2型糖尿病患者壓瘡局部ATP酶活性及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的研究

李崢璟, 柏素萍, 黃佳敏, 孫 輝, 周筱琴

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院 燒傷整形科, 江蘇 鎮(zhèn)江, 212001)

糖尿病患者發(fā)生壓瘡后，創(chuàng)面遷延不愈，形成慢性難愈性潰瘍，嚴(yán)重危害患者的健康[1-2]。近年來，能量代謝和細(xì)胞凋亡機(jī)制在皮膚創(chuàng)傷與愈合，慢性潰瘍形成與修復(fù)領(lǐng)域的機(jī)制研究逐步得到重視[3-4]。本研究取2型糖尿病患者Ⅱ期壓瘡、Ⅳ期壓瘡傷口周圍皮膚組織，以健康志愿者為對(duì)照，檢測(cè)其三磷酸腺苷酶(ATPase)活性、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，探討糖尿病患者壓瘡形成過程中可能的作用機(jī)制，為糖尿病慢性傷口的防治提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

按2007年美國(guó)國(guó)家壓瘡協(xié)會(huì)最新壓瘡分期標(biāo)準(zhǔn)，取材標(biāo)本來源于Ⅲ期和Ⅳ期壓瘡。Ⅲ期壓瘡: 全層傷口，失去全層皮膚組織，除了骨、肌腱或肌肉尚未暴露外，可見皮下組織，有壞死組織脫落，但組織壞死的深度不太明確，可能有潛行或竇道。Ⅳ期壓瘡: 全層傷口，失去全層皮膚組織，伴骨、肌腱或肌肉外露，局部可出現(xiàn)壞死組織脫落或焦痂，通常有潛行和竇道。選取2013年1月—2015年1月住院的2型糖尿病合并壓瘡患者43例，男20例，女23例。根據(jù)2007年美國(guó)國(guó)家壓瘡協(xié)會(huì)最新壓瘡分期標(biāo)準(zhǔn)，分為Ⅲ期壓瘡21例, Ⅳ期壓瘡22例，平均年齡(62.3±10.6)歲，全部符合2010年美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)。排除近1個(gè)月內(nèi)使用可能影響ATP酶藥物的患者(洋地黃類、鈣離子拮抗劑等)，患者換藥時(shí)取創(chuàng)口周圍皮膚組織標(biāo)本。另擇20例健康志愿者(包皮環(huán)切患者)作為對(duì)照組。

1.2 試劑與儀器

ATP酶活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，兔抗人Bcl-2和Bax單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗、內(nèi)參及BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為美國(guó)Agilent公司，圖像分析系統(tǒng)為Bio-Rad公司(美國(guó))GS-710, 高速低溫臺(tái)式離心機(jī)為飛鴿公司TGL-16 G。

1.3 方法

1.3.1 ATPase活性檢測(cè): 分組同上，取各組標(biāo)本，加入生理鹽水制成勻漿液，離心取上清, BCA法測(cè)定上清液中蛋白濃度，按照ATPase活性測(cè)定試劑盒說明，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)636 nm處測(cè)定吸光度值，根據(jù)各樣品蛋白含量計(jì)算ATPase活性。

1.3.2 逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR): 分組同上，取各組樣本于Trizol試劑中勻漿，并提取各組標(biāo)本總RNA。使用Thermo逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄，使用Thermo Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix對(duì)Bcl-2、Bax進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物分別為Bcl-2: sense, 5′-CGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGC-3′, antisense, 5′-CCGCATGCTGGGGCCGTACAGTTC C-3′; Bax: sense, 5′-ATGGACGGGTCCGGGGAGCAGCCC-3′, antisense, 5′-GGTGAGCACTCCCGCCACAAAGAT-3′,以管家基因GAPDH: sense, 5′-CACCCCATTTGATGTTAGTG, antisense, 5′-CCATTTGCAGTGGCAAAG-3′作為內(nèi)參，反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增曲線和溶解曲線，結(jié)果用2-ΔΔCT法表示。

1.3.3 蛋白印跡法檢測(cè)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá): 分組同上，取各組標(biāo)本，加入RIPA緩沖液及蛋白酶抑制劑后勻漿, 8 000 g離心10 min收集上清, BCA法測(cè)定上清液中蛋白濃度。每個(gè)樣品取20 μg蛋白，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。待電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜并依此加入相應(yīng)一抗: 兔抗人Bcl-2、Bax, 稀釋濃度為1∶200; 二抗: 稀釋濃度為1∶2 500; ECL試劑。使用IPP顯微圖像分析軟件半定量分析得出積分吸光度值，最終得出蛋白表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 ATPase活性，Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)

ATPase活性檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，糖尿病患者Ⅲ期壓瘡創(chuàng)緣皮膚ATPase活性減低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 糖尿病患者Ⅳ期壓瘡創(chuàng)緣皮膚ATPase活性減低明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。RT-qPCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，糖尿病患者Ⅲ期壓瘡創(chuàng)緣皮膚Bcl-2 mRNA表達(dá)降低，糖尿病患者Ⅳ期壓瘡創(chuàng)緣皮膚Bcl-2 mRNA表達(dá)下降更為明顯; 糖尿病患者Ⅲ期壓瘡創(chuàng)緣皮膚Bax mRNA表達(dá)增高，糖尿病患者Ⅳ期壓瘡創(chuàng)緣皮膚Bax-2 mRNA增高更為明顯。見表1。

2.2 Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)

蛋白印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示, Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)與Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)一致，與對(duì)照組相比，糖尿病患者Ⅲ期壓瘡創(chuàng)緣皮膚Bcl-2蛋白表達(dá)降低，而糖尿病患者Ⅳ期壓瘡創(chuàng)緣皮膚Bcl-2表達(dá)降低更為明顯。與之相反，糖尿病患者Ⅲ期壓瘡創(chuàng)緣皮膚Bax蛋白表達(dá)水平低，而隨著病程加重, Bax蛋白表達(dá)水平增高。見表2。

表1 各組ATPase活性、Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)結(jié)果

與對(duì)照組比較, *P<0.05; 與糖尿病Ⅲ期壓瘡組比較, #P<0.05。

表2 各組Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)

與對(duì)照組比較, *P<0.05。

3 討 論

糖尿病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，病情遷延不愈，常導(dǎo)致腎臟、心臟、眼部等多器官的并發(fā)癥，且難以逆轉(zhuǎn)[5]。糖尿病慢性壓瘡是糖尿病患者常見的并發(fā)癥，與非糖尿病患者相比，創(chuàng)面更易感染，形成慢性難愈性潰瘍難以治愈，嚴(yán)重危害糖尿病患者的健康，降低生活質(zhì)量，給家庭和社會(huì)帶來了經(jīng)濟(jì)壓力和負(fù)擔(dān)[6-7]。本研究選取2型糖尿病合并壓瘡患者Ⅲ期、Ⅳ期壓瘡創(chuàng)緣皮膚組織，觀察其ATPase活性、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，研究能量代謝與細(xì)胞凋亡在糖尿病慢性壓瘡傷口形成過程中可能的作用機(jī)制，為糖尿病慢性潰瘍的防治提供理論依據(jù)。

健康人皮膚組織結(jié)構(gòu)及功能正常，代謝旺盛，具有調(diào)節(jié)體溫、排泄廢物及免疫等功能。2型糖尿病患者由于胰島素不足或胰島素抵抗[8], 長(zhǎng)期高糖環(huán)境刺激，皮膚細(xì)胞糖代謝受損，影響細(xì)胞正常的增殖、分裂，使得皮膚的修復(fù)功能受損[9]。ATPase能將ATP催化水解為ADP并釋放大量能量，維持細(xì)胞正常代謝, ATPase活性降低將嚴(yán)重影響細(xì)胞正常生理功能[10]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與健康人相比，糖尿病患者Ⅲ期壓瘡創(chuàng)緣皮膚ATPase活性顯著降低，隨著病情遷移，糖尿病患者Ⅳ期壓瘡創(chuàng)緣皮膚ATPase活性降低更為明顯，表明皮膚ATP利用率降低，組織能量代謝受到抑制[11]。ATPase活性的下降導(dǎo)致皮膚細(xì)胞增殖分裂、離子交換、物質(zhì)代謝等過程所需要的能量供應(yīng)不足，細(xì)胞活力下降，影響創(chuàng)面修復(fù)[12]。

細(xì)胞凋亡是一系列基因、蛋白相互作用參與調(diào)控的細(xì)胞主動(dòng)死亡的過程[13]。其中Bcl-2、Bax是凋亡啟動(dòng)途徑中關(guān)鍵的信號(hào)分子, Bcl-2和Bax通過形成同源或異源二聚體形式調(diào)控細(xì)胞凋亡，當(dāng)Bcl-2/Bax比例增高時(shí)，抑制細(xì)胞凋亡; 反之，當(dāng)Bcl-2/Bax比例降低時(shí)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著糖尿病患者壓瘡病情的加重，創(chuàng)緣Bcl-2/Bax mRNA及蛋白表達(dá)比例均降低，且趨勢(shì)一致，表明組織細(xì)胞凋亡增強(qiáng)，凋亡的修復(fù)能力、抗感染能力均不同程度受到抑制，導(dǎo)致傷口感染加重、遷延不愈[15-17]。

與非糖尿病患者壓瘡相比，糖尿病患者壓瘡的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，病程遷延不愈，且預(yù)后較差，通過控糖、換藥、負(fù)壓、照射、抗感染等常規(guī)治療往往療效并不明顯[18-19]。本研究結(jié)果表明，糖尿病期皮膚組織能量代謝受損和細(xì)胞凋亡增強(qiáng)可能是導(dǎo)致糖尿病患者創(chuàng)面病情加重的重要因素，其相互作用關(guān)系及具體調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

[1] American Diabetes, A. Diagnosis and classification of diabetes mellitus[J]. Diabetes Care, 2013, 36(1): 67-74.

[2] 常麗萍. 糖尿病腎病脈絡(luò)病變闡述[J]. 中華中醫(yī)藥雜志, 2014, 29(2): 355-357.

[3] Feng, Y. Z. , F. J. Schlosser, B. E. Sumpio. The Semmes Weinstein monofilament examination is a significant predictor of the risk of foot ulceration and amputation in patients with diabetes mellitus[J]. Journal Of Vascular Surgery, 2011, 53(1): 220-226.

[4] 許樟榮, 糖尿病足病的診治與預(yù)防[J]. 中華損傷與修復(fù)雜志(電子版), 2014, 9(2): 118-122.

[5] Danaei, G. National, regional, and global trends in fasting plasma glucose and diabetes prevalence since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 370 country-years and 2.7 million participants[J]. Lancet, 2011, 378(9785): 31-40.

[6] Londahl, M. , M. Landin-Olsson, P. Katzman. Hyperbaric oxygen therapy improves health-related quality of life in patients with diabetes and chronic foot ulcer[J]. Diabet Med, 2011, 28(2): 186-190.

[7] 夏杰瓊. 個(gè)體化健康指導(dǎo)用于42例糖尿病足高?；颊叩男Чu(píng)價(jià)[J]. 中華護(hù)理雜志, 2011, 46(6): 563-566.

[8] Zannad, F. Heart failure and mortality outcomes in patients with type 2 diabetes taking alogliptin versus placebo in EXAMINE: a multicentre, randomised, double-blind trial[J]. Lancet, 2015, 385(9982): 2067-2076.

[9] Noordzij, M. J. Skin autofluorescence and risk of micro-and macrovascular complications in patients with Type 2 diabetes mellitus-a multi-centre study[J]. Diabet Med, 2012, 29(12): 1556-1561.

[10] Chen, D. Inhibition of Na+/K+-ATPase induces hybrid cell death and enhanced sensitivity to chemotherapy in human glioblastoma cells[J]. BMC Cancer, 2014, 14(1): 716-716.

[11] Shah, M. S. , M. Brownlee. Molecular and Cellular Mechanisms of Cardiovascular Disorders in Diabetes[J]. Circ Res, 2016, 118(11): 1808-1829.

[12] Herchuelz, A. Na(+)/Ca (2+) exchange and the plasma membrane Ca(2+)-ATPase in beta-cell function and diabetes[J]. Adv Exp Med Biol, 2013, 961: 385-394.

[13] 王艷艷. 凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2與Bax在早期壓瘡組織中的作用[J]. 中華燒傷雜志, 2011, 2011, 27(3): 197-199.

[14] Edlich, F. Bcl-x(L) Retrotranslocates Bax from the Mitochondria into the Cytosol[J]. Cell, 2011, 145(1): 104-116.

[15] 董秀麗. Ⅳ期壓瘡感染患者危險(xiǎn)因素分析與干預(yù)措施[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志, 2015, 9(15): 2106-2107.

[16] 林貞. 社區(qū)護(hù)理干預(yù)對(duì)2型糖尿病患者服藥依從性和血糖控制的影響[J]. 實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志, 2014, 18(E1): 166-167.

[17] 陽琳玉. 健康信念干預(yù)在2型糖尿病患者行為改變中的應(yīng)用效果觀察[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué), 2014, 37(4): 57-57.

[18] 左明輝, 王秀玲. 臨床護(hù)理路徑應(yīng)用于糖尿病患者健康教育的效果分析[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué), 2014, 37(5): 57-58.

[19] 李燕, 林玲. 系統(tǒng)健康教育對(duì)糖尿病患者規(guī)范注射胰島素的影響[J]. 實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志, 2016, 20(24): 130-131.