Vero細(xì)胞培養(yǎng)A/Shanghai/02/2013（H7N9）Va流感病毒適宜條件研究

非成瑞，馬磊，高菁霞，崔兆海，宋紹輝，李衛(wèi)東，廖國(guó)陽(yáng)

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南 昆明650118

流感病毒目前仍是人類健康的重大威脅之一[1-3]。H7N9 流感病毒自2013年以來(lái)，在我國(guó)共計(jì)發(fā)生5 次人群感染暴發(fā)疫情，截至2017年8月7日，感染病例1557 例，其中605 人死亡，病死率高達(dá)38.86%[3]。疫苗接種是對(duì)抗流感病毒感染和傳播的最有效方法。20 世紀(jì)40年代以來(lái)，雞胚生產(chǎn)人用流感疫苗的方法已成功使用了數(shù)十年[4-5]。然而，當(dāng)面臨流感大流行或生產(chǎn)針對(duì)高致病性甲型流感病毒的疫苗時(shí)，雞胚的生產(chǎn)能力有限，并且卵清蛋白的存在會(huì)引起過(guò)敏反應(yīng)[6]。相比之下，基于細(xì)胞培養(yǎng)的生產(chǎn)系統(tǒng)可以更快速地生產(chǎn)疫苗，更容易擴(kuò)大規(guī)模，不會(huì)引起過(guò)敏反應(yīng)，并且有研究表明與MDCK 細(xì)胞和雞胚相比，在Vero 細(xì)胞中培養(yǎng)的甲型流感病毒血凝素蛋白（hemagglu?tinin，HA）糖基化方式與在人呼吸道上皮細(xì)胞分離出的流感病毒更接近，用Vero 細(xì)胞培養(yǎng)的流感疫苗可能能更好地介導(dǎo)人體產(chǎn)生對(duì)流感的免疫應(yīng)答[7]，該細(xì)胞系的安全性已得到充分證實(shí)[8]，世衛(wèi)組織建議將Vero 細(xì)胞作為流感疫苗生產(chǎn)的替代基質(zhì)，這也是流感大流行應(yīng)急儲(chǔ)備的一項(xiàng)重要內(nèi)容。在本研究中，我們用Vero 細(xì)胞作為培養(yǎng)基質(zhì)，培養(yǎng)反向遺傳學(xué)技術(shù)重組獲得的H7N9 病毒株，對(duì)其培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化后連續(xù)傳代15 代得到Vero 細(xì)胞適應(yīng)的H7N9 高產(chǎn)株，并對(duì)細(xì)胞工廠進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)條件優(yōu)化，病毒產(chǎn)量穩(wěn)定，可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

143 代Vero 細(xì)胞來(lái)源于美國(guó)ATCC；甲型流感病毒Vero 細(xì)胞適應(yīng)株A/Shanghai/02/2013（H7N9）Va，是由H3N2 流感病毒Vero 細(xì)胞適應(yīng)株的6 個(gè)基因片段（PB1、PB2、PA、NP、M、NS）與H7N9 的2 個(gè)基因片段（HA、NA）重配獲得，該重配毒株的減毒特性已在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)[9]。細(xì)胞和毒株均由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所生物制品五室保存。

DMEM/F12 培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco 公司；MEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基和PBS 由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所溶液組提供；TPCK 胰酶購(gòu)自Worthington 公司；牛血清白蛋白（BSA）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；細(xì)胞工廠購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司；流感病毒吸附液（DMEM/F12 和MEM 以1∶1 混合，添加不同量的碳酸氫鈉和TPCK 胰蛋白酶）、維持液［DMEM/F12 和MEM 以1∶1 混合，添加0.3 mg/mL BSA、1%谷氨酰胺和0.5%雙抗（10 kU/mL 青霉素+10 mg/mL 鏈霉素）為基本成分，添加不同量的碳酸氫鈉和TPCK 胰蛋白酶等］由云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2 病毒培養(yǎng)條件的優(yōu)化

采用單一變量法，分別對(duì)病毒接種MOI、培養(yǎng)溫度、pH 值和TPCK 胰酶等毒株培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。向基本成分中加入不同濃度的TPCK 胰酶，分別配制病毒吸附液和維持液。T225 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中長(zhǎng)成致密單層的Vero 細(xì)胞經(jīng)0.125%的胰蛋白酶消化后傳代至T25 瓶中，置37℃培養(yǎng)48 h；細(xì)胞長(zhǎng)滿致密單層后用PBS 洗3 次，因?yàn)榧?xì)胞培養(yǎng)液中血清類淀粉蛋白P 會(huì)抑制甲型流感病毒表面唾液?；堑鞍椎幕钚?，影響病毒的產(chǎn)量[10]，根據(jù)不同條件接種H7N9 型重配流感病毒，置37℃培養(yǎng)吸附1 h；加入病毒維持液后于33℃繼續(xù)培養(yǎng)72 h 后收集培養(yǎng)液，3000r/min 離心20 min，收集上清液，測(cè)定血凝滴度[11]。

1.3 病毒在Vero細(xì)胞中的連續(xù)傳代培養(yǎng)

Vero細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，H7N9病毒用吸附液（DMEM/F12和MEM以1∶1混合，添加1.5μg/mLTPCK胰蛋白酶和NaHCO3至pH值為7.4）以1∶1000稀釋后接種Vero細(xì)胞，于34℃吸附1h后補(bǔ)加維持液（DMEM/F12和MEM以1∶1混合，添加0.3mg/mLBSA、1%谷氨酰胺、0.5%雙抗和1.5μg/mL TPCK胰蛋白酶，添加NaHCO3至pH值為7.4），于34℃繼續(xù)培養(yǎng)，感染48h后補(bǔ)加TPCK胰酶至1μg/mL，72h后收集培養(yǎng)上清，3000r/min離心20min，收集上清液，測(cè)定血凝滴度，凍存于-80℃。所收獲的病毒液以1∶1000稀釋后繼續(xù)接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Vero細(xì)胞。如此連續(xù)傳代至第15代。

1.4 測(cè)定病毒TCID50

將MDCK 細(xì)胞用0.125%胰酶消化后計(jì)數(shù)，以1.5×104/孔的數(shù)量加到96 孔板中，于37℃、0.5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h 后細(xì)胞長(zhǎng)滿致密單層，用病毒稀釋液（DMEM/F12 和MEM 以1∶1 混合，添加0.3 mg/mL BSA、1%谷氨酰胺、0.5%雙抗和2 μg/mL TPCK 胰酶，并添加NaHCO3至pH 值為7.2～7.6）將病毒進(jìn)行1/10 梯度稀釋，每個(gè)稀釋度8 個(gè)孔，每孔100 μL 病毒稀釋液，于34℃、0.5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，收獲病毒感染細(xì)胞上清液，測(cè)定血凝效價(jià)，按Reed-Meunch 法計(jì)算病毒感染性滴度（TCID50/mL）。

1.5 細(xì)胞工廠大規(guī)模培養(yǎng)及工作種子批的制備

按照優(yōu)化的H7N9 流感病毒培養(yǎng)條件，用細(xì)胞工廠培養(yǎng)病毒。細(xì)胞工廠規(guī)格為10 層托盤(pán)，培養(yǎng)面積6320 cm2，培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量最高可達(dá)16 億，一個(gè)細(xì)胞工廠的病毒液產(chǎn)量為1.5 L。但是，利用細(xì)胞工廠大規(guī)模培養(yǎng)病毒時(shí)，病毒吸附這一步驟使生產(chǎn)工藝變得繁瑣。為簡(jiǎn)化Vero 細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)流感病毒的工序，通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)比吸附和不吸附接種病毒，檢測(cè)病毒收獲液的血凝效價(jià)，同時(shí)接種20 個(gè)細(xì)胞工廠，其中10 個(gè)用以MOI 為0.001 稀釋后吸附1 h 再補(bǔ)加維持液接種病毒，其余則將病毒按MOI 為0.001 直接用維持液稀釋接種Vero 細(xì)胞。同時(shí)為制備工作種子批，接種18 個(gè)細(xì)胞工廠，收獲病毒液，6000 r/min 離心15 min 去除細(xì)胞碎片，以13 mL/支分裝，凍存于-80℃。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)條件重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)采用Graphpad軟件分析，以x±s表示各指標(biāo)水平，組間差異性檢驗(yàn)采用方差分析（Ordinary one-way ANOVA），P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病毒培養(yǎng)條件

在其他條件保持一致情況下，分別以MOI 為0.001、0.01、0.1、1.0 接種病毒，血凝效價(jià)統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果無(wú)顯著性差異（圖1A），雖然MOI 為1 和0.1 時(shí)細(xì)胞在50～60 h 全部病變，MOI 為0.01 和0.001 則需要66～72 h，但是在建立毒種時(shí)要求毒種能以最小接種量達(dá)到最大產(chǎn)量，且大規(guī)模生產(chǎn)疫苗時(shí)需要在快速生產(chǎn)疫苗的同時(shí)節(jié)約成本，因此最終確定最佳接種MOI 為0.001。分別在33℃、33.5℃、34℃、34.5℃和35℃下培養(yǎng)H7N9 流感病毒，34℃、34.5℃和35℃的結(jié)果顯示無(wú)顯著性差異，均可達(dá)到較高的血凝滴度（圖1B）。分別以pH 值為7.0、7.2、7.4、7.6、7.8 和8.0 培養(yǎng)H7N9 病毒，最終得到最佳培養(yǎng)pH 值為7.4（圖1C）。由于流感病毒增殖過(guò)程中需要TPCK 胰酶使血凝素前體蛋白（hae?magluttinin precursor，HA0）裂解為HA1 和HA2 后才具有感染性，在吸附液和維持液中須添加一定量的TPCK 胰酶，并且為了保障新的病毒可以繼續(xù)復(fù)制，需要在病毒培養(yǎng)一段時(shí)間后進(jìn)行補(bǔ)加，但實(shí)驗(yàn)證明過(guò)多的TPCK 胰酶會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷，反而會(huì)影響病毒的復(fù)制。設(shè)置TPCK 胰酶添加量分別為0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1 μg/mL，并且在48 h 后補(bǔ)加量為0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 μg/mL，最終得到的TPCK 胰酶添加量和病毒培養(yǎng)48 h 后的補(bǔ)加量分別為1.5 μg/mL（圖1D）和1.0 μg/mL（圖1E）。

綜上所述，該重配H7N9 流感病毒的最適培養(yǎng)條件為：以MOI 為0.001 接種病毒，培養(yǎng)液pH 值為7.4，TPCK 胰酶添加量為1.5 μg/mL 時(shí)，于34～35℃培養(yǎng)48 h，補(bǔ)加TPCK 胰酶至終濃度為1.0 μg/mL，培養(yǎng)72 h 左右，待細(xì)胞完全病變時(shí)收獲培養(yǎng)液。

2.2 病毒連續(xù)傳代結(jié)果

用優(yōu)化后的培養(yǎng)條件接種病毒，病毒收獲后以1∶1000 稀釋，連續(xù)傳至15 代，檢測(cè)每一代的血凝效價(jià)和病毒感染性滴度。結(jié)果表明，病毒的血凝效價(jià)和TCID50隨著傳代代次逐漸提高，血凝效價(jià)最高可達(dá)512，TCID50最高可達(dá)到108.5/mL，并保持相對(duì)穩(wěn)定（圖1F）。且病毒感染Vero 細(xì)胞后，72 h 內(nèi)不同時(shí)間段均可明顯觀察到不同程度的細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE），直到所有細(xì)胞病變脫落（圖2）。

2.3 細(xì)胞工廠大規(guī)模培養(yǎng)及工作種子批的制備

按照優(yōu)化條件分別對(duì)比吸附和不吸附條件，各接種10 個(gè)細(xì)胞工廠后，收獲病毒液檢測(cè)每一個(gè)細(xì)胞工廠血凝效價(jià)，結(jié)果顯示病毒不吸附接種可以達(dá)到和吸附接種相同的血凝效價(jià)和感染性滴度。證明大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)可以簡(jiǎn)化病毒培養(yǎng)工序而不影響病毒產(chǎn)量。同時(shí)，利用該培養(yǎng)系統(tǒng)成功建立了毒種工作種子批，13 mL/支分裝量，一支可接種100 個(gè)細(xì)胞工廠。結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 不同培養(yǎng)條件下血凝效價(jià)結(jié)果及連續(xù)傳代結(jié)果

3 討論

本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了經(jīng)反向遺傳學(xué)重配獲得的H7N9 型流感毒株在Vero 細(xì)胞中的培養(yǎng)條件。Vero 細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，細(xì)胞致密且狀態(tài)較好，培養(yǎng)流感病毒后血凝效價(jià)最高；而胞齡過(guò)大時(shí)細(xì)胞對(duì)流感病毒不敏感，不能引起病毒的有效感染。病毒接種MOI 主要與毒種和病毒感染性滴度有關(guān)，若TCID50較低，可能MOI 為0.1 以上才能達(dá)到較高的血凝效價(jià)[11-12]，而本實(shí)驗(yàn)毒株在MOI 分別為1、0.1、0.01 和0.001 時(shí)均可達(dá)到相同血凝效價(jià)，只是病變時(shí)間不同。細(xì)胞培養(yǎng)流感病毒時(shí)，只有添加TPCK 胰酶使HA0 裂解為HA1 和HA2 后病毒才具有感染性，有研究表明培養(yǎng)流感病毒H5N1 時(shí)TPCK 胰酶添加量為5 μg/mL[12]，但是本研究證明過(guò)多的TPCK 胰酶會(huì)對(duì)Vero 細(xì)胞造成損傷，導(dǎo)致病毒沒(méi)有足夠的宿主細(xì)胞來(lái)復(fù)制，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到TPCK 胰酶添加量應(yīng)為1.5 μg/mL；TPCK 胰酶隨著病毒復(fù)制會(huì)被不斷消耗，為了滿足病毒新一輪的復(fù)制，培養(yǎng)48 h 后應(yīng)補(bǔ)加TPCK 胰酶至1.0 μg/mL，此時(shí)部分細(xì)胞已病變脫落，補(bǔ)加TPCK 胰酶過(guò)多會(huì)對(duì)細(xì)胞造成更大損傷。連續(xù)傳代15 代后，病毒產(chǎn)量提高，血凝效價(jià)可達(dá)512，病毒感染性滴度TCID50最高可達(dá)108.5/mL，并維持穩(wěn)定。擴(kuò)大至細(xì)胞工廠培養(yǎng)可行并且對(duì)比吸附接種和不吸附接種無(wú)顯著性差異，大大簡(jiǎn)化了細(xì)胞工廠大規(guī)模培養(yǎng)工藝，同時(shí)證明該毒株可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞工廠大規(guī)模培養(yǎng)，且產(chǎn)量穩(wěn)定，此外，利用該培養(yǎng)系統(tǒng)建立了工作種子批毒種。

綜上所述，我們確定了用Vero 細(xì)胞培養(yǎng)H7N9 流感病毒的條件，獲得高產(chǎn)H7N9 流感病毒的Vero 細(xì)胞，并且可以利用該培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)，成功建立了工作種子批。

圖2 高產(chǎn)毒株的細(xì)胞病變效應(yīng)

表1 不同接種方式的血凝效價(jià)和感染性滴度