沉默F(xiàn)oxM1對甲狀腺乳頭狀癌細胞增殖、遷徙及侵襲的影響

劉千玉，張國志，田煒，詹琪琪，陳建立，陳俊卯，曹文斌

(1華北理工大學附屬醫(yī)院，河北唐山 063000；2華北理工大學實驗研究中心)

叉頭框轉(zhuǎn)錄因子M1(FoxM1)在很多惡性腫瘤中表達升高，如宮頸癌[1]、胰腺癌[2]、結腸癌[3]及胃癌[4]等，提示FoxM1在腫瘤生長過程中扮演重要角色，但目前FoxM1蛋白在甲狀腺乳頭狀癌中表達及其相關研究較少。2017年6～10月，我們通過脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染FoxM1的siRNA,觀察其對人甲狀腺乳頭狀癌細胞株K1增殖、遷徙及侵襲的影響?，F(xiàn)報告如下。

1　材料與方法

1.1材料人甲狀腺癌細胞株K1購自上海細胞庫，由華北理工大學中心實驗室保存。FoxM1-siRNA靶向序列正向引物為5′-GCUGGGAUCAAGAUUAUUATT-3′，反向引物為3′-UAAUAAUCUUGAUCCCAGCTT-5′，由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成，LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司，RPMI1640培養(yǎng)基、青鏈霉素、新鮮胚胎牛血清、PBS緩沖液及胰蛋白酶均購自以色列BI公司，二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司，Matrigel膠購自BD公司，噻唑藍(MTT)購自美國Amereco公司。

1.2人甲狀腺癌細胞株K1的培養(yǎng)及傳代人甲狀腺癌細胞株K1采用含青霉素、鏈霉素、10%牛胚胎血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，將其置于37 ℃恒溫且5%CO2培養(yǎng)箱中。用光學顯微鏡觀察K1細胞株的生長狀況，并根據(jù)其生長狀態(tài)來確定更換培養(yǎng)基的時間，24～48 h更換一次培養(yǎng)基。待K1細胞貼壁生長至培養(yǎng)瓶壁70%面積時傳代，用PBS溶液輕輕沖掉脫落的細胞及細胞碎片，重復2～3次，然后加入0.25%胰酶1 mL對細胞進行消化，當細胞形態(tài)改變，大致變?yōu)閳A珠狀，并不再附著瓶壁時，加入完全培養(yǎng)基停止消化，吹打均勻后將瓶中帶有細胞的培養(yǎng)基分裝一半到另一培養(yǎng)瓶中，然后將其放回至培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，12 h內(nèi)換液。

1.3 FoxM1.siRNA至人甲狀腺癌細胞株K1的轉(zhuǎn)染嚴格按照上述消化細胞的步驟，用1×106/mL的細胞密度，將消化下來的細胞種植于6孔板中，待細胞融合度達到70%～80%時進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前為避免青鏈霉素對轉(zhuǎn)染造成影響，24 h前改換不含青鏈霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前用PBS溶液將6孔板中的細胞沖洗2次，之后每個孔加入1 mL空白RPMI1640培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱使其饑餓1 h，同時將5 μL的siRNA和5 μL的LipofectamineTM2000分別加入500 μL的空白RPMI1640培養(yǎng)基中孵育5 min，再將兩者混合后靜置20 min，之后將其加入先前制備饑餓細胞的6孔板兩個孔中，作為轉(zhuǎn)染組；重復上述操作將之前的siRNA替換為control siRNA，加入2個孔作為無意義序列組；剩余2個孔加入PBS作為空白對照組。輕輕晃動6孔板，將液體鋪勻孔底，轉(zhuǎn)染6 h后，將孔內(nèi)液體移除，并加入含有血清的RPMI1640培養(yǎng)基，48 h后在200倍熒光顯微鏡下觀察孔內(nèi)帶有熒光的細胞個數(shù)，并記錄其占比，如果帶有熒光的細胞占比達80%以上，即為轉(zhuǎn)染成功。

1.4FoxM1蛋白表達檢測采用免疫印跡試驗。①細胞總蛋白提取：用上述步驟消化狀態(tài)良好且密度達到1×106/mL的細胞,調(diào)制成單細胞懸液。用離心機離心5 min，離心速度1 000 r/min。將少許冰敷過的PBS溶液加入離心瓶中，并將細胞吹勻，再次離心，上述操作重復2次。將離心后的上清液去除，200 μL的RIPA裂解工作液加入到離心過的細胞中，之后將其轉(zhuǎn)入EP管進行超聲波震碎，持續(xù)10 s，重復振蕩10次，吹打均勻，冰上冰敷30 min,再用離心機在4 ℃環(huán)境下以12 000 r/min離心15 min。取離心后的上清液放入-20 ℃冰柜中保存。②蛋白定量：采用BCA法。具體實驗步驟按BCA蛋白定量試劑盒中的說明書進行操作。蛋白定量之后，加入相同體積的2×蛋白上樣緩沖液，之后100 ℃變性5 min，然后放入-80 ℃冰柜中封存?zhèn)溆?。③電泳及轉(zhuǎn)膜：按照定量結果，計算30 μg蛋白上樣的體積，得出結果后進行SDS-PAGE蛋白電泳。根據(jù)所測蛋白相對分子質(zhì)量不同，配置合適濃度的SDS-PAGE膠，按照10%分離膠和5%濃縮膠配置SDS-PAGE膠。將之前準備好的蛋白樣品和標記物按順序加入上樣孔中。在濃縮膠與分離膠中分別用80 V與120 V恒壓電泳，待不同相對分子質(zhì)量蛋白均勻分布于分離膠上后停止電泳。然后將目的蛋白相對分子質(zhì)量所在區(qū)域的膠體切下，將PVDF膜置入甲醇中浸泡約5 s，之后用轉(zhuǎn)膜液將其洗凈。將已用轉(zhuǎn)膜液泡透的濾紙按由下至上的順序(濾紙-PVDF膜-所切凝膠-濾紙)放進濕轉(zhuǎn)膜儀器內(nèi)，90 V恒壓轉(zhuǎn)膜1 h。完成后用TBST沖刷掉膜表面的轉(zhuǎn)膜液，之后放入已配置好的含10%脫脂奶粉的封閉液中2 h。④免疫印跡雜交顯色。待封閉2 h后，用TBST沖刷膜表面，放入配置好的存有一抗的抗體孵育盒中，用脫色搖床在4 ℃環(huán)境下?lián)u動12 h。用TBST將膜沖洗2～3次，每次10 min。放入之前調(diào)配好的存有HRP-IgG二抗的抗體孵育盒中，用脫色搖床在37 ℃環(huán)境下孵育2 h。按照BeyoECL Star(特超敏ECL化學發(fā)光試劑盒)使用說明，上機熒光顯色。Image J軟件分析所測免疫熒光條帶灰度值。相關蛋白表達量計算=(所測蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值)×100%。

1.5細胞增殖抑制率測算采用MTT法。按上述將FoxM1的siRNA轉(zhuǎn)染至人甲狀腺癌細胞株K1的步驟，將細胞分為3組，并將細胞消化下去，并調(diào)制成單細胞懸液，以1×104/mL的細胞密度將細胞均勻種于96孔板中，四周的孔內(nèi)加入等體積PBS。將分組后的每組細胞設置6個副孔，之后將其分為24、48、72 h組，并在每組時間點的前4 h加入20 μL的MTT藥劑進行培育，使之形成甲贊藍，之后在每組各自的時間點，將孔內(nèi)液體移除，每個小孔中加入150 μL的DMSO，并振動10 min，酶標儀的波長選擇490 nm，以空白孔作為調(diào)0孔，用酶標儀測各組每個孔的OD值；對測得的吸光度值刪除最大值及最小值，其余數(shù)據(jù)取平均值；重復以上實驗3次。按照公式計算FoxM1-siRNA對細胞增長的抑制率：細胞增殖抑制率=(空白對照組OD490-轉(zhuǎn)染組OD490)/空白對照組OD490×100%。

1.6細胞遷徙能力檢測采用單層細胞劃痕損傷修復實驗進行檢測。按上述步驟將細胞分組后，培養(yǎng)于6孔板中，每組取2個復孔，放入培育箱培育。等到細胞基本鋪滿孔底，形成細胞單層后，用200 μL的槍頭在每個孔內(nèi)做一條劃痕，寬度控制在0.6 mm左右，然后使用PBS溶液對每個孔進行沖刷2～3次，沖刷掉脫落的細胞及細胞殘片，棄培養(yǎng)基，加入空白的RPMI1640培養(yǎng)基，并進行記錄，記為0 h，之后每24 h拍照記錄1次，直到72 h。觀察0、24、48、72 h照片中劃痕的面積變化。

1.7腫瘤細胞體外侵襲能力檢測實驗前將準備好的Matrigel膠放入4 ℃冰箱中12 h，之后將Matrigel膠和空白RPMI1640按1∶9比例配液，取20 μL配好的Matrigel膠均勻鋪在Transwell小室上，滴加Matrigel膠時注意不要產(chǎn)生氣泡，之后將Transwell盒放入培育箱12 h使Matrigel膠凝固，按上述實驗將分好組的細胞培育48 h后消化下來，以2×105/mL密度100 μL無血清無青鏈霉素培養(yǎng)基種到小室的上室，將僅含有10%濃度血清的1640培養(yǎng)基600 μL加入到下室；隨后移入培育箱中培育18 h；之后用PBS溶液沖刷小室3次，清除上室表層的細胞，用4%甲醛浸泡30 min；取出小室，再次用PBS溶液沖洗，并自然風干；之后在小孔中添加結晶紫染色15～20 min，用蒸餾水沖洗干凈；將聚碳酸酯膜從小室上切下來并放到載玻片上，當其風干后，用中性樹膠滴在切片中央并用蓋玻片蓋上干燥；用200倍光學顯微鏡觀察穿過聚碳酸酯膜的細胞，隨機觀察15個視野，并記錄穿過的細胞數(shù)量，計算其平均值，然后進行對比，實驗重復3次。

2　 結果

2.1各組FoxM1蛋白相對表達量比較空白對照組、無意義序列組、轉(zhuǎn)染組FoxM1蛋白相對表達量分別為0.96±0.01、0.95±0.01、0.27±0.03，轉(zhuǎn)染組與空白對照組、無意義序列組比較，P均<0.05；空白對照組與無意義序列組比較，P>0.05。

2.2各組細胞增殖率比較見表1。轉(zhuǎn)染組細胞生長均受到抑制，與無意義序列組、空白對照組比較，P均<0.05；無意義序列組與空白對照組比較，P>0.05。

表1　三組不同時點細胞增殖率比較

注：與轉(zhuǎn)染組相比，*P<0.05。

2.3各組細胞遷徙能力比較24 h后，空白對照組、無意義序列組、轉(zhuǎn)染組劃痕面積相對比值分別為0.83±0.01、0.82±0.01、0.93±0.01，轉(zhuǎn)染組與空白對照組、無意義序列組比較，P均<0.05；空白對照組與無意義序列組比較，P>0.05。

2.4各組腫瘤細胞體外侵襲能力比較空白對照組、無意義序列組、轉(zhuǎn)染組穿過上小室背面的細胞數(shù)分別為(92.40±3.05)、(85.40±5.13)、(37.20±3.96)個/視野，轉(zhuǎn)染組與空白對照組、無意義序列組比較，P均<0.05;空白對照組與無意義序列組比較，P>0.05。

3　討論

甲狀腺癌在發(fā)展中國家的發(fā)病率雖然不高，僅占所有惡性腫瘤的1%，但其在內(nèi)分泌系統(tǒng)腫瘤中常見，目前甲狀腺癌在我國的發(fā)病率排在所有腫瘤疾病的第10位，其中甲狀腺乳頭狀癌最常見，占所有類型甲狀腺癌的70%左右，且發(fā)病率日益增加[5]。甲狀腺乳頭狀癌惡性程度并不高且生長相對較慢，易出現(xiàn)淋巴結轉(zhuǎn)移。手術是治療甲狀腺癌的首要方式，但因其解剖結構復雜，血供豐富，再加上其內(nèi)分泌的作用，致使術后并發(fā)癥多[6]。術后10年生存率較高[7]，但其復發(fā)率亦很高，后果是伴隨病死率的升高。因此尋求新的靶向治療藥物已成為研究和治療甲狀腺癌亟待解決的問題。

正常人體細胞有增殖、凋亡生理過程，而腫瘤細胞的增殖及凋亡均出現(xiàn)異常狀態(tài)。研究[8]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxM1基因異常表達可能致腫瘤細胞增殖及凋亡改變。FoxM1可調(diào)控部分相關代謝過程，使腫瘤細胞增殖、能量代謝保持平衡，不僅如此，F(xiàn)oxM1還參與腫瘤細胞凋亡、轉(zhuǎn)移等相關進程的調(diào)控，與腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移、血管形成和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化等關系密切[9，10]，F(xiàn)oxM1表達異常與腫瘤患者的臨床分型差、預后差有明顯相關性。國內(nèi)關于FoxM1在甲狀腺癌中表達意義的研究相對較少，且多通過組織水平實驗[11]證明FoxM1過表達對甲狀腺癌增殖等生物學行為有促進作用。

FoxM1屬于Forkhead的轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，其主要功能是調(diào)節(jié)細胞G1期的過渡，從而調(diào)節(jié)細胞有絲分裂，所以FoxM1只在具有絲分裂功能的細胞中表達，且FoxM1在細胞增殖周期中起重要作用[12,13]。FoxM1位于染色體12p13.3的末端著絲粒區(qū)域，其長度約為25 kb，F(xiàn)oxM1主要功能是增強細胞和組織的增殖，在胎兒組織中表達更廣泛。如果FoxM1的一些功能缺失，導致其過度表達，則會導致細胞增殖等一系列生物學行為紊亂，阻礙細胞分化，導致細胞惡變。本研究結果顯示，空白對照組、無意義序列組、轉(zhuǎn)染組FoxM1蛋白相對表達量、細胞增殖率、穿過上小室背面的細胞數(shù)低于空白對照組、無意義序列組，劃痕面積相對比值高于空白對照組、無意義序列組，差異均有統(tǒng)計學意義，證實沉默F(xiàn)oxM1可抑制人甲狀腺乳頭狀癌K1細胞株增殖，降低細胞侵襲及遷徙能力，F(xiàn)oxM1有望成為甲狀腺乳頭狀癌新的靶向治療基因。

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