一株毛色二孢菌發(fā)酵產(chǎn)茉莉酸

董文華，鄭璞，陳鵬程，趙路平

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 無(wú)錫，214122)

茉莉酸(化學(xué)名稱(chēng)3-氧-2-2′-順-戊烯基-環(huán)戊烷-1-乙酸，分子式C12H18O3)是一種新型的植物激素。它普遍存在于植物的花、莖、葉、根等組織、器官中，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[1]；它可作為第二信號(hào)，當(dāng)植物受到生物與非生物的傷害時(shí)誘導(dǎo)激活植物體內(nèi)的防御基因，抵御外界的傷害[2]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，可以代替部分殺蟲(chóng)劑，并可用于提高植物的抗旱性[3]。在香料業(yè)的生產(chǎn)中，茉莉酸及其甲酯因具有清淡、幽雅的香味可作為很多香花精油主香的成分，應(yīng)用于香煙、肥皂、口香糖等的生產(chǎn)中[4]。

DEMOLE最先從素馨花中發(fā)現(xiàn)并提取到茉莉酸類(lèi)似物[6]，但在植物中茉莉酸的含量低(10-9～10-6g/g)，滿足不了當(dāng)今市場(chǎng)的需求。化學(xué)合成法存在反應(yīng)收率不高(30%以下)，反應(yīng)條件苛刻，合成的產(chǎn)物具有外消旋的缺陷，限制了其使用的范圍[7-9]。因此，微生物發(fā)酵生產(chǎn)茉莉酸受到人們的關(guān)注。ALDRIDGE等[10]最早在可可毛色二孢菌(Lasiodiplodiatheobroma)的培養(yǎng)液中，分離到茉莉酸。此外，MIERSCH等[11-12]發(fā)現(xiàn)突變的藤倉(cāng)赤霉菌(Gibberellafujikuroi)在添加了對(duì)氯苯氧乙酸鈉后的發(fā)酵培養(yǎng)液中，也能檢測(cè)到茉莉酸類(lèi)化合物。這些發(fā)現(xiàn)使得用微生物發(fā)酵茉莉酸成為可能。美國(guó)國(guó)際香精香料公司的FARBOOD和BLOCKER等[13]研究了棉色二孢菌(Diplodiagossypina)發(fā)酵產(chǎn)茉莉酸及茉莉酸甲酯的方法，并且比較了不同發(fā)酵培養(yǎng)基、發(fā)酵條件對(duì)該類(lèi)菌產(chǎn)茉莉酸的影響，其中D.gossypinaATCC 10936產(chǎn)茉莉酸質(zhì)量濃度可達(dá)1.2 g/L。印度薩達(dá)爾帕特爾大學(xué)通過(guò)優(yōu)化L.theobromae發(fā)酵培養(yǎng)基的成分，在最佳的培養(yǎng)條件下,L.theobromaeMTCC 3068最高產(chǎn)茉莉酸為225.3 mg/L[5]。國(guó)內(nèi)韓曉敏等[14]研究可可毛色二孢菌對(duì)白木香產(chǎn)生倍半萜的誘導(dǎo)作用時(shí)，在可可毛色二孢菌的培養(yǎng)液中檢測(cè)到茉莉酸類(lèi)化合物，將它們甲酯化后，質(zhì)量濃度為250.55 mg/L。目前國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)茉莉酸發(fā)酵方面的研究報(bào)道。

本文從實(shí)驗(yàn)室保藏和自然界分離收集的121株霉菌中，篩選到1株高產(chǎn)茉莉酸的霉菌，對(duì)其進(jìn)行了菌種鑒定和發(fā)酵條件的研究，為微生物發(fā)酵法生產(chǎn)茉莉酸提供參考。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1菌種

LasiodiplodiairanensisDWH-2保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)CCTCC NO：M2017288，從腐爛的玉蕊根中篩選得到。

1.1.2主要試劑

茉莉酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)買(mǎi)于一飛生物科技有限公司；甲醇、乙腈，色譜純；磷酸、鹽酸，分析純。以上試劑及實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基成分均來(lái)自于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。大豆油購(gòu)于中糧集團(tuán)。薄層層析硅膠板GF254購(gòu)于青島海洋化工廠分廠。

1.1.3培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L)：土豆200，葡萄糖20，瓊脂20，自然pH。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖50,NaNO37.5，KH2PO42.0，KCl 0.3，MgSO4·7H2O 6，F(xiàn)eSO4· 7H2O 0.6，酵母膏1，麥芽提取物2，微量元素10ml/L pH 5.5。

微量元素：ZnSO4· 7H2O 0.03 g/L，MnSO4·7H2O 0.003 g/L，CuSO4· 7H2O 0.003 g/L，Na2MoO4·2H2O 0.003 g/L。

優(yōu)化后發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖50，NaNO34.5，KH2PO42.0，KCl 0.4，MgSO4·7H2O 6，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.9，玉米漿1.5，大豆油10，微量元素10 ml/L pH 5.5。

1.1.4主要儀器與設(shè)備

SW-CJ-IFD超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；Quanta-200掃描電子顯微鏡，荷蘭FEI公司；高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司；ZD-2雷磁自動(dòng)滴定儀，上海儀電科技有限公司；SHIMADZU GCMS-QP2010 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1產(chǎn)茉莉酸菌株的篩選

在PDA平板上活化實(shí)驗(yàn)室保存的霉菌，并將其接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)6 d后，取處理好的發(fā)酵上清液，用薄層層析(thin layer chromatography, TLC)方法進(jìn)行初步的定性分析。收集果蔬、植物等的腐爛部位，每份篩菌材料經(jīng)過(guò)相同的處理之后稀釋涂布于PDA抗性平板上(100 mg/L的氯霉素)，28 ℃培養(yǎng)4 d，觀察菌落形態(tài)，挑出單菌落，培養(yǎng)后將其接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)6 d后，取發(fā)酵上清液,處理后通過(guò)TLC方法進(jìn)行初步的定性分析。

1.2.2種子培養(yǎng)

斜面種子接于PDA平板上，在28 ℃下培養(yǎng)。

1.2.3發(fā)酵培養(yǎng)基碳源的確定

按1.2.2的種子培養(yǎng)方法，分別以等碳摩爾數(shù)的蔗糖、乳糖、淀粉、麥芽糖、葡萄糖、果糖為唯一碳源，根據(jù)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)物質(zhì)量濃度確定最合適的碳源后，設(shè)置25、50、75、100、125、150 g/L的碳源質(zhì)量濃度梯度，確定碳源的最適質(zhì)量濃度。

1.2.4發(fā)酵培養(yǎng)基無(wú)機(jī)氮源的確定

按1.2.2的種子培養(yǎng)方法及1.2.3確定的碳源，分別以等氮摩爾數(shù)的NaNO3、脲素、NH4NO3、NH4Cl、(NH4)2SO4為唯一無(wú)機(jī)氮源，根據(jù)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)物質(zhì)量濃度確定最合適的無(wú)機(jī)氮源后，設(shè)置3、4.5、6、7.5、9、10.5 g/L的無(wú)機(jī)氮源質(zhì)量濃度梯度，確定無(wú)機(jī)氮源的最適質(zhì)量濃度。

1.2.5發(fā)酵培養(yǎng)基有機(jī)氮源的確定

按1.2.2的種子培養(yǎng)方法及1.2.3確定的碳源、1.2.4確定的無(wú)機(jī)氮源，將牛肉膏、蛋白胨、玉米漿、酵母膏、麥芽提取物分別以2 g/L的添加量作為唯一的有機(jī)氮源加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，且以初始培養(yǎng)基中同時(shí)添加酵母膏、麥芽提取物為對(duì)照組, 根據(jù)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)物質(zhì)量濃度確定最合適的有機(jī)氮源后，設(shè)置1、1.5、2、2.5、3 g/L的有機(jī)氮質(zhì)量濃度梯度，確定有機(jī)氮源的最適質(zhì)量濃度。

1.2.6發(fā)酵培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽及微量元素的確定

按1.2.2的種子培養(yǎng)方法及1.2.3確定的碳源、1.2.4確定的無(wú)機(jī)氮源、1.2.5確定的有機(jī)氮源，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)考察KH2PO4、KCl、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O以及微量元素濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)以及產(chǎn)物質(zhì)量濃度的影響。

1.2.7發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH的確定

在以上培養(yǎng)基成分優(yōu)化的基礎(chǔ)上，按1.2.2的種子培養(yǎng)方法，設(shè)置發(fā)酵的初始pH為4.5、5.5、6.5、7.5、8.5，發(fā)酵7 d。

1.2.8裝液量的確定

在以上培養(yǎng)基成分優(yōu)化的基礎(chǔ)上，按1.2.2的種子培養(yǎng)方法、1.2.7確定的最適初始pH，設(shè)置500 mL搖瓶的裝液量為50、100、150、200、250 mL，發(fā)酵7 d。

1.2.9發(fā)酵溫度的確定

在以上培養(yǎng)基成分優(yōu)化的基礎(chǔ)上，按1.2.2的種子培養(yǎng)方法、1.2.7確定的最適初始pH、1.2.8確定的最適裝液量，設(shè)置培養(yǎng)溫度分別為20、25、28、30、35、40 ℃，發(fā)酵7 d。

1.2.10大豆油添加量的確定

在以上培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，按1.2.2的種子培養(yǎng)方法設(shè)置大豆油的濃度為1、5、10、15、20 g/L五個(gè)質(zhì)量濃度梯度，發(fā)酵7 d，根據(jù)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)物質(zhì)量濃度確定最合適的大豆油添加量。

1.2.11發(fā)酵罐上的初步擴(kuò)大培養(yǎng)

在以上培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，在3 L的發(fā)酵罐中裝液量1.5 L，發(fā)酵12 d，測(cè)定茉莉酸的含量。

1.3　分析方法

1.3.1TLC檢測(cè)方法

取適量的發(fā)酵液與茉莉酸標(biāo)樣一起點(diǎn)于硅膠板上，將點(diǎn)好的薄層板放在展缸中，待展開(kāi)劑前沿跑到板長(zhǎng)的2/3處時(shí)將其取出，晾干，噴灑顯色劑，加熱一段時(shí)間，觀察是否有與標(biāo)樣一樣的紅色斑點(diǎn)出現(xiàn)。

展開(kāi)劑V(正己烷)∶V(乙酸乙酯)∶V(醋酸)=60∶40∶1

顯色劑V(濃硫酸)∶V(甲醇)=1∶1

1.3.2HPLC檢測(cè)方法

取適量發(fā)酵液12 000 r/min離心15 min，取上清液與等體積的甲醇混合后過(guò)膜，通過(guò)HPLC檢測(cè)。

色譜條件，色譜柱：Amethyst C18-H(4.6 mm×250 mm，5 μm)反相色譜柱，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，柱溫35 ℃，流動(dòng)相為V(甲醇)∶V(0.1%磷酸)=11∶9，進(jìn)樣量為20 μL，流速1 mL/min。

1.3.3GC-MS檢測(cè)

氣質(zhì)條件：色譜柱(DB-5 ms，30.0 m×0.25 mm×0.25 μm),初始溫度60 ℃，保持時(shí)間0.6 min，終溫度為280 ℃。柱箱溫度60 ℃，進(jìn)樣口溫度270 ℃，進(jìn)樣方式不分流，離子源溫度200 ℃，接口溫度280 ℃。

1.3.4生物量的測(cè)定

發(fā)酵結(jié)束后，取出菌體放于已稱(chēng)重的烘干濾紙上，于70 ℃真空干燥箱中烘至恒重，以恒重減去濾紙重即得菌體的質(zhì)量。

1.4　菌種鑒定

1.4.1菌株DWH-2電鏡方法

挑取適量的生長(zhǎng)旺盛的菌體，用5%戊二醛進(jìn)行前固定，0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗；1%鋨酸進(jìn)行后固定，0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗；后用乙醇梯度脫水，在臨界點(diǎn)干燥后將樣品粘貼于樣品臺(tái)，離子濺射儀鍍膜后置于掃描電子顯微鏡下觀察。

1.4.2菌株DWH-2 ITS鑒定方法

菌株基因組DNA用Ezup柱式真菌基因組抽提試劑盒進(jìn)行提取，ITS區(qū)域的擴(kuò)增選擇真核生物ITS的通用擴(kuò)增引物：

ITS1 5’ -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’

ITS4 5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’

PCR反應(yīng)體系：

Template(基因組 DNA20-50 ng/μL)0.5 μL

10×Buffer(with Mg2+)2.5 μL

dNTP(各2.5 mmol/L)1.0 μL

Taq聚合酶0.2 μL

上游引物0.5 μL

下游引物0.5 μL

加雙蒸水至25 μL

PCR循環(huán)條件為94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，進(jìn)行測(cè)序。

2　結(jié)果與討論

2.1　產(chǎn)茉莉酸菌株的篩選及其產(chǎn)物鑒定

按1.2.1的篩選方法，將得到的121株菌發(fā)酵后用TLC方法分析發(fā)酵上清液，得到3株疑似產(chǎn)茉莉酸的菌株，TLC圖譜如圖1所示。對(duì)這3株菌進(jìn)行復(fù)篩，用GC-MS對(duì)發(fā)酵液中的產(chǎn)物鑒定，證實(shí)它們的發(fā)酵液中存在茉莉酸，如圖2所示，經(jīng)HPLC測(cè)定，DWH-2合成茉莉酸的量最多，質(zhì)量濃度達(dá)到320 mg/L。

圖1　部分菌株發(fā)酵液TLC圖譜Fig.1　TLC patterns of some strains

a-發(fā)酵液產(chǎn)物GC分析；b-茉莉酸MS分析圖2　菌株DWH-2發(fā)酵液GC-MS定性分析Fig.2　GC-MS analysis of fermentation broth of DWH-2

2.2　高產(chǎn)菌DWH-2的鑒定

DWH-2形態(tài)特征：DWH-2在PDA平板上生長(zhǎng)時(shí)，菌落的正面為白色，絨毛狀，菌絲疏松，呈蔓延生長(zhǎng)狀態(tài)(培養(yǎng)初期背面為白色，4 d后變?yōu)榫G色，最后為黑色)。在透射電鏡下觀察到該菌的分生孢子呈卵圓形或橢圓形，平均長(zhǎng)度均小于25 μm，表面光滑，具有縱條紋。

ITS鑒定：真核生物rDNA的ITS區(qū)段既具有保守性又在科、屬、種水平上具有差異性，常用其來(lái)鑒定真核微生物。將生長(zhǎng)旺盛的DWH-2送至上海生工進(jìn)行ITS測(cè)序，得到了大小為519 bp的序列。在NCBI中檢索與該菌株序列相似性較高的菌株，結(jié)果表明DWH-2與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中二孢屬的多株菌同源性高達(dá)98%～100%。下載了同源性較高的菌株序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)DWH-2與菌株LasiodiplodiairanensisisolateCMW25232親緣關(guān)系最近，并將其命名為L(zhǎng)asiodiplodiairanensisDWH-2。以菌株DWH-2的ITS序列為基礎(chǔ)構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)如圖4所示。

a，b-DWH-2在平板上生長(zhǎng)的正面與背面;c，d-DWH-2電鏡圖圖3　菌株DWH-2形態(tài)學(xué)鑒定Fig.3　Morphological identification of strain DWH-2

圖4　基于菌株DWH-2的ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4　Phylogenetic tree of strain DWH-2 based onITS sequences

2.3　發(fā)酵培養(yǎng)基碳源的確定

在以蔗糖、麥芽糖、葡萄糖為唯一碳源時(shí)，菌體的生物量均可達(dá)17 g/L左右，但是以蔗糖為碳源時(shí)產(chǎn)物質(zhì)量濃度要明顯高于其他碳源，達(dá)到了342 mg/L，如圖5所示，所以選擇蔗糖為最適碳源；確定蔗糖的最適質(zhì)量濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，在發(fā)酵過(guò)程中，隨著蔗糖含量的增加，菌體的生物量也在增加，但產(chǎn)物的質(zhì)量濃度卻在蔗糖質(zhì)量濃度為50 g/L時(shí)達(dá)到最高值，為437 mg/L，所以產(chǎn)物的產(chǎn)生不需要很高的糖含量，故采用50 g/L為蔗糖的最佳質(zhì)量濃度。

圖5　不同碳源對(duì)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)物質(zhì)量濃度的影響Fig.5　Effects of different carbon sources on cellgrowth and product concentration

圖6　蔗糖濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)物濃度的影響Fig.6　Effects of sucrose concentration on cellgrowth and product concentration

2.4　發(fā)酵培養(yǎng)基無(wú)機(jī)氮源的確定

在以硝酸鈉為唯一無(wú)機(jī)氮源時(shí)，不論是產(chǎn)物質(zhì)量濃度還是菌體的生物量都明顯高于其他的無(wú)機(jī)氮源，故選擇硝酸鈉為最適的無(wú)機(jī)氮源(圖7)；為了考察硝酸鈉的最適質(zhì)量濃度，設(shè)置了6個(gè)質(zhì)量濃度梯度，結(jié)果如圖8所示，隨著硝酸鈉質(zhì)量濃度的增加菌體的生物量也呈現(xiàn)不斷增加的趨勢(shì)，說(shuō)明硝酸鈉對(duì)菌體的生長(zhǎng)有顯著的影響，但是產(chǎn)物的質(zhì)量濃度卻呈現(xiàn)與之相反的趨勢(shì)，先增加后減少。在硝酸鈉質(zhì)量濃度為4.5 g/L時(shí)，產(chǎn)物質(zhì)量濃度最高，達(dá)到688 mg/L，故選用4.5 g/L作為硝酸鈉的最適質(zhì)量濃度。

圖7　不同無(wú)機(jī)氮源對(duì)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)物濃度的影響Fig.7　Effects of different inorganic nitrogen sourceson cell growth and product concentration

圖8　硝酸鈉質(zhì)量濃度對(duì)菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)物的影響Fig.8　Effects of sodium nitrate concentration oncell growth and product concentration

2.5　發(fā)酵培養(yǎng)基有機(jī)氮源的確定

以對(duì)照組為參照，以玉米漿為唯一的有機(jī)氮源時(shí)，產(chǎn)物質(zhì)量濃度是最高的，為700 mg/L，如圖9所示，此時(shí)的生物量為13.9 g/L略低于對(duì)照組的15.3 g/L，綜合考慮選擇玉米漿做為唯一的有機(jī)氮源；為了確定最適的玉米漿添加量，設(shè)置了5個(gè)梯度，結(jié)果如圖10。從圖10可以看出，玉米漿質(zhì)量濃度對(duì)菌體的生物量有一定的影響，但對(duì)產(chǎn)物質(zhì)量濃度沒(méi)有明顯的影響，在1～3 g/L的范圍內(nèi)產(chǎn)物質(zhì)量濃度基本保持在680～715 mg/L之間，但在1.5 g/L時(shí)，產(chǎn)物質(zhì)量濃度最高為715 mg/L，故選擇1.5 g/L為最適的有玉米漿質(zhì)量濃度。

圖9　有機(jī)氮源對(duì)菌體及產(chǎn)物質(zhì)量濃度的影響Fig.9　Effects of organic nitrogen on cellgrowth and product concentration

圖10　玉米漿質(zhì)量濃度對(duì)菌體及產(chǎn)物濃度的影響Fig.10　Effects of corn syrup concentration oncell growth and product concentration

2.6　發(fā)酵培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽及微量元素的確定

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)考察了KH2PO4、KCl、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O以及微量元素對(duì)茉莉酸合成及菌體的影響，設(shè)計(jì)了5因素4水平的正交實(shí)驗(yàn)L16(45)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2。

微量元素配方：FeSO4·7H2O 0.6 g/L；ZnSO4·7H2O 0.03 g/L；MnSO4·7H2O 0.003 g/L；CuSO4·7H2O 0.003 g/L；二水合鉬酸鈉0.003 g/L。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O是最顯著的2個(gè)影響因素，以茉莉酸的產(chǎn)量為標(biāo)準(zhǔn)，得到的無(wú)機(jī)鹽的最優(yōu)組合為：KH2PO42 g/L、KCl 0.4 g/L、MgSO4·7H2O 6 g/L、FeSO4·7H2O 0.9 g/L、微量元素10 mL/L。

表1　不同元素水平Table 1　Levels of different elements

表2　無(wú)機(jī)鹽及微量元素正交表Table 2　Inorganic salts and trace elements orthogonal table

2.7　發(fā)酵初始pH對(duì)菌株產(chǎn)茉莉酸的影響

發(fā)酵液的pH在發(fā)酵過(guò)程中隨菌體生長(zhǎng)情況的變化而變化，從而影響代謝產(chǎn)物的分泌。從圖11可以看出在發(fā)酵過(guò)程中，隨著pH的升高，菌體的生物量及產(chǎn)物濃度都呈現(xiàn)一個(gè)先增加后降低的趨勢(shì)，在pH為4.5的時(shí)候，有產(chǎn)物的產(chǎn)生，但菌體的生物量偏低，在pH為5.5時(shí)，產(chǎn)物濃度及菌體量都達(dá)到了最高值，故確定發(fā)酵初始pH為5.5。

圖11　初始pH對(duì)菌體及產(chǎn)物質(zhì)量濃度的影響Fig.11　Effect of initial pH on cell growth and productconcentration

2.8　裝液量對(duì)菌株產(chǎn)茉莉酸的影響

絕大多數(shù)微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中是需要氧的，發(fā)酵過(guò)程中裝液量的多少直接影響發(fā)酵液中所溶解氧的濃度，進(jìn)而影響菌體的生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)物的分泌。由圖12可知，當(dāng)裝液量為50 mL/500 mL時(shí)，菌體的生物量達(dá)到最大值為17.5 g/L，隨著裝液量的增加菌體生物量在減少而產(chǎn)物濃度卻先增加后減少，說(shuō)明該菌的生長(zhǎng)是需要氧的，但產(chǎn)物的產(chǎn)生卻不需要太多的氧。裝液量為100 mL/500 mL時(shí)產(chǎn)物濃度達(dá)到最大，故選擇100 mL/500 mL為最佳裝液量。

2.9　發(fā)酵溫度的確定

溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)物的分泌有重要的影響，溫度的高低會(huì)影響菌體所產(chǎn)酶的活性從而影響次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。如圖13所示，該菌株的最適生長(zhǎng)溫度為25～30 ℃，高于30 ℃菌體幾乎不生長(zhǎng)。且產(chǎn)物產(chǎn)生的最適溫度與菌體生長(zhǎng)的最適溫度基本保持一致，在28 ℃時(shí)，產(chǎn)物濃度達(dá)762 mg/L，故選28 ℃為最適的發(fā)酵溫度。

圖12　裝液量對(duì)菌體及產(chǎn)物濃度的影響Fig.12　Effect of liquid volume on cell growth and productconcentration

圖13　發(fā)酵溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)物濃度的影響Fig.13　Effect of temperature on cell growth andproduct concentration

2.10　大豆油添加量的確定

茉莉酸合成途徑中的第一個(gè)關(guān)鍵酶為脂氧合酶，大豆油可以提高脂氧合酶的活性，所以在發(fā)酵過(guò)程中加入適量的大豆油以期提高茉莉酸的產(chǎn)量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖14所示。添加大豆油后產(chǎn)物的濃度有所提高，基本上在1 100～1 540 mg/L的范圍內(nèi)，在大豆油添加量為10 g/L時(shí)，產(chǎn)物濃度達(dá)到最高為1 543 mg/L。由此可以看出，大豆油可以提高產(chǎn)物濃度，可能的原因就是大豆油的加入提高了該合成途徑中第一個(gè)關(guān)鍵酶脂氧合酶的活性，且大豆油也可作為發(fā)酵碳源，使最終的產(chǎn)物濃度增加。

圖14　大豆油添加量對(duì)菌體及產(chǎn)物質(zhì)量濃度的影響Fig.14　Effects of Soybean Oil concentration on cellgrowth and product concentration

2.11　發(fā)酵罐上的初步擴(kuò)大培養(yǎng)

在以上優(yōu)化的基礎(chǔ)上把該菌株在3 L的發(fā)酵罐上做了一次初步的擴(kuò)大培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖15所示。在發(fā)酵過(guò)程中pH先降低后升高，茉莉酸的產(chǎn)生與菌株的生長(zhǎng)也不是同步的，而是在發(fā)酵的第四天開(kāi)始出現(xiàn)，此時(shí)pH也在開(kāi)始回升，在發(fā)酵后期當(dāng)pH接近于8時(shí)，茉莉酸積累量減少且出現(xiàn)分解的現(xiàn)象，發(fā)酵過(guò)程茉莉酸最高積累量達(dá)1 292 mg/L。發(fā)酵到12 d時(shí)，茉莉酸的積累量開(kāi)始下降，并且與搖瓶發(fā)酵相比，發(fā)酵罐上的發(fā)酵周期較長(zhǎng)，說(shuō)明發(fā)酵罐的發(fā)酵條件有待進(jìn)一步研究。

圖15　發(fā)酵罐中菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)物積累情況Fig.15　Cell growth and accumulation of product in fermenter

3　結(jié)論

本文從121株霉菌中篩選到1株高產(chǎn)茉莉酸的菌株LasiodiplodiairanensisDWH-2，并對(duì)該菌株產(chǎn)茉莉酸的發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽及發(fā)酵條件如pH、溫度、裝液量等做了初步優(yōu)化，使茉莉酸的產(chǎn)量由原來(lái)的320 mg/L提高到1 543 mg/L。并且在3 L發(fā)酵罐上擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)，DWH-2可以產(chǎn)1 292 mg/L的茉莉酸。

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