酶法提取稷山板棗多糖工藝條件優(yōu)化*

楊萍芳　李　楠

（運(yùn)城學(xué)院生命科學(xué)系，山西運(yùn)城　044000）

板棗 （Jujube Polysaccharides）是鼠李科（Rhamnaceae）棗屬植物棗樹(shù)（Ziziphus Jujuba Mil）的果實(shí)，主要產(chǎn)于稷山縣的稷峰、化峪等丘陵地區(qū)。稷山板棗為山西十大名棗之首，果實(shí)皮薄，肉厚甘甜，核小，因果形側(cè)面較扁，故稱(chēng)稷山板棗。有研究表明，板棗多糖是板棗中重要的天然活性成分，具有明顯的抗補(bǔ)體活性和促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增值功能，對(duì)抗氧化，抗衰老，提高機(jī)體免疫力具有重要作用。大棗多糖的抗氧化性研究結(jié)果表明，大棗多糖樣品液具有體外清除超氧陰離子自由基和羥基自由基的作用，在油脂的抗氧化性方面也有良好成效。大棗營(yíng)養(yǎng)豐富，可生食，可入藥。顆粒大、色澤好的優(yōu)質(zhì)大棗，深受消費(fèi)者歡迎，在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)上暢銷(xiāo)不衰。對(duì)于顆粒小，色澤欠佳及有傷害的劣質(zhì)、殘次大棗進(jìn)行銷(xiāo)售比較困難。對(duì)這類(lèi)等外品紅棗進(jìn)行深加工提取藥用成分，開(kāi)發(fā)高附加值的保健品及藥品，具有日益明顯的優(yōu)勢(shì)和廣闊的前景。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

稷山板棗，購(gòu)自稷峰鎮(zhèn)姚村，經(jīng)自然干燥、初步挑選出優(yōu)等品后留取剩余的等外品作為試驗(yàn)材料。經(jīng)干燥箱烘干、粉碎、過(guò)篩，得板棗粉。

101A-1E電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；微型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)；FA1604電子天平；HH4恒溫水浴鍋；722N可見(jiàn)分光光度計(jì)；TDL-40B離心機(jī)等。

1.2　試驗(yàn)方法

1.2.1　大棗多糖的提取工藝

稱(chēng)取干燥的板棗粉20 g，按料液比加入調(diào)好pH的去離子水溶液，添加定量的纖維素酶，于恒溫水浴加熱一段時(shí)間，離心取上清液。在殘?jiān)邪戳弦罕燃尤肴ルx子水，放入90℃的水浴鍋中加熱浸提90 min，離心后合并2次上層清液，濃縮至體積大約為初始體積的1/3時(shí)，加入4倍的無(wú)水乙醇，低溫下靜置3 h后離心，沉淀物在真空下干燥24 h，脫蛋白質(zhì)后進(jìn)行離心，取上清液濃縮，添加無(wú)水乙醇進(jìn)行二次沉淀，靜置后離心，沉淀物依次用丙酮、乙醚反復(fù)洗滌、離心，最后將沉淀真空干燥，稱(chēng)量，得到粗多糖。

1.2.2　大棗多糖含量的測(cè)定方法

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)樣品，采用苯酚硫酸法測(cè)定大棗多糖的含量。

1.2.3　多糖得率的計(jì)算公式

1.2.4　單因素試驗(yàn)

主要研究不同料液比（A）、提取液pH（B）、纖維素酶添加量（C）、酶解溫度（D）、酶解時(shí)間（E）對(duì)稷山板棗多糖得率的影響。試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1　單因素試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.2.5　提取工藝參數(shù)優(yōu)化

以料液比、酶解溫度、提取液pH為自變量，多糖得率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平的中心組合試驗(yàn)進(jìn)行響應(yīng)面分析，研究各因素與多糖得率的關(guān)系。

2　結(jié)果與分析

2.1　單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1　料液比對(duì)大棗多糖得率的影響

料液比對(duì)大棗多糖得率的影響見(jiàn)圖1。

圖1　料液比對(duì)大棗多糖得率的影響

由圖1可知，當(dāng)料液比為1∶20～1∶30時(shí)，隨著料液比的增大，多糖得率出現(xiàn)較大上升趨勢(shì)。當(dāng)料液比超過(guò)1∶30時(shí)，多糖得率上升幅度較小，從生產(chǎn)成本方面考慮，確定料液比為1∶30。

2.1.2　提取液pH對(duì)多糖得率的影響

提取液pH對(duì)多糖得率的影響見(jiàn)圖2。

圖2　提取液pH對(duì)多糖得率的影響

由圖2可以看出，提取液PH在4～5范圍時(shí)，隨著pH的增大，多糖得率增大。當(dāng)pH值大于5.0時(shí)，多糖得率開(kāi)始下降，這可能是因?yàn)槊笇?duì)pH的變化敏感度高，當(dāng)酶反應(yīng)的pH偏離了某個(gè)適宜范圍，活性就會(huì)降低。因此，選擇提取液的pH為5.0。

2.1.3　纖維素酶添加量對(duì)多糖得率的影響

纖維素酶添加量對(duì)多糖得率的影響見(jiàn)圖3。

圖3　酶添加量對(duì)多糖得率的影響

由圖3可知，多糖得率在酶添加量少于0.05%時(shí)，隨著酶添加量的增大而增大。說(shuō)明隨著酶量的增加，酶與底物的接觸機(jī)會(huì)增大，同一時(shí)間內(nèi)被酶水解的底物分子數(shù)增加。當(dāng)酶添加量大于0.05%時(shí)多糖得率降低，其原因可能是纖維素酶的添加量達(dá)到一定程度時(shí)，纖維降解物大量存在，使多糖的溶解變得困難，導(dǎo)致多糖含量減少。因此，選擇纖維素酶的適宜添加量為0.05%。

2.1.4　酶解溫度對(duì)多糖得率的影響

酶解溫度對(duì)多糖得率的影響見(jiàn)圖4。

圖4　酶解溫度對(duì)多糖得率的影響

由圖4可以看出，隨著酶解溫度的的增加，多糖得率升高，在50℃時(shí)達(dá)到最大。多糖得率在50℃后開(kāi)始下降，可能是由于溫度升高導(dǎo)致酶活性降低，酶促作用受到抑制。因此，選擇適量的酶解溫度為50℃。

2.1.5　酶解時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

酶解時(shí)間對(duì)多糖得率的影響見(jiàn)圖5。

圖5　酶解時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

由圖5可以看出，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖得率逐漸上升。酶解時(shí)間為80 min時(shí)，多糖得率達(dá)到最大值，酶解80 min后多糖得率開(kāi)始下降，其原因可能是隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酶的穩(wěn)定性受到影響，多糖也可能降解。因此，選擇適宜的酶解時(shí)間為80 min。

2.2　最佳工藝條件

2.2.1　試驗(yàn)因素和水平

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取料液比（X1）、酶解溫度（X2）和提取液pH值（X3）進(jìn)行中心組合試驗(yàn)，以多糖得率（Y）為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面分析。響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表2。

表2　響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平編碼

2.2.2　二次響應(yīng)面回歸模型的建立與分析

大棗多糖提取工藝的優(yōu)化設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。

表3　響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果

表4　響應(yīng)面方差分析結(jié)果

從表4的分析結(jié)果可知，整體模型的P小于0.05，表明該二次方程模型顯著。方程的失擬項(xiàng)小，表明該方程對(duì)試驗(yàn)的擬合情況好，試驗(yàn)誤差小。因此，可用該回歸方程代替試驗(yàn)的真實(shí)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。3個(gè)因素對(duì)結(jié)果的影響排序?yàn)槊附鉁囟龋玖弦罕龋咎崛∫簆H。

對(duì)表3所得數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，各因素經(jīng)回歸擬合后，解得二次回歸方程模型：Y=3.484＋1.25 X1＋1.66 X2＋0.74 X3－1.37 X1X2＋0.82 X1X2＋2.00

利用軟件Design-Expert分析，給出了最優(yōu)提取工藝條件：料液比為1∶30、酶解溫度為55℃、提取液pH為5.19，多糖得率為3.69%。為了驗(yàn)證模型方程的適用性，同時(shí)考慮到操作的方便性，將上述條件調(diào)整為料液比1∶30、酶解溫度為55℃、提取液pH為5.2，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證，最后得到多糖得率為3.61%，接近預(yù)測(cè)值，說(shuō)明試驗(yàn)結(jié)果與模型擬合良好，通過(guò)此模型優(yōu)化能夠有效提高板棗多糖的得率。

3　結(jié)論

采用酶法提取殘次、等外品的稷山板棗多糖，單因素及響應(yīng)面分析結(jié)果表明，最佳提取工藝條件為：料液比為1∶30、酶解溫度為55℃、提取液pH為5.2，酶添加量0.05%、酶解時(shí)間80 min時(shí)，提取效果好，大棗多糖得率達(dá)到3.61%。

［1］郭艷茹，溫玉潔.稷山板棗水溶性多糖提取工藝研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（35）：20 464-20 468.

［2］李小平，陳錦屏，閻雅嵐.紅棗多糖提取方法研究進(jìn)展［J］.江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2007，19（10）：102-104.

［3］張淮杰.糖復(fù)合物生化研究技術(shù)［M］.杭州：浙江大學(xué)出版社，1998.