乳酸桿菌作用下香蕉抗性淀粉的體外發(fā)酵研究

白永亮，凌志洲，林燕丹，夏雨

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東佛山 528000；2.咀香園健康食品（中山）有限公司，廣東中山528437）

一個(gè)健康成人體內(nèi)的微生物細(xì)胞數(shù)量共有1014個(gè)，其中大量的微生物寄居在腸道中[1-2]。乳酸桿菌通常定植在人或動(dòng)物的口腔和腸道中，屬于革蘭氏陽(yáng)性無(wú)芽孢菌，一般為細(xì)長(zhǎng)的桿狀、大多呈鏈狀排列[3]。作為腸道內(nèi)最有利的一種益生菌，乳酸桿菌對(duì)人體的正常代謝活動(dòng)、營(yíng)養(yǎng)吸收起到非常重要的作用。乳酸桿菌可以通過(guò)其代謝產(chǎn)物降低腸道的pH值，從而抑制有害菌生長(zhǎng)，具有減少體內(nèi)毒素，保護(hù)腸道黏膜，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力，并預(yù)防一些胃腸道疾病的發(fā)生[4]。

人體超過(guò)50%人的飲食熱量來(lái)源于淀粉基質(zhì)食品，而淀粉基質(zhì)食品的質(zhì)量和數(shù)量直接影響到人體血糖與體內(nèi)代謝平衡?？剐缘矸郏≧esistant starch，RS）的發(fā)現(xiàn)被認(rèn)為是最近二十年來(lái)碳水化合物在人體健康應(yīng)用方面的重大進(jìn)展[5]?？剐缘矸塾址Q抗酶解淀粉及難消化淀粉，在人體小腸中不被消化吸收，在大腸內(nèi)被微生物利用發(fā)酵產(chǎn)酸，同時(shí)厭氧微生物降解有機(jī)質(zhì)產(chǎn)生代謝物用于菌體生長(zhǎng)，引起微生物菌群的變化[5-7]。近年來(lái)的研究已初步證明，RS在大腸被生理性細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)生多種短鏈脂肪酸（Short chain fatty acid，SCFA）和氣體，有助于降低大腸pH值，減少結(jié)腸癌發(fā)病率，抑制致病菌生長(zhǎng)和繁殖[8]，同時(shí)促進(jìn)腸道內(nèi)益生菌的生長(zhǎng)和繁殖[9-10]。SCFAs對(duì)宿主能能產(chǎn)生重要的生理作用，如降低胞內(nèi)pH值，促進(jìn)礦物質(zhì)吸收，減少結(jié)腸內(nèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物膽汗酸的生成，以及影響大腸內(nèi)微生物菌群分布等[11-14]。在SCFAs中，丁酸是大腸細(xì)胞優(yōu)先的能量來(lái)源，能抑制腸癌細(xì)胞的擴(kuò)散[11]，研究發(fā)現(xiàn)其與糖尿病、結(jié)腸癌和肥胖有關(guān)[5，15-20]。

抗性淀粉可分為4種類型：RS1是物理包埋淀粉，RS2天然抗性淀粉，RS3是回生淀粉和RS4是化學(xué)改性淀粉[21]。不同來(lái)源抗性淀粉在腸道中發(fā)酵情況不同，謝濤[22]等研究了4種淀粉樣品都能促進(jìn)短鏈脂肪酸（SCFAs）總量的增加，其中土豆回生淀粉（RS3）、交聯(lián)淀粉（RS4）與 Novelose 230（RS2）特別有利于促進(jìn)丁酸的生成。土豆回生淀粉（RS3）與交聯(lián)淀粉（RS4）能夠改善人體腸道菌群的分布、促進(jìn)SCFAs特別是丁酸的生成。青香蕉富含天然抗性淀粉，以其致密的顆粒結(jié)構(gòu)和晶體結(jié)構(gòu)而不能被人體小腸消化吸收，被認(rèn)為是第二類型的抗性淀粉（RS2）[23]。本試驗(yàn)?zāi)M香蕉抗性淀粉在小腸液、胃液中的消化過(guò)程，研究消化后香蕉抗性淀粉對(duì)乳酸桿菌的生長(zhǎng)繁殖影響以及乳酸桿菌對(duì)香蕉抗性淀粉的體外發(fā)酵作用，為益生菌制劑提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

青香蕉：廣州華工市場(chǎng)；EMB瓊脂培養(yǎng)基、腸道增菌肉湯：青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；甲酸、乙酸、丙酸、丁酸標(biāo)準(zhǔn)品，正己烷（色譜純）、乳酸檢測(cè)試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2　儀器與設(shè)備

5975-7890型氣相色譜儀：安捷倫科技有限公司；TDL-5-A離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；UV3010分光光度計(jì)：日本日立公司；DGG-9070B電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3　試驗(yàn)方法

1.3.1　香蕉抗性淀粉的制備

選擇采前8成～9成熟的青香蕉，徹底清洗干凈后去皮，切片并置于一定比例的VC、檸檬酸和亞硫酸氫鈉護(hù)色液中浸10 min，將香蕉肉與護(hù)色液按一定比例（1∶2）混合后打漿，4 000 r/min離心15 min。取沉淀在50℃烘干，打粉后過(guò)100目篩制得香蕉抗性淀粉，密封備用。

1.3.2　消化液的制備

分別配制人工胃液和人工腸液。

1.3.2.1　人工胃液配制

取稀鹽酸（9.5%～10.5%）10 mL，加蒸餾水稀釋至體系pH值為1.5左右。然后按照1 g/100 mL的質(zhì)量濃度比加入胃蛋白酶，充分溶解后用孔徑0.20 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，即得人工胃液。

1.3.2.2　人工小腸液配制

取磷酸二氫鉀6.8 g，用900 mL水溶解后，再用0.4%的氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至6.8左右，然后分別加入10 g胰蛋白酶和10 g胰淀粉酶，充分溶解后，最后加水定容至1 000 mL，用孔徑0.20 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，備用。

1.3.3　消化模擬

采用Jenkins[24]提出的In-Vitro消化模型進(jìn)行消化模擬試驗(yàn)。分別稱取一定量的青香蕉淀粉浸入人工胃液、人工小腸液中，置于37℃水浴中振蕩。隔一定時(shí)間取樣，利用滲析袋模擬人體腸道來(lái)分離淀粉的消化產(chǎn)物，并將滲析袋內(nèi)的殘留物低溫（50℃以下）烘干后干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4　乳酸桿菌的富集培養(yǎng)

取健康大鼠糞便，將糞便樣品按質(zhì)量比1∶10的比例接入已滅菌的生理鹽水，充分震蕩，用四層無(wú)菌紗布過(guò)濾，制成樣品液，梯度稀釋后接種于EMB培養(yǎng)基，接種量為1 mL。于37℃厭氧培養(yǎng)48 h，選擇性培養(yǎng)乳酸桿菌。選擇性培養(yǎng)后，分別接種于9 mL腸道增菌肉湯（EE），37℃富集培養(yǎng)24 h。

1.3.5　香蕉抗性淀粉對(duì)乳酸桿菌生長(zhǎng)繁殖的影響

取菌液1 mL，加入到裝有9 mL PBS緩沖液（pH7.4）的EP管中，混勻。然后，按菌落計(jì)數(shù)的方法梯度稀釋，取1 mL接種于添加有胃液和小腸液消化后香蕉抗性淀粉（20 g/L）的EMB選擇性培養(yǎng)基上，培養(yǎng)一定時(shí)間后菌落計(jì)數(shù)，以不添加香蕉抗性淀粉為空白對(duì)照組，觀察菌落生長(zhǎng)狀況。

1.3.6　建立體外發(fā)酵模擬試驗(yàn)

上述富集培養(yǎng)結(jié)束后，立即取菌液接種于含胃液和小腸液消化后的香蕉抗性淀粉的發(fā)酵培養(yǎng)基。分別厭氧培養(yǎng) 0 、4、8、12、16、20 h 后，測(cè)定其管內(nèi)溶液 pH值，同時(shí)將管內(nèi)培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移入已滅菌的15 mL聚乙烯管，加入0.5 mL 2%CuSO2溶液將菌殺死，于-20℃保存，測(cè)定短鏈脂肪酸和乳酸。

1.3.7　短鏈脂肪酸的提取及檢測(cè)[25]

發(fā)酵液離心（3 000 r/min，15 min）。吸取5 mL上清液，14 mL 0.36 mol/L HClO4和 13.5 mL 1 mol/L NaOH，劇烈振蕩。加入2.5 mL 5 mol/L磷酸，劇烈振蕩。加入15 mL 1%濃H2SO4的甲醇溶液，70℃回流30 min。然后加入15 mL冷的正己烷提取。吸取1 μL有機(jī)層，上柱分析。

氣相色譜測(cè)定條件：載氣為N2，分流比80∶1，流速64 mL/min。采用 ZB-WAX，30 m×250 μm×0.25 μm。檢測(cè)器為FID，檢測(cè)器溫度為260℃。升溫程序：50℃保持5 min，然后以5℃/min升溫到100℃，再以20℃/min升溫到180℃，共運(yùn)行19 min。

1.3.8　乳酸檢測(cè)

1.3.8.1　樣品預(yù)處理

將樣品發(fā)酵液、培養(yǎng)液用生理鹽水稀釋到適當(dāng)濃度，使測(cè)定絕對(duì)OD值（測(cè)定OD-空白OD）在0.05～0.35之間。

1.3.8.2　測(cè)定操作

按表1加樣混勻后，于530 nm，1 cm光鏡，雙蒸水調(diào)零，測(cè)定各管吸光值。乳酸測(cè)定見表1。

表1　乳酸測(cè)定Table 1　Determination of lactic acid

1.3.8.3　乳酸含量計(jì)算

2　結(jié)果與分析

2.1　香蕉抗性淀粉對(duì)乳酸桿菌生長(zhǎng)繁殖的影響作用

2.1.1　香蕉抗性淀粉對(duì)乳酸桿菌的生長(zhǎng)狀況的影響

圖1為香蕉抗性淀粉對(duì)乳酸桿菌生長(zhǎng)狀況的影響，香蕉抗性淀粉已經(jīng)過(guò)胃液和小腸液消化處理，空白對(duì)照培養(yǎng)基不添加香蕉抗性淀粉。

圖1　乳酸桿菌的生長(zhǎng)狀況Fig.1　The growth of lactobacillus

由圖1可看出，添加香蕉抗性淀粉后，乳酸桿菌的數(shù)量明顯增加。由此可知，香蕉抗性淀粉有利于乳酸桿菌的生長(zhǎng)繁殖，可作為其碳源利用。雖然目前關(guān)于抗性淀粉是如何促進(jìn)腸道菌群生長(zhǎng)的，還未知其分解機(jī)理。但根據(jù)我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)腸道菌利用后的淀粉顆粒表面明顯形成了空洞，這證明了抗性淀粉確實(shí)作為腸道菌的唯一碳源被利用。此外，還有可能是前期的人工胃液和小腸液的處理，促進(jìn)了抗性淀粉可被利用的程度[26]。

2.1.2　培養(yǎng)液pH值的變化

乳酸桿菌富集培養(yǎng)后接種于含有消化后的香蕉抗性淀粉發(fā)酵培養(yǎng)基，厭氧培養(yǎng) 0、4、8、12、16、20 h 后發(fā)酵液的pH值變化情況如圖2。

圖2　乳酸桿菌發(fā)酵液的pH值變化Fig.2　Changes in pH of lactobacillus fermentation

由圖2可知，乳酸桿菌在發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液的pH值隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，從0 h的7.2下降到20 h后的4.8?？梢娙樗釛U菌能很好地利用香蕉抗性淀粉產(chǎn)酸，維持腸道的酸性環(huán)境。

2.2　乳酸桿菌對(duì)香蕉抗性淀粉的發(fā)酵特性分析

胃液和小腸液消化后的香蕉抗性淀粉經(jīng)乳酸桿菌分別發(fā)酵 4、8、12、16、20 h 后，發(fā)酵液中各種短鏈脂肪酸含量和總酸含量的變化情況如圖3和圖4。

圖3　乳酸桿菌發(fā)酵液中SCFA含量的變化Fig.3　Changes of SCFA content of lactobacillus fermentation fluid

圖4　乳酸桿菌發(fā)酵液中SCFA的總酸含量變化Fig.4　The total acid content of SCFA in lactobacillus fermentation fluid

由圖3可知，發(fā)酵液中乙酸、丙酸和丁酸的含量均隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。甲酸在發(fā)酵4 h后基本穩(wěn)定在26 mmol/L左右；乙酸在發(fā)酵12 h時(shí)有明顯增加，12 h后增加速率減緩，20 h后達(dá)到29.23 mmol/L；丙酸含量在發(fā)酵過(guò)程中穩(wěn)步提升，發(fā)酵20 h后可達(dá)到33.28mmol/L；丁酸含量在發(fā)酵4h時(shí)達(dá)到21.88mmol/L，之后緩慢增加，發(fā)酵20 h后達(dá)到25.41 mmol/L；發(fā)酵液中短鏈脂肪酸的總酸含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)均有所增加，且增長(zhǎng)速率較為一致。發(fā)酵20 h后，總酸含量達(dá)到113.46 mmol/L?？傮w來(lái)看，乳酸桿菌能夠發(fā)酵香蕉抗性淀粉產(chǎn)生短鏈脂肪酸，但產(chǎn)酸能力略低于雙歧桿菌[27]。且隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，乙酸和丙酸的產(chǎn)量增長(zhǎng)較明顯，這與相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道結(jié)果基本一致[28-29]。

短鏈脂肪酸的種類和數(shù)量主要受發(fā)酵底物的種類、數(shù)量、降解速率以及腸道菌群及宿主生理狀態(tài)等因素的影響。不同酵解底物產(chǎn)生的短鏈脂肪酸總量和比例不同，對(duì)腸道生理功效也不相同。在機(jī)體內(nèi)大部分乙酸被吸收入血液，進(jìn)入肝臟的代謝，作為周邊組織的能源，是機(jī)體從小腸不能吸收的碳水化合物中獲取能量的主要途徑。丙酸經(jīng)結(jié)腸吸收后主要由肝臟代謝用作能源，并且能夠抑制膽固醇的合成。

2.3　發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的乳酸含量變化

經(jīng)胃液和小腸液消化后的香蕉抗性淀粉經(jīng)乳酸桿菌分別發(fā)酵 4、8、12、16、20 h 后，發(fā)酵液中乳酸含量變化情況如圖5。

圖5　乳酸桿菌發(fā)酵液中乳酸含量的變化Fig.5　The change of lactobacillus lactic acid content in the fermented liquid

發(fā)酵過(guò)程中乳酸含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而緩慢增加，增長(zhǎng)速率基本本不變。發(fā)酵20 h后，乳酸含量達(dá)到4.53 mmol/L。說(shuō)明乳酸桿菌在發(fā)酵香蕉抗性淀粉時(shí)產(chǎn)生乳酸，但產(chǎn)量均在5 mmol/L以下，產(chǎn)乳酸的能力明顯低于雙歧桿菌[27]。乳酸產(chǎn)量是反映乳酸桿菌生理活性的重要指標(biāo)，有研究發(fā)現(xiàn)乳酸可能是直腸菌群發(fā)酵利用香蕉淀粉產(chǎn)生的中間代謝物，能為腸道其它菌群提供能源[30]。

2.4　消化途徑對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響

圖6為不同消化處理后香蕉抗性淀粉發(fā)酵產(chǎn)物（短鏈脂肪酸）的含量分析。

圖6　消化途徑對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的影響Fig.6　The effects of digestive pathways on fermentation products

由圖6可看出，4種樣品的發(fā)酵產(chǎn)物中總酸含量大小依次為：胃液和小腸液消化后＞小腸液消化后＞胃液消化后＞原淀粉。分別經(jīng)胃液消化的香蕉淀粉和經(jīng)小腸液消化的香蕉抗性淀粉總酸產(chǎn)量相差不大，而經(jīng)胃液和小腸液消化的香蕉淀粉的總酸含量提高較為明顯，達(dá)到112.95 mmol/L。

3　結(jié)論

我國(guó)香蕉資源豐富，且青香蕉富含天然抗性淀粉和膳食纖維，是制備高附加值抗性淀粉產(chǎn)品的良好來(lái)源。本試驗(yàn)結(jié)果表明，培養(yǎng)基中添加香蕉抗性淀粉后，乳酸桿菌的數(shù)量明顯增加，發(fā)酵20 h后，乳酸桿菌短鏈脂肪酸總酸含量達(dá)到113.46 mmol/L，乳酸含量達(dá)到4.53 mmol/L。說(shuō)明香蕉抗性淀粉能夠促進(jìn)對(duì)乳酸桿菌的生長(zhǎng)繁殖；通過(guò)體外消化和發(fā)酵模擬的研究發(fā)現(xiàn)，胃液和小腸液消化均使香蕉抗性淀粉發(fā)酵產(chǎn)物（短鏈脂肪酸）的含量比原淀粉高，表明胃液和小腸液的消化提高了香蕉抗性淀粉在大腸中的發(fā)酵作用，消化后的香蕉抗性淀粉更有利于腸道微生物的利用；隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵產(chǎn)物中甲酸的含量變化不大，而乙酸、丙酸、丁酸、短鏈脂肪酸的總酸和乳酸含量均有提高。本文基于香蕉抗性淀粉的發(fā)酵特性，初步研究了香蕉抗性淀粉與乳酸桿菌的相互作用，但對(duì)香蕉抗性淀粉的酵解機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。而香蕉抗性淀粉如何通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸進(jìn)一步發(fā)揮相應(yīng)的生理功能也需進(jìn)一步研究。

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