超高壓對發(fā)酵兔肉干腌漬發(fā)色的研究

張穎璐，周敬陽，徐倩倩，王穩(wěn)航

（1.天津二商迎賓肉類食品有限公司，天津300000；2.天津科技大學食品工程與生物技術(shù)學院，天津300457）

近年來，隨著人們生活水平的提高，人們對肉類產(chǎn)品質(zhì)量有了更高的要求。與此同時，兔肉制品是典型的“四高四低”的保健產(chǎn)品，其具有高賴氨酸、高蛋白、高卵磷脂、高消化率、低膽固醇、低鳥胺、低脂肪、低熱量[1]。逐漸成為消費者歡迎的肉制品，全世界的兔肉產(chǎn)量約為200萬噸，我國是世界上最大的兔肉生產(chǎn)和出口國，占世界肉類產(chǎn)量的三分之一[2]。

國內(nèi)外對兔肉制品的研究報道較少，但國外近年來表現(xiàn)出對兔肉制品空前的熱情，而相對的國內(nèi)的研究又少之又少，這與我國兔肉生產(chǎn)和出口大國的身份嚴重不符[3]。國內(nèi)外關(guān)于兔肉產(chǎn)品的研究主要集中在兔肉產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)肌纖維組織、系水力pH值、以及硬度等方面[4-5]。

通常，食鹽添加量、腌制時間、能夠顯著影響腌漬肉類的色澤[6]。對于兔肉來說，兔在屠宰后的肉品顏色變化主要集中在45 min到3 h的時間內(nèi)，3 h到24 h無顯著色澤變化，24 h之后兔肉的色澤基本無變化[7]。目前，超高壓本身作為一種新型現(xiàn)代食品加工技術(shù)，具有滅菌、滅酶，保留產(chǎn)品特色風味和色澤，改善肉制品質(zhì)構(gòu)和保水保油性等特點[8]，同時能夠縮短加工時間，提高加工效率。通常，當超高壓的壓力達到200kpa～300 kpa時，肉色澤的亮度會增大，其與白肌纖維的變化有關(guān)，也有可能肌紅蛋白發(fā)生某些化學變化所導致的[9]。當壓力超過400 kpa時，色澤中的紅度會減弱，這是因為肉中的亞鐵肌紅蛋白被氧化成為高鐵肌紅蛋白所造成的。馮哲等研究表明，隨著溫度和壓力的上升，色差L*（亮度）值和△E值（△E=[（△a*）2+（△b*）2+（△L*）2]1/2，其中△a*、△b*、△L* 是與原料肉的 a*（紅綠度）、b*（黃藍度）、L*的差值）逐漸增加、a*值逐漸下降，豬肉逐漸從鮮紅色變?yōu)榛野咨玔10]。

亞硝酸鹽作為肉制品中常用的發(fā)色劑，但亞硝酸鹽過量會致癌，亞硝酸鹽含量是我們不得不考慮的一個重要指標。陳建保等研究指出醬腌菜經(jīng)過超高壓滅菌比熱滅菌貯存一段時間后亞硝酸鹽的殘留量更低[11]。魏永香等采用先腌制再高壓的方法發(fā)明一種具有腸道保健功效的復合醬菜的制備方法，其亞硝酸鹽顯著降低，接近于不含不含亞硝酸鹽[12]。張隱等將超高壓運用到泡椒鳳爪的加工過程，樣品貯藏15天后，亞硝酸鹽含量低于國家標準GB 2726-2005《熟肉制品衛(wèi)生標準》的最高限定值[13]。

發(fā)酵肉制品指的是利用微生物發(fā)酵將各種酸和醇，并經(jīng)低溫脫水產(chǎn)生的具有特殊風味、色澤、質(zhì)地且具有較長保質(zhì)期的肉制品[14]。在肉制品中添加植物乳桿菌能夠利用其產(chǎn)生的有機酸，抗生素等物質(zhì)來抑制腐敗菌和致病菌。在肉制品中添加戊糖片球菌可以提高人體對肉制品的消化吸收，同時還能起到良好的的抑菌作用，另外還能使肉色更加紅亮，著色效果更加穩(wěn)定。

綜上，目前國內(nèi)外對兔肉制品的色澤的研究主要是其屠宰后的顏色變化，而對于腌制和超高壓下的色澤變化尚未研究，超高壓對肉類色澤變化的影響也主要集中于豬肉制品，而對兔肉鮮有提及。而據(jù)報道，在對肉制品進行超高壓作用之前對肉制品進行腌制，可有效減弱高壓對肉類色澤的影響[15]。為此，本文主要通過高壓和腌制的聯(lián)合作用來探究壓力和腌制條件對兔肉色澤及肌紅蛋白的影響，以為兔肉制品的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

馬骨骼肌肌紅蛋白：Sigma試劑公司；獺兔，體重2±0.5 kg：天津金元寶農(nóng)貿(mào)市場；植物乳桿菌、戊糖片球菌：天津科技大學生物工程學院；其他試劑均為分析純：天津市江天化工技術(shù)有限公司。

1.2　儀器與設備

TD6001電子天平：天津天馬衡基儀器有限公司；HPP-L3型超高壓設備：天津市華泰森淼生物技術(shù)有限公司；紫外可見光全波長掃描儀：Thermo Fisher科技有限公司；G10型醫(yī)用高速離心機：河北安新縣白洋離心機廠；TG328A分析天平：上海天平儀器廠；MOS 450圓二色譜儀：法國Bio-Logic公司；CIE－LAB全自動色差計：Minolta公司。

1.3　方法

1.3.1　壓力和腌制對肌紅蛋白的處理

1.3.1.1　肌紅蛋白溶液的制備

將馬骨骼肌肌紅蛋白溶解于pH值為6的磷酸鹽緩沖溶液中，使得肌紅蛋白濃度為20mg/mL，50℃水浴30 min，10 000 r/min離心5 min，最后使肌紅蛋白濃度為2mg/mL之后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.2　肌紅蛋白的超高壓處理

將肌紅蛋白樣品分為兩組，兩組均選用0.1、100、200 MPa和400 MPa進行超高壓處理。第一組樣品采用先超高壓再腌制的方法進行處理，第二組樣品采用先腌制后超高壓的方法進行處理，分別測定相關(guān)指標。

1.3.1.3　肌紅蛋白色度測定

使用CIE－LAB全自動色差計參照canto的方法[16]進行測定肌紅蛋白色度。

1.3.1.4　肌紅蛋白圓二色性譜測定（CD spectrum）

以磷酸緩沖液為對照樣來測定處理后的純肌紅蛋白樣品的圓二色性，腌制后的肌紅蛋白樣品以加入與樣品等量的亞硝酸鈉和VC的緩沖液為空白對照，選擇測量模式為OD，初始掃描波長為190 nm，掃描結(jié)束波長為260 nm，掃描次數(shù)1次，每納米測量持續(xù)時間為1 s，CD的靈敏度為300 mdeg，圓二色性用平均殘基橢圓值（θ）來進行表示，對經(jīng)過不同壓力壓力處理的腌制及超高壓順序不同的肌紅蛋白樣品進行測定。

1.3.2　壓力和腌制對兔肉的處理

1.3.2.1　發(fā)酵兔肉的腌漬

取獺兔后腿去除可見結(jié)締組織和脂肪的股二頭肌作為肉樣，樣品被分為5組。對照組：兔肉直接進行腌制（輔料配方：兔后腿肉100 g，亞硝酸鹽0.015 g，VC0.03 g，鹽 1.5 g，葡萄糖 2.0 g），低菌組，中菌組，高菌組在腌制的同時加入植物乳桿菌和戊糖片球菌分別為106、107、108CFU/g。醋酸組：先將兔肉在5%的醋酸中浸泡10 min，取出瀝干然后進行腌漬。然后將兔肉隔絕空氣，在25℃條件下保存24 h，60℃干燥6 h。

1.3.2.2　超高壓處理

取切割好的兔肉股二頭肌，大小均勻一致，將兔肉采用與肌紅蛋白的處理方式基本保持一致，不同的是腌制方法按照1.3.2.1中的方法進行。最后測定相關(guān)指標。

1.3.2.3　樣品色度的測定

方法同1.3.1.3。

1.3.2.4　肌紅蛋白含量測定

采用紫外可見吸收光譜分析法參照LIP等方法[17]進行測定。

1.3.2.5　亞硝酸鹽殘留量測定

參照卞玲娟等[18]中的方法進行測定。

1.3.3　數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗中所有測試均平行檢測3次，試驗結(jié)果表示為什么。數(shù)據(jù)處理與制圖均采用Origin 8.0統(tǒng)計分析軟件完成。

2　結(jié)果與討論

2.1　壓力和腌制處理對肌紅蛋白的影響

2.1.1　壓力和腌制對肌紅蛋白色澤的影響

壓力和腌制處理的肌紅蛋白色度值見表1。

表1　壓力和腌制處理的肌紅蛋白色度值Table 1　Color index of Mb treated with high pressure and curing

由表1可以看出，肌紅蛋白的色澤會受到腌制和壓力處理先后順序的影響，L*值一直隨著壓力的升高而逐漸增大，但先高壓處理組的增值明顯大于后進行高壓處理組的，馬漢軍等研究表明，先進行腌制后進行超高壓，會由于腌制形成亞硝基肌紅蛋白從而起到穩(wěn)定色澤的作用[15]。這正與我們的結(jié)果是保持一致的，由于腌制后的肌紅蛋白與亞硝酸鹽發(fā)生反應，形成亞硝基肌紅蛋白，從而很好的保護了肌紅蛋白，進而對色澤起到了良好的保護作用，肌紅蛋白經(jīng)過腌制處理后由紅色變成了亞硝基肌紅蛋白的粉紅色。100 MPa和200 MPa高壓處理對色澤的影響不是很明顯，先進行400 MPa的超高壓處理會導致a值的急劇下降，這表明超高壓處理對色澤的影響較大，但通過對比可以發(fā)現(xiàn)，對肌紅蛋白進行超高壓處理前先進行腌制處理，結(jié)果表明色澤變化顯著低于先高壓后腌制處理組。這更進一步的說明先進行腌制形成的亞硝基肌紅蛋白能夠有效地降低超高壓對肌紅蛋白的破壞作用。

2.1.2　壓力和腌制對肌紅蛋白結(jié)構(gòu)的影響

壓力和腌制處理的肌紅蛋白圓二色譜圖見圖1。

圖1　壓力和腌制處理的肌紅蛋白圓二色譜圖Fig.1　CD spectra of Mb treated with high pressure and curing

由圖2可知，在222 nm處，每組樣品均出現(xiàn)一個明顯的負峰，在圓二色性光譜中222 nm處主要是用來表示α-螺旋的含量，經(jīng)過400 MPa超高壓處理后，在222 nm的負峰最弱，這表明經(jīng)過400 MPa超高壓處理后，肌紅蛋白二級結(jié)構(gòu)中的α-螺旋的含量明顯的下降，造成一定程度的解螺旋。進而說明了肌紅蛋白的三維立體結(jié)構(gòu)受到一定程度的破壞。同時我們可以看出，在409 nm處有一個明顯的正峰，在該處正峰主要是由蛋白質(zhì)輔基引起的。同樣我們可以看到，在400 MPa超高壓處理時，409 nm處的正峰最弱，進一步說明了經(jīng)過超高壓處理后會造成肌紅蛋白的三維立體結(jié)構(gòu)的破壞。

2.2　壓力和腌制處理對發(fā)酵兔肉的影響

2.2.1　壓力和腌制處理對發(fā)酵兔肉色澤的影響

先經(jīng)過腌制處理的兔肉，再經(jīng)過不同壓力處理10 min后，經(jīng)過不同菌濃度及醋酸組的兔肉的色澤值變化見表2。

表2　壓力和腌制處理后發(fā)酵兔肉色度值Table 2　Color index of rabbit meat treated with high pressure and curing

由表2可以看出，雖然經(jīng)過不同的前處理，但表現(xiàn)出來的趨勢是相同的，隨著壓力的逐漸升高，L*值逐漸上升，a*值呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，而值b*未呈現(xiàn)出明顯的變化，這與Shigehisa等[19]研究豬肉的結(jié)果基本一致。

由表2可以看出，在相同的壓力下，后超高壓處理組的樣品組的a*值明顯高于先超高壓處理組樣品的a*值，這與單純處理肌紅蛋白組的結(jié)果是一致的。經(jīng)過腌制處理后，兔肉制品的肌紅蛋白會與NO結(jié)合形成穩(wěn)定的亞硝基肌紅蛋白，可以避免肌紅蛋白中的二價鐵離子氧化為三價鐵離子，由表中還可以看出，經(jīng)過腌制之后，并未顯著影響L*值的變化，這說明腌制并不能影響水分在兔肉表面的附著。肉類食品色澤經(jīng)高壓處理后導致變白的主要是由于高壓導致的球蛋白變性及肌肉失水。通過該實驗的研究，我們也可以看出，超高壓處理后樣品顏色的改變是有多種機制造成的，有研究表明溫度和壓力的上升均會造成豬肉L*值的上升，a*值的下降，豬肉最終呈現(xiàn)灰白色[10]。

2.2.2　壓力和腌制處理對發(fā)酵兔肉肌紅蛋白含量的影響

超高壓和腌制處理后兔肉肌紅蛋白吸收光譜見圖2。

圖2　超高壓和腌制處理后兔肉肌紅蛋白吸收光譜Fig.2　UV/Visual absorption spectra of Mb of rabbit meat treated with high-pressure and curing

如圖2所示，各樣品經(jīng)過不同條件處理后提取的肌紅蛋白的紫外可見吸收光譜，先400 MPa超高壓處理時顯著地降低其肌紅蛋白的含量，說明超高壓處理確實能顯著地降低兔肉中肌紅蛋白的含量。由后400 MPa超高壓處理組的樣品作為對照組可以發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過腌制處理后，可以顯著地降低壓力對肌紅蛋白造成的影響，說明壓力并不是能夠絕對造成肌紅蛋白含量降低的因素。有對壓力和溫度對肌紅蛋白含量影響的研究顯示，在不同的高壓下處理豬肉的時候，不同溫度對肌紅蛋白含量的影響確是截然不同的[10]。另有張輝等對生鮮牛肉經(jīng)過超高壓處理工藝研究表明，肌紅蛋白含量的影響因素，處理壓力＞處理時間＞保壓溫度[20]。

2.2.3　壓力和腌制處理對發(fā)酵兔肉亞硝酸鹽殘留量的影響

壓力和腌制處理后肉樣亞硝酸鹽殘留量見圖3。

圖3　壓力和腌制處理后肉樣亞硝酸鹽殘留量Fig.3　Nitrite residue of rabbit meat treated with high pressure and curing

如圖3所示，在選用相同的方法進行腌制時，100、200 MPa高壓處理時，亞硝酸鹽殘留無顯著差異，這與張爽等的研究結(jié)果是一致的[21]。而400 MPa超高壓處理時，亞硝酸鹽的殘留量顯著增加，后400 MPa超高壓處理時，亞硝酸鹽殘留量則與對照組無明顯的差異，據(jù)此我們推測：未腌制時，超高壓造成兔肉肌肉組織失水及肌紅蛋白結(jié)構(gòu)的破壞，導致了亞硝酸與肌紅蛋白反應減少，從而造成殘留量較多，而先進行腌制再進行超高壓處理時，可能是由于腌制使得兔肉肌紅蛋白與亞硝酸鹽反應，生成亞硝基肌紅蛋白較穩(wěn)定，能夠耐受超高壓處理，從而使得亞硝酸鹽殘留量較少。與此同時，我們可以看出，醋酸組先超高壓處理時與后超高壓處理時并未顯示出巨大的差別，這可能是由于醋酸作為廣譜抑菌劑，通過抑制微生物生長，進而抑制硝酸還原為亞硝酸鹽。

3　結(jié)論

目前國內(nèi)外，在超高壓對肉類制品的應用方面的研究較少，尤其是涉及兔肉制品就少之又少，超高壓處理會導致L*值的增大，二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋的減少，以及肌紅蛋白含量的降低。比較特殊的是，在400 MPa超高壓處理時，先進行腌制后進行超高壓處理時，會明顯地改善發(fā)色效果，降低α-螺旋的減少量，降低肌紅蛋白的減少量。對于兔肉樣品，色澤變化與單純的肌紅蛋白基本上保持一致，先腌制后400 MPa超高壓處理同樣顯示出優(yōu)良的效果。超高壓處理無疑會提高肉類制品的生產(chǎn)效率，經(jīng)過腌制處理有效的避免了超高壓對兔肉制品帶來的不良影響，這為兔肉制品的加工制造提供了新思路，并有望擴大超高壓技術(shù)在肉類行業(yè)的應用。

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