性。

通過連續(xù)6周的運動營養(yǎng)干預發(fā)現(xiàn)，單一蛋白源(乳清蛋白及大豆分離蛋白)干預組的大鼠運動能力，沒有明顯的統(tǒng)計學差異。而在以動植物混合蛋白干預的大鼠中，發(fā)現(xiàn)其平均力竭實現(xiàn)顯著地高于單一蛋白源。這一現(xiàn)象可能是由以下幾個因素綜合作用的結(jié)果。首先，大豆與乳清蛋白消化吸收效率不一致。乳清蛋白屬于快速降解蛋白[15]，機體在攝入乳清蛋白后30 min內(nèi)出現(xiàn)高氨基酸血癥狀[14]。而大豆蛋白的消化效率相比乳清蛋白較慢，前期氨基酸釋放較慢，但攝入后能夠保持較高水平的氨基酸供給[14，16]?；旌系鞍椎陌被釀t能夠綜合兩者在氨基酸釋放方面的優(yōu)勢，能夠保證持續(xù)性的氨基酸供給[14]。尤其是支鏈氨基酸，它在肌肉蛋白質(zhì)合成過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[17]。其次，乳清蛋白不含有抗氧化物質(zhì)。大豆蛋白中較多的抗氧化物質(zhì)[18]。混合蛋白不但能夠發(fā)揮氨基酸供給優(yōu)勢，而且能夠兼顧抗氧化物質(zhì)。

研究發(fā)現(xiàn)持續(xù)性的運動能夠造成運動疲勞，可以反應在血漿中的酶含量，如乳酸脫氫酶和肌酸激酶[19-20]。通過采集尾靜脈血，發(fā)現(xiàn)3組不同干預下肌酸激酶的活性變化趨勢一致，說明各組運動強基本一致[21]。在相同條件下，雙蛋白組營養(yǎng)干預組大鼠平均力竭時間顯著長于其他2組。這種差異也體現(xiàn)在血清乳酸脫氫酶活性水平，雙蛋白攝入30 min時大鼠外周血乳酸脫氫酶含量最高，60 min后恢復至其他2組一致的水平。說明蛋白組運動營養(yǎng)攝入后30 min內(nèi)乳酸與丙酮酸之間的轉(zhuǎn)化活動比較頻繁。

綜上所述，通過連續(xù)6周的wistar運動飼喂實驗發(fā)現(xiàn)運動后攝入動植物混合蛋白能顯著提高大鼠負重游泳平均力竭時間，具有顯著地抗疲勞功效。本研究結(jié)果將為運動疲勞人群制定合理飲食方案提供科學支撐。

[1]張小強. 抗運動疲勞研究的現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢[J]. 搏擊:體育論壇, 2015(7):73-74.

[2]任廣旭, 伊素芹, 盧林綱, 等. “牛乳與大豆”雙蛋白運動營養(yǎng)功能的研究進展[J]. 中國食品學報, 2015(6):154-161.

[3]REIDY P T, WALKER D K, DICKINSON J M, et al. Soy-dairy protein blend and whey protein ingestion after resistance exercise increases amino acid transport and transporter expression in human skeletal muscle[J]. J Appl Physiol (1985), 2014,116(11):1 353-1 364.

[4]REIDY P T, WALKER D K, DICKNSON J M, et al. Protein blend ingestion following resistance exercise promotes human muscle protein synthesis[J]. J Nutr, 2013,143(4):410-416.

[5]周薇, 王遠金, 殷勁. 大鼠疲勞模型的建立及疲勞對肝臟結(jié)構(gòu)和功能的影響[J]. 成都體育學院學報, 1998(3):82-87.

[6]何耀群, 王學良. 大鼠游泳訓練應用方法的探討[J]. 廊坊師范學院學報:自然科學版, 2009(5):91-93.

[7]劉向東, 李陽. 一次力竭性離心運動對大鼠血清肌酸激酶(CK)活性的影響[J]. 河南科學, 2014(5):730-733.

[8]徐超.燕麥β-葡聚糖的體內(nèi)代謝和抗運動疲勞作用機制研究[D]. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學, 2013.

[9]JUNG K A, HAN D, KWON E K, et al. Antifatigue effect of Rubus coreanus Miquel extract in mice[J]. J Med Food, 2007,10(4):689-693.

[10]XU C, LV J L, YOU S P, et al,Supplementation with oat protein ameliorates exerciseinduced fatigue in mice[J]. Food Funct, 2013, 4(2): 303-309.

[11]VOLPI E, KOBAYASHI H, SHEFFIELD-MOORE M, et al. Essential amino acids are primarily responsible for the amino acid stimulation of muscle protein anabolism in healthy elderly adults[J]. Am J Clin Nutr, 2003, 78(2): 250-258

[12]陳巍, 侯粉霞, 楊慧芳. 兩年喂飼試驗中Wistar大鼠的攝食量[J]. 中國比較醫(yī)學雜志, 2013(11):18-20.

[13]Kiran T R, Subramanyam M V V, Prathima S, et al, Blood lipid profile and myocardial superoxide dismutase in swim-trained young and middle-aged rats: comparison between left and right ventricular adaptations to oxidative stress[J]. J Comp Physiol, B, 2006, 176(8): 749-762

[14]REN G， YI S, ZHANG H, et al. Ingestion of soy-whey blended protein augments sports performance and ameliorates exercise-induced fatigue in a rat exercise model[J]. Food & function 2017, 8(2): 670-679.

[15]MAHE S, MESSING B, THUILLIER F, et al, Digestion of bovine milk proteins in patients with a high jejunostomy[J].Am J Clin Nutr, 1991, 54(3): 534-538.

[16]TANG J E, PHILLIPS S M. Maximizing muscle protein anabolism: the role of protein quality[J]. Curr Opin Clin Nutr, 2009, 12(1): 66-71.

[17]BORSHEIM E, TIPTON K D, WOLF S E, et al. Essential amino acids and muscle protein recovery from resistance exercise[J]. Am J Physiol: Endocrinol Metab, 2002,283(4): E648-E657.

[18]BROWN E C, DISIVESTRO R A, BABAKNIA A, et al. Soy versus whey protein bars: effects on exercise trainingimpact on lean body mass and antioxidant status[J]. Nutr J,2004, 3(1): 22.

[19]BRANCACCIO P, MAFFULLI N, LIMONGELLI F M. Creatine kinase monitoring in sport medicine[J]. Br. Med Bull, 2007,81/82(1): 209-230.

[20]BRANCACCIO P, LIPPI G, MAFFULLI N. Biochemical markers of muscular damage[J]. Clin Chem Lab Med, 2010, 48(6): 757-767.

[21]BRANCACCIO P, MAFFULLI N, LIMONGELLI F M. Creatine kinase monitoring in sport medicine[J]. Br. Med Bull, 2007, 81/82(1): 209-230.