新霉素分批發(fā)酵過程特性與動力學(xué)研究

邱小明

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新霉素分批發(fā)酵過程特性與動力學(xué)研究

邱小明

（漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品工程學(xué)院，福建 漳州 363000）

對弗氏鏈霉菌()產(chǎn)新霉素的發(fā)酵過程研究表明菌體生長和產(chǎn)物合成過程具有典型的非生長耦聯(lián)特征，發(fā)酵過程最大比生長速率為0.0612h-1，產(chǎn)物最大比合成速率為3.2×10-4g·g-1·h-1。建立了新霉素分批發(fā)酵過程產(chǎn)物合成期的動力學(xué)模型，對模型參數(shù)進行了估計和回歸，模型擬合平均偏差小于8.5%，可用于新霉素發(fā)酵過程優(yōu)化控制。

費氏鏈霉菌；新霉素；分批發(fā)酵；動力學(xué)模型

新霉素是從弗氏鏈霉菌的代謝產(chǎn)物中分離出來的一種氨基糖苷類堿性抗生素[1]，由2－脫氧鏈霉胺（環(huán)Ⅰ）、新霉糖胺C（環(huán)Ⅱ）、新霉糖胺B（環(huán)Ⅳ）與核糖（環(huán)Ⅲ）4個亞單位組成，對許多致病菌有抗生素后效應(yīng)（PAE）[2]，具有較廣的應(yīng)用前景。為了提高新霉素的產(chǎn)量，有必要研究發(fā)酵策略，Perk等[3]發(fā)現(xiàn)在氣升式反應(yīng)器高度粘稠的發(fā)酵培養(yǎng)基中，利用纖維素包埋的固定化細胞能夠大幅提高新霉素的產(chǎn)量；Adinarayana等[4]采用多參數(shù)混合實驗設(shè)計和表面反應(yīng)技術(shù)考察了所補加的營養(yǎng)物組成和濃度對NUV-5固態(tài)發(fā)酵新霉素的影響，得到可提高產(chǎn)量的補料培養(yǎng)基的最佳組成和濃度。

通過建立數(shù)學(xué)模型也是實現(xiàn)發(fā)酵過程優(yōu)化控制的關(guān)鍵[5]。國內(nèi)外對青霉素、谷氨酸等發(fā)酵過程的非結(jié)構(gòu)數(shù)學(xué)模型的建立和參數(shù)估計有很多的報道[6-8]，但對新霉素發(fā)酵過程的優(yōu)化控制未見報道。本研究通過建立相關(guān)數(shù)學(xué)模型，探求新霉素分批發(fā)酵過程內(nèi)在規(guī)律，為新霉素發(fā)酵過程的優(yōu)化控制提供較好的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌種和培養(yǎng)基

弗氏鏈霉菌FIM-S38，由麗珠醫(yī)藥集團福州福興醫(yī)藥有限公司提供。

斜面培養(yǎng)基(%)：牛肉膏1.0%，NaCl 0.3%，蛋白胨1.0%，瓊脂2.0%，滅菌前pH7.5，接種后于28℃培養(yǎng)8~9d。

種子培養(yǎng)基(%)：玉米淀粉5.0%，葡萄糖3.0%，蛋白胨1.0%，輕質(zhì)CaCO32.0%，玉米漿2.0%，Na2HPO40.8%，(NH4)2SO40.7%，自然pH，接種后于30℃培養(yǎng)2d。

發(fā)酵培養(yǎng)基(%)：玉米漿3.0%，玉米淀粉8.0%，葡萄糖2.0%，(NH4)2SO41.0%，蛋白胨1.0%，MgSO40.1%，Na2HPO40.5%，淀粉酶(4 kU·g- 1) 0.05%，輕質(zhì)CaCO32.0%，自然pH，接種后于32℃培養(yǎng)5d。

1.2培養(yǎng)方法

5L發(fā)酵罐：滅菌后pH控制在6.5，接種量7.5%~10%，采用分批補料工藝發(fā)酵。

1.3分析方法

（1）pH：Mettler電極。

（2）菌體濃度：采用離心稱重法（4000r/min，10min，再根據(jù)花生餅粉及其他固體雜質(zhì)等扣除非菌體部分后稱重）單位g/L。TG-10高速臺式離心機，3000rpm 15min，上海第三分析儀器廠。

（3）空氣流量：孔板流量計+電動差壓變送器（DBC-5500）。

（4）溶氧濃度：12/220S型電極+2100型變送器，Metler Toledo，USA。測定結(jié)果以百分飽和度%表示，即在26℃、1.0atm下空氣在純水中的飽和濃度按100%計。

（5）粘度：旋轉(zhuǎn)粘度計NDJ-1型，上海天平儀器廠。

（6）發(fā)酵液密度：離心體積稱重法。

（7）總糖濃度ST和還原糖濃度S測定采用斐林－碘量法[9]。將發(fā)酵液過濾，吸0.5ml于150ml三角瓶中，加入10ml 3N HCl于電熱板上加熱，從沸騰起保持2min，冷卻后加6N naOH 5ml，精確加入20ml斐林試劑，搖勻后置電熱板上加熱沸騰后保持2min，加入15ml（2N）H2SO4搖勻，立即用0.1N Na2S2O3標準溶液滴定，近終點時加入0.5%淀粉指示劑2ml滴至蘭色剛好消失，記下讀數(shù)，查表計算即可求得總糖濃度。測定還原糖時不必加HCl和加熱水解，其余步驟均不變。

（8）氨基氮的測定[10]。原理：蒸餾釋放出的氨被接受瓶中的硼酸溶液吸收，以甲基紅-亞甲藍為指示劑，用酸標準溶液滴定餾出液中的氨。過程：用0.1g甲基紅及0.05g次甲基藍以95％酒精溶解成100ml然后準確吸取2ml 發(fā)酵上清液于凱氏燒瓶中，加蒸餾水25 ml，液體石蠟1 ml，另取一個150ml 三角瓶，加10ml 2.5％硼酸液及10ml蒸餾水和一滴混合指示劑用0.02858N H2SO4液調(diào)節(jié)至紫紅色，放在蒸餾器冷凝管出口處，然后加5ml 飽和碳酸鈉液于凱氏燒瓶中，立即塞好，用小火加熱，從接收三角瓶顏色由紫紅色變成綠色起10min，用蒸餾水沖盡冷凝管所附著之溶液，取下三角瓶以0.02858N H2SO4滴定至紫紅色，即為終點，記取讀數(shù)，計算結(jié)果：

（N*V*0.014*100*1000）/2=mg/100ml

式中 N—硫酸的標準溶液＝0.02858N V—滴定消耗硫酸標準液ml數(shù)

（9）新霉素素效價：產(chǎn)物濃度測定采用OPA柱前衍生化方法[11]。色譜條件：Waters Symmetry C184.6mm×150mm×5μm，流動相為水:甲醇進行梯度洗脫（開始水:甲醇含量為70:30梯度到80:20）；流速1mL/min，柱溫30℃，進樣量10μL。檢測器為二極管陣列檢測器。衍生化試劑的配制：用10mol/L的KOH將配制好的0.2mol/L的硼酸溶液調(diào)pH至10.5，然后將OPA溶解在硼酸緩沖液中，濃度為0.1％（w/v），再加入1％（v/v）巰基乙醇，混勻，于冰箱避光放置。用去離子水配制硫酸新霉素標準液濃度為10mg/mL，4℃冰箱放置。取0.2mL樣品到1.5mL的離心管中，加入0.2mL的OPA衍生化試劑，密閉、30℃水浴避光反應(yīng)10min，加入0.8mL異丙醇，振蕩混勻。標準樣品和樣品衍生化反應(yīng)后用0.2um的濾膜過濾，取濾液10ul進樣。用去離子水代替樣品進行同樣的處理，作為空白對照。檢測波長為334nm，新霉素的保留時間為7.4min。

2 結(jié)果與討論

2.1新霉素發(fā)酵特性分析

新霉素補料分批發(fā)酵過程參數(shù)變化規(guī)律及代謝特性如圖1與圖2所示，新霉素發(fā)酵過程菌體的生長期和產(chǎn)物的合成期嚴格分開，在30h前菌體高速生長后菌體濃度維持在比較穩(wěn)定的水平，發(fā)酵過程最大比生長速率為0.0612h-1，從30h開始，產(chǎn)物的合成一直維持一個比較高的速率（3.0×10-4g·g-1·h-1），菌體生長與產(chǎn)物合成表現(xiàn)出非生長偶聯(lián)特征。新霉素發(fā)酵過程大體上可分四個階段。

第一階段：延滯期，約在接種后0-10h。此階段菌絲體濃度低，鏡檢檢出量少，菌體呼吸強度弱，發(fā)酵液粘度和菌體濃度變化緩慢，還原糖和總糖消耗速度緩慢，此階段氨氮的消耗速度也較為緩慢。

第二階段：對數(shù)生長期，約在接種后10-30h。此階段發(fā)酵液黏度和菌體濃度急速提高，鏡檢結(jié)果可以看到大量菌絲，且粗壯飽滿，外緣清晰。菌體呼吸強度迅速上升，發(fā)酵液的溶氧濃度迅速下降，在接種后16-20h溶氧濃度降至整個發(fā)酵過程的最低點。此階段還原糖消耗顯著，總糖消耗速率加快，氨氮的消耗速度也達到整個發(fā)酵過程的最高水平。接種后第30h，菌體濃度和粘度達到最高值或接近最高值，菌體最大比生長速率為0.0612h-1。

第三階段：產(chǎn)物合成期，約在接種后30-100h。此階段發(fā)酵液黏度略為下降但不明顯，菌體濃度也較為穩(wěn)定，鏡檢結(jié)果顯示細胞外緣仍然清晰，菌絲體長度較對數(shù)生長期短。產(chǎn)物在30h后開始形成，產(chǎn)物濃度與發(fā)酵時間的增加幾乎呈線形增加，產(chǎn)物最大比合成速率為3.2×10-4g·g-1·h-1。此階段還原糖、總糖、氨氮消耗速率穩(wěn)定。

第四階段：菌體活性衰退期，約在接種后100-120h。此階段菌體自溶，發(fā)酵液黏度和菌體濃度下降，鏡檢結(jié)果顯示菌絲體外緣模糊，菌絲變細且有斷層，部分自溶。菌體的呼吸強度減弱，在相同的通氣條件下溶氧濃度迅速上升。微生物活性明顯下降，產(chǎn)物濃度增長速率緩慢。還原糖、總糖、氨氮的消耗速率明顯下降，發(fā)酵液pH逐漸上升。

圖1新霉素發(fā)酵過程的微生物生長特性圖

A：總糖、還原糖、ph值變化情況 B：新霉素發(fā)酵過程μ與qp的關(guān)系

圖2新霉素發(fā)酵發(fā)酵過程碳源、氮源的消耗量和產(chǎn)物的積累

2.2新霉素發(fā)酵動力學(xué)模型

新霉素發(fā)酵過程存在連續(xù)補料過程，因此整個發(fā)酵體系為變?nèi)蒹w系，物料衡算應(yīng)為全微分方程組分別建立不同模型進行測定：

（1）經(jīng)歷了對數(shù)生長期，在產(chǎn)物合成期后菌體濃度達到最大值并基本穩(wěn)定，維持在400-430(g·L-1)（濕細胞，密度為1.05(g·L-1)，下同）左右。在這一階段，可能是細胞的生長存在空間限制而使得細胞量相對穩(wěn)定。在對發(fā)酵過程數(shù)據(jù)分析的基礎(chǔ)上，認為菌體生長速率與還原糖濃度S和菌體濃度X有關(guān)，由于細胞在代謝過程中存在死亡現(xiàn)象，所以考慮了細胞的死亡情況。

（2）根據(jù)細胞比生長速率μ與產(chǎn)物比合成速率qp的關(guān)系，新霉素發(fā)酵屬于典型的次級代謝產(chǎn)物，產(chǎn)物合成可采用以下模型：

（3）根據(jù)物料衡算可知糖類底物變化情況：反應(yīng)體系內(nèi)總糖（ST）的變化速率等于維持細胞生長和產(chǎn)物合成的糖的消耗，并與發(fā)酵過程的補料相關(guān)聯(lián)。根據(jù)物料衡算，并假定YG、YP、m均為常數(shù)，可得：

（4）反應(yīng)體系內(nèi)還原糖的變化速率應(yīng)為非還原糖的水解速率與微生物的還原糖利用速率之差，并與此時發(fā)酵過程補加的還原糖的速率有關(guān)。微生物還原糖的利用速率主要表現(xiàn)在維持菌體的生長和產(chǎn)物合成所消耗的糖，所以有：

（5）在本實驗范圍內(nèi)，根據(jù)發(fā)酵階段的補料量和蒸發(fā)量的變化來確定體積的變化情況：

（6）根據(jù)補料情況，本實驗過程中產(chǎn)物合成階段的補糖量可用以下方程進行擬合：

（7）為了更好地研究產(chǎn)物合成期階段的發(fā)酵動力學(xué)特性，把產(chǎn)物合成期階段的淀粉水解酶表觀活力的變化情況進行了擬合:

將以上模型進行簡化，可以得到描述產(chǎn)物合成期各狀態(tài)變量（細胞濃度X、底物濃度S、總糖濃度ST和產(chǎn)物濃度P的動力學(xué)模型：

2.3動力學(xué)模型參數(shù)的估算與模型驗證

表1 產(chǎn)物合成期動力學(xué)模型參數(shù)值

以上參數(shù)的估計值均符合其物理意義，說明以上參數(shù)適用于上述動力學(xué)模型。

模型狀態(tài)變量模擬值與實驗值比較如圖3和表2所示。

圖3 發(fā)酵過程動力學(xué)模型預(yù)測值與實驗數(shù)據(jù)比較

注：X、ST、S、P分別為各狀態(tài)變量的實驗值；X’、ST’、S’、P’為估計值

表2 狀態(tài)變量擬合偏差

由圖3和表2可以看出，除了總糖濃度偏差較大外其它數(shù)據(jù)預(yù)測值與實驗數(shù)據(jù)都比較吻合，模型擬合值與實驗值的平均相對偏差較小（<8.5%），說明本工作所確定的動力學(xué)模型較好地反映了產(chǎn)物合成期新霉素發(fā)酵過程狀態(tài)變量的變化規(guī)律。

3 結(jié)論

由以上分析可知新霉素產(chǎn)生菌在發(fā)酵過程菌體生長與產(chǎn)物合成具有非生長耦聯(lián)特征。在30h前菌體高速生長后菌體濃度維持在比較穩(wěn)定的水平，對數(shù)生長期菌體最大比生長速率為0.0612h-1；產(chǎn)物最大比合成速率為3.2×10-4g·g-1·h-1。

建立了分批發(fā)酵過程產(chǎn)物合成期的動力學(xué)模型，對模型參數(shù)進行了估算和回歸，模型擬合值與實驗值的相對偏差較?。?8.5%）說明本工作所確定的動力學(xué)模型能較好地反映產(chǎn)物合成期新霉素發(fā)酵過程狀態(tài)變量的變化規(guī)律。實際上，上述模型是在不斷的修正中得到的，也就是說，該模型是在對新霉素產(chǎn)物合成期所表現(xiàn)出來的外在現(xiàn)象和本質(zhì)的分析基礎(chǔ)上，結(jié)合經(jīng)驗和參數(shù)估計的結(jié)果得到的，同時也得到實驗數(shù)據(jù)的證實，具有一定的合理性，為新霉素發(fā)酵過程的模擬、預(yù)測和優(yōu)化控制以及中試放大提供理論和實踐依據(jù)，具有一定的理論和實際應(yīng)用價值。

符號說明

菌體濃度g·L-1總糖濃度g·L-1 還原糖濃度g·L-1產(chǎn)物濃度g·L-1 發(fā)酵液體積L 淀粉水解酶活力g·L-1·h-1 補料速率g·L-1·h-1細胞最大比生長速率h-1 細胞維持系數(shù)g·g-1·h-1細胞的生長得率系數(shù)g·g-1 產(chǎn)物得率系數(shù)g·g-1底物飽和常數(shù)g·L-1 底物效率因子無因次細胞死亡常數(shù)h-1 常數(shù)h-1模型系數(shù)無因次 常數(shù)g·L-2產(chǎn)物比生成速率mg·g-1 h-1 qst單位時間菌體糖耗速率g·L-1 h-1J總相對偏差平方和無因次

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（責任編輯：馬圳煒）

Studies on the Characteristics of Neomycin Batch Fermentation Process and Kinetics

QIU Xiao-ming

（School of food engineering, Zhangzhou Institute of Technology, Zhangzhou 363000, China）

The research on the fermentation process ofproducing neomycin shows that cell growth and product synthesis process take on a typical non-growth coupled characteristics. The maximum specific growth rate of the fermentation process was 0.0612 h-1and the synthetic rate of the product maximum ratio was 3.2×10-4g·g-1·h-1. The kinetic model for product synthesis period of a batch fermentation process was established and the model parameters were estimated and regressed. The average deviation of model fitting is less than 8.5% which can be used to optimize the control of neomycin fermentation process.

; neomycin; batch fermentation; kinetic model

2017－12－27

漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院科研計劃資助項目（ZZY1509）。

邱小明（1979—），男，江西贛州人，講師，碩士，研究方向：食品生物技術(shù)與生物化工。

1673-1417（2018）01-0053-06

10.13908/j.cnki.issn1673-1417.2018.01.0012

TQ465

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