血管內(nèi)皮細胞初始接種密度在細胞增殖和毒性檢測中的重要性

霍雪萍，張琳萍，趙向絨，劉勤社，王海芳

1.陜西省人民醫(yī)院 中心實驗室，陜西 西安710068；2.西安交通大學 醫(yī)學部中西醫(yī)結(jié)合專業(yè)，陜西 西安710061；3.陜西省中西醫(yī)結(jié)合心血管病防治重點實驗室，陜西中醫(yī)藥大學，陜西 西安712046

WST-1 是一種快速高靈敏度檢測試劑，廣泛用于細胞因子等誘導的細胞增殖變化檢測、抗癌藥物等對細胞有毒試劑誘導的細胞毒性檢測，以及評價藥物對細胞損傷模型的保護作用。WST-1檢測具有線性范圍寬、靈敏度高、溶解性強、操作方便等特點。

已有研究表明，細胞接種密度不合適可能影響細胞增殖及毒性研究結(jié)果。管瑩等[1]利用細胞倍增實驗對CHO 細胞不同接種密度下48 h 內(nèi)的細胞倍增時間進行測定，以2×104～6×104/mL 的初始密度接種細胞，細胞在連續(xù)48 h 的培養(yǎng)時間內(nèi)生長速度較為穩(wěn)定；而以較高密度8×104～10×104/mL 接種細胞，由于生長空間有限，當細胞達到飽和密度后，細胞間的接觸抑制作用導致細胞增殖減慢，細胞停止生長。孫大勇等[2]證明二氫楊梅素對A549 細胞的抗腫瘤作用與給藥時的細胞密度有關(guān)，細胞密度越低，藥物的抗腫瘤作用越強，提示細胞生存能力與細胞密度有關(guān)。李光宗等[3]也提出小鼠細胞因子誘導的殺傷細胞（CIK 細胞）的初始接種密度為8×106時有利于細胞增殖、分化及殺瘤作用的形成，增加細胞密度到12×106時，細胞因過于擁擠導致生長空間相對不足而大量死亡。由此可見，合適的細胞初始接種密度是保證增殖及毒性試驗順利完成的基礎(chǔ)，而接種密度的選擇與所用細胞類型、實驗目的及預計藥物作用都有關(guān)系。本實驗室在研究藥物對血管內(nèi)皮細胞增殖的影響，以及評價藥物對H2O2誘導細胞氧化損傷的保護作用時發(fā)現(xiàn)，細胞增殖與毒性試驗定量檢測所得到的結(jié)果常常存在較大差異，有時甚至出現(xiàn)藥物作用趨勢的根本不同。鑒于此，我們檢測了不同細胞初始接種密度對體外培養(yǎng)的小鼠腦血管內(nèi)皮細胞（brain microvascular endothelial cells，bEND.3）藥物促增殖作用及H2O2誘導氧化損傷的影響，為建立可靠的血管內(nèi)皮細胞增殖及損傷和藥物作用評價實驗體系探索合適的細胞密度條件，為后續(xù)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

bEND.3 小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞（上海拜力生物科技有限公司）；RPMI-1640 細胞培養(yǎng)基和胎牛血清（Clontech 公司）；WST-1 細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒、細胞培養(yǎng)用青霉素/鏈霉素和胰蛋白酶（碧云天生物技術(shù)研究所）；活血膠囊（西安大唐制藥集團有限公司，批號：B20020336）；30%雙氧水（天津市廣成化學試劑有限公司）；96 孔細胞培養(yǎng)板（Thermo Fisher 公司）；CO2細胞培養(yǎng)箱（Napco 公司）；倒置光學顯微鏡（Olympus 公司）；Model 680 型酶標儀（Bio-Rad 公司）。

1.2 活血膠囊（HXJN）水溶液配制

稱取0.9 g 活血膠囊顆粒，研細，加入6 mL無血清RPMI-1640 培養(yǎng)基，攪拌使之充分溶解，2000 r/min 離心5 min，吸取溶液上層，0.22 μm微孔濾膜過濾分裝，-80℃冰箱保存。

1.3 細胞培養(yǎng)

bEND.3 細胞貼壁生長于含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640 培養(yǎng)液中，在37℃、5% CO2及飽和濕度的恒溫密閉細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，0.025%胰蛋白酶消化傳代，每2 d 傳代1 次，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.4 倒置顯微鏡觀察

取對數(shù)生長期的bEND.3 細胞，胰酶消化，吹打均勻，細胞計數(shù)后分別以細胞密度為1500、3000、6000、10 000/孔接種于96 孔細胞培養(yǎng)板，每孔加入200 μL 完全培養(yǎng)液，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，藥物處理前觀察細胞形態(tài)并拍照。

1.5 細胞增殖實驗

采用WST-1 細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒檢測不同細胞接種密度、不同濃度活血膠囊溶液對bEND.3 細胞增殖能力的影響。簡述之，取對數(shù)生長期細胞，分別以1500、3000、6000/孔的細胞密度接種于96 孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)過夜。次晨按照空白對照組和藥物組處理，藥物組加入HXJN溶液，使其終濃度分別為300 和750 μg/mL，每個濃度設(shè)6 個復孔，每孔200 μL 溶液，分別作用細胞24、48 和72 h，之后每孔換為事先配好的WST-1 溶液100 μL，在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1～2 h，充分混勻待檢測體系，測定D450nm值。

1.6 氧化應(yīng)激損傷模型

取對數(shù)生長期細胞，分別以6000 或10 000/孔的密度接種于96 孔細胞培養(yǎng)板，每組6 個復孔，培養(yǎng)過夜。次日按空白對照組與藥物組處理，藥物組加入90 μL H2O2溶液，使終濃度分別為100、200 和300 μmol/L，作用2～2.5 h，之后每孔加入10 μL WST-1 溶液，在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1 h，充分混勻待檢測體系，測定D450nm值。

1.7 統(tǒng)計學方法

從Model 680 型酶標儀中導出D450nm值，用Ex?cel 軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)采用x±s表示，單因素方差分析計算P值，P＜0.05 為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 不同接種密度對細胞形態(tài)的影響

倒置顯微鏡下觀察內(nèi)皮細胞形態(tài)（圖1）。接種密度為1500/孔時，細胞呈多角形或不規(guī)則形，散在生長，細胞間空隙較大，互相之間基本無接觸；接種密度為3000/孔時，部分細胞形態(tài)較為規(guī)則呈梭形，細胞之間開始發(fā)生連接；接種密度為6000 和10 000/孔時，隨細胞密度的增高，細胞形態(tài)更加規(guī)則，大多呈梭形，密集處呈明顯的鋪路石狀生長，細胞之間相互連接、密集成片生長。

2.2 不同接種密度對細胞增殖的影響

據(jù)統(tǒng)計96 孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)細胞長滿時約為1×105個。按照細胞在接種后24 h 進入對數(shù)生長期計算，細胞的初始接種密度最大為6000/孔，培養(yǎng)72 h 可長滿。如圖2 所示，細胞初始接種量為1500/孔時，與空白組相比，HXJN 組在24 和48 h檢測D450nm值無升高，且隨藥物濃度增加和時間延長，對細胞增殖有一定的抑制作用；然而在72 h時檢測，藥物顯示出一定的促增殖作用。細胞初始接種量為3000/孔時，在24 h 檢測D450nm值升高不明顯，而48 和72 h 時HXJN 組顯示顯著的促增殖作用，但不同劑量組之間作用無顯著差異。細胞初始接種量為6000/孔，在24 h 檢測時藥物作用不明顯，48、72 h 檢測發(fā)現(xiàn)藥物促增殖作用明顯升高，且顯示出一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

2.3 不同細胞接種密度對H2O2誘導細胞氧化損傷的影響

如圖3，隨細胞接種量的不同，H2O2對細胞產(chǎn)生氧化損傷的程度存在明顯差異。細胞初始接種量為6000/孔時，H2O2濃度為100 μmol/L 可引起顯著的細胞損傷，細胞存活率為50%左右；H2O2濃度為200 和300 μmol/L 時，細胞受損嚴重，細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，幾乎全部呈脫落、漂浮和破碎狀態(tài)。細胞初始接種量為10 000/孔時，100 μmol/L H2O2濃度下細胞仍貼壁生長良好；H2O2濃度為200 μmol/L 時，細胞形態(tài)發(fā)生變化，變圓、皺縮、破碎和脫落漂浮現(xiàn)象明顯，細胞存活率為50%左右；300 μmol/L 時，培養(yǎng)液中死亡細胞數(shù)目增多，大多數(shù)細胞呈脫落、漂浮和破碎狀態(tài)，存活率僅為25%左右。

圖1 不同接種密度下的細胞形態(tài)（×100）

圖2 不同初始接種密度對HXJN促細胞增殖作用的影響

圖3 不同初始接種密度對H2O2誘導細胞氧化損傷的影響

3 討論

我們用WST-1 試劑檢測中藥復方HXJN 對bEND.3 血管內(nèi)皮細胞的72 h 促增殖作用，結(jié)果表明藥物對bEND.3 細胞具有顯著的促增殖作用，而細胞初始接種密度是影響實驗結(jié)果的重要因素。細胞接種密度為1500/孔時，藥物的促增殖作用不明顯；接種密度為3000 和6000/孔時，可見顯著的藥物促增殖作用，并可觀察到劑量-效應(yīng)關(guān)系。適宜的初始接種密度是觀察細胞增殖作用的先決條件，密度過高或過低均不利于觀察藥物的促增殖作用。

在構(gòu)建H2O2誘導bEND.3 細胞氧化損傷模型時，選定合適的初始接種密度同樣重要。我們的結(jié)果顯示，初始接種量為6000/孔，100 μmol/L H2O2作用2 h，細胞存活率約為50%；而當初始接種量為10 000/孔時，200 μmol/L H2O2作用下細胞的存活率約為50%。這提示由于細胞初始接種密度不同，導致同一濃度H2O2對血管內(nèi)皮細胞的損傷程度顯著不同。因此，在進行氧化損傷和藥物篩選、作用機制研究時，須通過預實驗選定合適的細胞接種密度并在整個研究過程中保持一致，才能確保實驗結(jié)果的準確性和穩(wěn)定性。

細胞接種密度較大時，細胞間連接增加，可能通過某種機制影響細胞之間的信號傳遞，影響細胞的增殖和抗氧化損傷能力。血管內(nèi)皮細胞間連接主要有4 種類型，即縫隙連接、緊密連接、黏附連接和黏合體，而黏附連接是主要的連接，緊密連接和縫隙連接穿插于黏附連接之間，但細胞間小分子通訊的通道主要還是縫隙連接[4]。陳志從等[5]通過細胞分子水平驗證丹參酮ⅡA 參與增強上皮細胞縫隙連接通訊的功能，有利于提高藥物的增殖能力及抗氧化損傷能力。除此之外，細胞密度對于基因轉(zhuǎn)染效率[6]、成骨細胞分化[7]和細胞衰老[8]等許多其他類型的實驗研究也有顯著影響，例如應(yīng)激性細胞衰老必須在非長滿的狀態(tài)下進行研究，否則會使背景信號大大增強。因此，細胞接種密度不僅是實驗研究中一個值得注意的重要問題，也是細胞間信號傳遞研究中一個令人感興趣的課題。