表面增強(qiáng)拉曼光譜法快速檢測(cè)飲料中玫瑰紅B

王樂，張愛霞，陳晞，鄭新華，何桂華

（濟(jì)南出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東濟(jì)南250014）

為降低成本、賦予食品誘人的外觀、穩(wěn)定色澤，某些生產(chǎn)商在食品生產(chǎn)過程中違法使用非食用工業(yè)色素，它們主要是以苯、甲苯、萘等芳烴類化工產(chǎn)品為原料，經(jīng)過磺化、硝化、鹵化、偶氮化一系列有機(jī)反應(yīng)化合而成，大多具有一定的毒性[1]。為此，衛(wèi)生部于2008年印發(fā)了“食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)名單（第一批）”通知，列出了6種嚴(yán)禁添加的非食用色素，其中，應(yīng)用最普遍的紅色非食用色素為玫瑰紅B，2005年質(zhì)檢總局查出不法分子用羅丹明B替代蘇丹紅制出毒花椒和火鍋底料。

玫瑰紅B，又名四乙基羅丹明和堿性玫瑰精，是一種具有鮮桃紅色的人工合成的堿性熒光染料；由間羥基二乙基苯胺與鄰苯二甲酐縮合制得，通常應(yīng)用的是它的氯化物[2]。因其具有高毒、高殘留和致癌、致畸、致突變等特點(diǎn)[3]，1993年起歐美、日本等國(guó)家和地區(qū)就已明令禁止玫瑰紅B用于食品加工過程中[4]。

目前，食品中玫瑰紅B的測(cè)定方法主要有高效液相色譜法[5-7]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[8]、薄層色譜掃描法[9]、分光光度法[10-11]、電化學(xué)發(fā)光法[12]等。但是，以上檢測(cè)方法前處理操作較為復(fù)雜、耗時(shí)，或儀器成本昂貴，且所用溶劑、流動(dòng)相具有較大的毒性和腐蝕性等缺點(diǎn)，難于普及推廣。因此，探索快速、簡(jiǎn)便、高效的食品色素檢測(cè)方法，建立有效的安全監(jiān)控體系，具有非常緊迫的現(xiàn)實(shí)意義。

拉曼光譜分析技術(shù)是以拉曼散射效應(yīng)為基礎(chǔ)建立起來(lái)的，是一種分子結(jié)構(gòu)表征技術(shù)。自從1970年被發(fā)現(xiàn)以來(lái)[13]，表面增強(qiáng)拉曼光譜已經(jīng)被廣泛應(yīng)用在DNA和細(xì)胞內(nèi)分子的檢測(cè)[14-17]、癌癥的診斷以及痕量化學(xué)物質(zhì)的檢測(cè)[18]、農(nóng)藥殘留[19]等方面。傳統(tǒng)的電化學(xué)腐蝕方法可以簡(jiǎn)便、高效的制備穩(wěn)定、均一的表面具有多孔結(jié)構(gòu)的金屬基底。本文利用電化學(xué)輔助原位制備了一種表面具有多孔銀結(jié)構(gòu)的表面增強(qiáng)拉曼（surface enhanced Raman scattering，SERS）活性固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）銀絲基底，對(duì)人工著色劑玫瑰紅B在銀絲基底表面的銀納米結(jié)構(gòu)的萃取、SERS行為進(jìn)行了研究、對(duì)SERS測(cè)試條件進(jìn)行了優(yōu)化，可用于飲料中玫瑰紅B的快速檢測(cè)。

Princeton?PARSTAT 4000電化學(xué)工作站，配有3個(gè)電極：美國(guó)普林斯頓公司；QE65Pro手持式拉曼光譜儀（激發(fā)波長(zhǎng) 785 nm，掃描范圍 300 cm-1～2 000 cm-1，光譜分辨率2 cm-1）：美國(guó)Ocean Optics公司；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀、Aglient1200高效液相色譜儀（Thermo Syncronis C18色譜柱，3.0 μm，150 mm×2.1 mm；甲醇+5 mmol乙酸銨水溶液梯度洗脫：0～10 min為5+95（體積比），10 min～13 min為95+5（體積比），13 min～20 min為5+95（體積比）；柱溫30℃；進(jìn)樣量10μL；流速0.25 mL/min）：美國(guó)安捷倫公司；API4000質(zhì)譜儀（電噴霧電壓4500 V；離子源溫度500℃；載氣流速15 L/min；霧化器壓力 5 psi；母離子 443.1，子離子 399.1、355.0；去

1　材料與方法

1.1　儀器與試劑

簇電壓 100 eV，碰撞能量 58、80 eV）：美國(guó) AB SCIEX。

高純銀絲（直徑0.6 mm，99.99%）：北京有色金屬與稀土利用研究所；甲醇（色譜純）、乙醇（色譜純）、丙酮（色譜純）、正己烷（色譜純）：德國(guó)Merck公司；鹽酸（分析純）、硝酸（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；玫瑰紅B（標(biāo)準(zhǔn)品，95.0%）、酸性紫6B（標(biāo)準(zhǔn)品，91.0%）、喹啉黃（標(biāo)準(zhǔn)品，97.2%）：德國(guó) Dr.Ehrenstorfer；萘酚黃（標(biāo)準(zhǔn)品，99.0%）、偶氮玉紅（標(biāo)準(zhǔn)品，98.0%）：德國(guó)Sigma-Aldrich。標(biāo)準(zhǔn)溶液：用水配制1 000mg/L的玫瑰紅B、酸性紫6B、萘酚黃、偶氮玉紅、喹啉黃標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，使用時(shí)再用水逐級(jí)稀釋。

1.2　銀絲SERS基底的制備

多孔銀絲SERS基底，參照文獻(xiàn)采用循環(huán)伏安法合成[20]。將直徑為0.6 mm的銀絲依次浸入丙酮、乙醇、超純水、0.1 mol/L硝酸中進(jìn)行表面處理，干燥。電化學(xué)實(shí)驗(yàn)采用自制的三電極電化學(xué)工作池，銀絲為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鈦桶電極為輔助電極，0.1 mol/L鹽酸為電解液、在-0.2 V～0.2 V電位范圍內(nèi)以25 mV/s的速度進(jìn)行15次電化學(xué)反應(yīng)，制備具有萃取功能的表面增強(qiáng)拉曼銀絲基底，制備好的銀絲清洗、干燥備用。通過調(diào)整掃描速度，可調(diào)控銀絲表面多孔銀納米結(jié)構(gòu)的尺寸和結(jié)構(gòu)。

1.3　標(biāo)準(zhǔn)拉曼光譜數(shù)據(jù)庫(kù)的建立

用Gaussian W03程序?qū)γ倒寮tB進(jìn)行逐步優(yōu)化并對(duì)最優(yōu)結(jié)構(gòu)進(jìn)行拉曼頻率的理論計(jì)算，得出理論特征譜圖；利用拉曼光譜儀對(duì)玫瑰紅B固體標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行掃描，得到固體標(biāo)準(zhǔn)品特征譜圖。

1.4　樣品測(cè)試

1）移取番茄混合果蔬汁飲料樣品10 mL，分別加入玫瑰紅B、萘酚黃、酸性紫6B、喹啉黃標(biāo)準(zhǔn)溶液，使得玫瑰紅B濃度為70.0 μg/L、萘酚黃濃度為3.6mg/L、酸性紫6B濃度為7.6mg/L、喹啉黃濃度為4.8 g/L，搖勻，待測(cè)。

2）移取可樂樣品10 mL于小燒杯中，分別加入玫瑰紅B、偶氮玉紅標(biāo)準(zhǔn)溶液，使得玫瑰紅B濃度為360.0 μg/L、偶氮玉紅濃度為5.0mg/L，超聲除去二氧化碳，待測(cè)。

SERS樣品測(cè)試：上述待測(cè)液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，將表面增強(qiáng)拉曼基底浸入濾液中靜置萃取8 min后，置于鈦片上進(jìn)行表面增強(qiáng)拉曼光譜測(cè)試。

HPLC-MS/MS樣品測(cè)試：待測(cè)液加入10 mL超純水，用檸檬酸水溶液調(diào)試pH值至4，移至已活化的PCX固相萃取柱中，依次用6 mL pH=6的水、6 mL甲醇淋洗固相柱。棄去淋洗液，于負(fù)壓下抽干固相柱。然后用6 mL 10%氨水甲醇洗脫待測(cè)組分，接收洗脫液。洗脫液于50℃氮?dú)獯蹈?，用流?dòng)相定容至1.0 mL，渦流混合后過0.22 μm濾膜，進(jìn)行LC-MS/MS分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　理論拉曼光譜計(jì)算及振動(dòng)模式的歸屬

對(duì)玫瑰紅B分子用Gaussian 03程序進(jìn)行逐步優(yōu)化并對(duì)最優(yōu)結(jié)構(gòu)進(jìn)行拉曼頻率的理論計(jì)算，密度泛函理論（DFT）計(jì)算結(jié)果文件及分子構(gòu)型通過Gaussview 5觀察和分析，分子結(jié)構(gòu)的拉曼光譜計(jì)算結(jié)果校正后與固體標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)驗(yàn)拉曼光譜呈現(xiàn)高匹配度（圖1，表1），與文獻(xiàn)報(bào)道一致[21-22]。

圖1　玫瑰紅B的理論計(jì)算拉曼光譜（a）和固體標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)驗(yàn)拉曼光譜（b）Fig.1　Theoretical calculated Raman spectrum of Rhodamine B（a）and experimental Raman spectrum of solid standard（b）

表1　玫瑰紅B的DFT光譜和固體標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)驗(yàn)拉曼光譜主要峰的振動(dòng)模式歸屬Table 1　Main vibration modes attribution of DFT and experimental Raman spectrum of solid standard

2.2　定性定量方法的建立以及實(shí)際樣品檢測(cè)

2.2.1　定性檢測(cè)

對(duì)玫瑰紅B的定性檢測(cè)可選擇它的特征峰作為鑒定標(biāo)準(zhǔn)，616、732、1 007、1 073、1 196、1 277、1 357、1 503、1 647 cm-1處峰強(qiáng)度較高見圖2，所以選定以上9個(gè)峰為定性峰。

圖2　銀絲基底萃取1.0×10-6mol/L玫瑰紅B在萃取時(shí)間8min的SERS光譜圖Fig.2　SERS spectrum of Rhodamine B on porous Ag fiber in 1.0×10-6mol/L for 8 minute

2.2.2　定量檢測(cè)

2.2.2.1　萃取基底的選擇

納米結(jié)構(gòu)的差異會(huì)顯著影響吸附分子的SERS響應(yīng)，因此，考察了1.0×10-6mol/L玫瑰紅B在不同掃速條件下制備的多孔銀納米結(jié)構(gòu)上的SERS響應(yīng)見圖3。

圖3　不同掃速銀絲基底萃取1.0×10-6mol/L玫瑰紅B的SERS光譜圖Fig.3　SERS spectrum of 1.0×10-6mol/L Rhodamine B on porous Ag fiber fabricated at different scanning rate

由圖3可以看出，玫瑰紅B在不同掃速制備的Ag基底上的增強(qiáng)效果不同，其趨勢(shì)是隨著掃描速度的增加，增強(qiáng)效果逐漸增強(qiáng)，當(dāng)循環(huán)伏安法掃速為25 mV/s時(shí)，增強(qiáng)效果達(dá)到最大值，然后隨著掃速的繼續(xù)增加而逐漸降低。本文采用25 mV/s時(shí)得到的銀絲基底進(jìn)行方法學(xué)考察。

2.2.2.2　萃取時(shí)間的優(yōu)化

本文采用靜置直接萃取法，為了獲得最佳萃取效果，對(duì)平衡時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化。為了選擇最佳萃取時(shí)間，我們考察了玫瑰紅B的SERS特征峰強(qiáng)度與萃取時(shí)間的動(dòng)力學(xué)曲線。將多孔銀萃取絲浸入1.0×10-6mol/L的玫瑰紅B萃取工作液中，間隔不同時(shí)間連續(xù)采集萃取絲上SERS光譜，如圖4所示，玫瑰紅B萃取時(shí)間超過8 min后，特征峰強(qiáng)度不再增加趨于平衡，隨著萃取時(shí)間增長(zhǎng)有下降趨勢(shì)，選擇最佳萃取時(shí)間為8 min。

圖4　銀絲基底萃取1.0×10-6mol/L玫瑰紅B的吸附時(shí)間平衡趨勢(shì)圖Fig.4　SERS spectrum of Rhodamine B on porous Ag fiber in 1.0×10-6mol/L for different time

2.2.2.3　檢出限及線性

在最佳條件情況下，將多孔銀萃取絲浸入一系列濃度的玫瑰紅B化合物進(jìn)行萃取8 min，達(dá)到平衡后得到系列溶液SERS光譜數(shù)據(jù)見圖5。

由圖5可見，當(dāng)玫瑰紅B溶液的濃度降至5×10-9mol/L 時(shí) 1 007、1 196、1 277、1 357、1 647 cm-1等峰仍能看出有SERS增強(qiáng)峰的存在，此濃度作為方法的檢出限。取1 277 cm-1處的一系列SERS峰來(lái)做峰強(qiáng)度與玫瑰紅B濃度的平衡吸附曲線和線性關(guān)系曲線（y=503.6+1.05×109x，R2=0.997）。

圖5?。ˋ）5.0×10-9mol/L-1.0×10-5mol/L玫瑰紅B溶液的拉曼光譜，（B）飽和吸附曲線（5.0×10-9mol/L-1.0×10-5mol/L），（C）5.0×10-8mol/L-2.5×10-6mol/L玫瑰紅B溶液的校正曲線Fig.5 （A）Raman spectra of Rhodamine B with concentrations from 5.0×10-9mol/L to 1×10-5mol/L.（B）Saturated adsorption curve for Rhodamine B（C）The calibration curve from 5.0×10-8 mol/L to 2.5×10-6mol/L

2.2.3　實(shí)際樣品SERS檢測(cè)與HPLC-MS/MS方法的比對(duì)

選取空白番茄混合果蔬汁飲料添加玫瑰紅B、萘酚黃、酸性紫6B、喹啉黃制作代表性陽(yáng)性樣品，按照“1.4樣品測(cè)試”孔濾膜過濾后進(jìn)行原位萃取SERS方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖 6所示曲線，616、732、1 007、1 073、1 196、1 277、1 357、1 503、1 647 cm-1處的 SERS峰與玫瑰紅B粉末標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的拉曼峰基本是一致的，可以確認(rèn)本文的SERS方法檢測(cè)出番茄混合果蔬汁飲料樣品中玫瑰紅B的存在，其含量為63.3 μg/L，添加的萘酚黃、酸性紫6B、喹啉黃未觀測(cè)到SERS增強(qiáng)信號(hào)，對(duì)目標(biāo)物玫瑰紅B不產(chǎn)生干擾。為了驗(yàn)證上述方法的準(zhǔn)確性，對(duì)番茄混合果蔬汁飲料和可樂（添加玫瑰紅B、偶氮玉紅）樣品進(jìn)行固相萃取前處理后采用液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜法對(duì)其中玫瑰紅B進(jìn)行檢測(cè)[4，23]，比對(duì)結(jié)果見表2。

圖6　番茄混合果蔬汁飲料樣品中玫瑰紅B的SERS圖譜Fig.6　SERS spectrum of Rhodamine B in mixing fruit-vegetable juice beverage sample

表2　飲料樣品的檢測(cè)結(jié)果（n=6）Table 2　Test results of drink samples（n=6）

由對(duì)比結(jié)果可以看出，SERS檢測(cè)方法可以在保證準(zhǔn)確性的前提下，節(jié)省檢測(cè)時(shí)間、操作簡(jiǎn)便。

3　結(jié)論

采用電化學(xué)方法制備了具有SERS活性的多孔銀絲基底，XRD、EDS分析證明了多孔納米結(jié)構(gòu)由Ag元素組成，SEM顯示該基底具有納米顆粒組成的堆集孔結(jié)構(gòu)，且穩(wěn)定性、均勻性較好。優(yōu)化了銀絲基底的萃取條件，采用循環(huán)伏安25 mV/s掃描條件下制備的銀絲基底在目標(biāo)溶液中吸附8分鐘后進(jìn)行拉曼測(cè)試；固體標(biāo)準(zhǔn)品拉曼掃描結(jié)合理論計(jì)算建立了玫瑰紅B的標(biāo)準(zhǔn)拉曼譜圖。在最佳條件下，建立了基于多孔銀絲基底的食品中人工合成著色劑玫瑰紅B的SERS快速分析方法，檢測(cè)限達(dá)到5×10-9 mol/L。相比液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，可以避免有機(jī)流動(dòng)相的污染、節(jié)省檢測(cè)成本，SERS增強(qiáng)基底可低成本自制且便于攜帶、適用于批量食品樣品的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

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