姜黃素對人類子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜組織中基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1及間質(zhì)細(xì)胞增殖和侵襲的影響

胡淑寒，曹保利，劉　霞，張　敏，譚桂蘭

(1. 天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；2. 天津市南開醫(yī)院，天津 300100；3. 天津市婦女兒童保健中心，天津 300152)

子宮內(nèi)膜異位癥(EMS)是子宮內(nèi)膜腺體和間質(zhì)出現(xiàn)在子宮腔以外的部位而引起的進(jìn)行性痛經(jīng)、慢性盆腔疼痛、性交痛、月經(jīng)失調(diào)、不孕等臨床表現(xiàn)的疾病。流行病學(xué)調(diào)查顯示，正常情況下有80%～90%的育齡婦女存在經(jīng)血逆流現(xiàn)象，而僅有6%～8%罹患EMS[1]。大量研究表明EMS雖然是良性疾病，但其生物學(xué)表現(xiàn)與惡性腫瘤高度相似，即異位內(nèi)膜的黏附、侵襲、血管生成“三步曲”(3A模式)及細(xì)胞的無限增殖和凋亡數(shù)量減少[2]，因此抗黏附、抗侵襲、抗血管生成已成為EMS新的治療策略。雌激素、局部環(huán)境的多種酶和細(xì)胞因子等都參與這一病理過程。西醫(yī)除手術(shù)治療外，西藥治療不良反應(yīng)較多，復(fù)發(fā)率較高，給患者帶來不便。臨床實(shí)踐表明中藥在治療EMS方面療效確切，不良反應(yīng)少。姜黃素是從姜科植物姜黃、郁金的塊莖中提取的一種植物多酚，姜黃提取物中的黃色酚類物質(zhì)分別是姜黃素、雙脫甲氧基姜黃素(BDMC)、脫甲氧基姜黃素(DMC)的混合體，姜黃素是姜黃提取物中最重要的活性成分，其微溶于水，易溶于DMSO、乙醇、丙酮、氯仿等有機(jī)溶劑，見光易發(fā)生降解，具有抗炎、抗氧化、抑制血管新生及抗腫瘤活性作用[3]。近年來大量實(shí)驗(yàn)表明，姜黃素具有降低雌二醇的表達(dá)水平和抑制異位內(nèi)膜的增殖與血管生成作用[4-8]，其作為一種藥劑治療EMS 具有很好的優(yōu)勢和應(yīng)用前景[9-11]。本實(shí)驗(yàn)期望通過測定不同濃度的姜黃素對人類EMS異位內(nèi)膜細(xì)胞中基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1) mRNA表達(dá)和間質(zhì)細(xì)胞增殖、侵襲的影響，希望找到一種治療EMS的新方法。

1　實(shí)驗(yàn)資料

1.1實(shí)驗(yàn)標(biāo)本本實(shí)驗(yàn)所用在位子宮內(nèi)膜組織均取自2015年10月—2017年1月天津市南開醫(yī)院婦產(chǎn)科因腺肌癥合并EMS接受子宮切除術(shù)的30例患者，患者均無內(nèi)科合并癥，術(shù)前3個(gè)月內(nèi)未服用激素類藥物。所有標(biāo)本獲得均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)并取得患者知情同意。

1.2實(shí)驗(yàn)藥品及試劑姜黃素(C1386-10G，Sigma公司提供)；胎牛血清，DMEM培養(yǎng)液，青霉素，鏈霉素，胰酶粉，膠原蛋白酶IV粉，0.25%胰酶細(xì)胞消化液，PBS磷酸鹽緩沖液(上海拜力生物科技有限公司提供)；伊紅、蘇木素染色劑(南開醫(yī)院提供)；細(xì)胞RNA 提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑(天津生化科技北京有限公司提供)；噻唑藍(lán)(MTT)，二甲基亞砜(DMSO，索來寶生物技術(shù)有限公司提供)。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器實(shí)用單人凈化操作臺(型號：MSC-Advantage 1.2)；恒溫離心機(jī)(型號：CRH-100)；高速冷凍離心機(jī)(型號：KUBTOA 3500)；RT-PCR儀(型號：IQ5)；Thermo微量定量移液器(型號：WDYIII-5)；37 ℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(型號：DRP-9002)；細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板；血細(xì)胞計(jì)數(shù)板(型號：1103)；酶聯(lián)免疫檢測儀(型號：HBS-1096B)；0.22 μm無菌濾器(型號：SLGP033RB0)；Transwell小室(型號：COSTAR-3413)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1原代培養(yǎng)將子宮內(nèi)膜標(biāo)本用無菌鹽水沖洗后，置入10 mL無菌冰冷PBS液(含有青霉素100 IU/mL、鏈霉素100 μg/mL)中,立即送實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)采用的是間質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)方法。 剪碎組織，700 r/min離心5 min，共2次，用于洗滌組織。分別加0.25%胰酶2 mL及0.1%膠原酶1 mL,放置于搖床孵育15 min,消化后細(xì)胞懸液含單個(gè)間質(zhì)細(xì)胞和葡萄串狀上皮細(xì)胞。消化完畢后加入含有15%胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)液5 mL終止上清液的消化,用槍頭反復(fù)輕輕吹打，80目過濾分離未消化組織，此時(shí)為腺上皮和間質(zhì)細(xì)胞的混合培養(yǎng)。400目分離，1 000 r/min離心10 min，共2次，此時(shí)得到液體大部分為間質(zhì)細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞密度為l×107mL-1,接種置于37 ℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每2～3 d換液1次。每天用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長狀況,HE染色、免疫組織化學(xué)對子宮內(nèi)膜細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

1.4.2傳代培養(yǎng)倒置顯微鏡下觀察,待原代細(xì)胞長滿瓶壁約90%時(shí)進(jìn)行傳代。棄去培養(yǎng)液,加入0.25%胰蛋白酶消化,待一半細(xì)胞收縮變圓后終止消化，再倒入50 mL離心管中1 000 r/min離心5 min，加入培養(yǎng)液，置于37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；隔2 d換液1次，并在顯微鏡下觀察； 細(xì)胞傳代2次后經(jīng)細(xì)胞化學(xué)染色方法進(jìn)行鑒定、觀察細(xì)胞情況、拍攝照片。

1.4.3分組及給藥傳代培養(yǎng)成功后，接種于24孔板進(jìn)行PCR、transwell實(shí)驗(yàn)，接種于96孔板進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為對照組(姜黃素濃度0 μmol/L)、姜黃素高劑量組(姜黃素濃度50 μmol/L)、姜黃素中劑量組(姜黃素濃度30 μmol/L)、姜黃素低劑量組(姜黃素濃度10 μmol/L)。以上用姜黃素根據(jù)文獻(xiàn)[12]中方法用DMSO助溶，加入DMEM配置成100 μmol/L的儲存液，0.22 μm微孔濾器過濾除菌分裝，避光-20 ℃保存，2周內(nèi)有效，使用時(shí)用含有2%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液稀釋至所需濃度(DMSO≤0.1%)

1.4.4SDF-1mRNA表達(dá)檢測將0～50 μmol/L處理24 h的間質(zhì)細(xì)胞消化離心，收集細(xì)胞，使用TRIzol(Invitrogene,美國)提取總RNA，按說明書操作,測定RNA的濃度和純度符合要求后用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和RNA提取試劑購自天津生化科技北京有限公司)，在經(jīng)RNase Free處理過的EP管中建立反應(yīng)體系：2.5×RealMasterMix 9 μL,正向引物0.5 μL,反向引物0.5 μL，DNA模板2 μL，超純水8 μL,最終反應(yīng)體系為20 μL。采用 RT-PCR法檢測各組內(nèi)膜組織中SDF-1 mRNA的表達(dá)；引物設(shè)計(jì)：SDF-1上游為5’-ATGCCCCTGCCGATTCTTTG-3’，下游為5’-TTGTTGCTTTTCAGCCTTGC-3’。反應(yīng)條件：95 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共35個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸8 min結(jié)束反應(yīng)。

1.4.5細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)取處于對數(shù)生長期、狀態(tài)良好的間質(zhì)細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104mL-1，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔體積200 μL,37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h細(xì)胞完全貼壁后，將培養(yǎng)液更換為含不同濃度姜黃素的培養(yǎng)液，姜黃素質(zhì)量濃度依次為50，30，10，0 μmol/L，置于37 ℃，5% CO2條件下繼續(xù)孵育培養(yǎng) 24，48，72 h。每個(gè)處理組設(shè)6個(gè)復(fù)孔,每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μL,繼續(xù)孵育4 h,終止培養(yǎng),吸棄上清液,每孔加入150 μL DMSO,振蕩使結(jié)晶物充分溶解?？瞻讓φ战M只加培養(yǎng)基、MTT和DMSO的空白對照孔調(diào)零,于570 nm波長處在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔吸光值。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。計(jì)算公式: 細(xì)胞抑制率(%)=(1-OD藥物)/OD對照組×100%。

1.4.6細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn)將人工基底膜(Matrigel)在4 ℃解凍,按1∶8比例加入無血清DMEM稀釋,以每孔60 μ L包被24孔Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板(COSTAR-3413)的上室,于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中4 h成膠。用無血清DMEM饑餓處理細(xì)胞24 h，用含15%胎牛血清的DMEM配成單細(xì)胞懸液,取200 μL細(xì)胞懸液以1×105個(gè)/孔接種到上室,再分別加入姜黃素0 μmol/L、10 μmol/L、30 μmol/L、50 μmol/L,下室加入600 μL含15%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基,并作空白對照。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔,4組，共24孔，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)48 h,取出Transwell小室，PBS沖洗2遍,用棉球擦去上室表面細(xì)胞,下室面用95%乙醇固定10 min,常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)侵入下室膜表面的細(xì)胞。隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野下(×400)的細(xì)胞,取平均值。侵襲抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組侵襲細(xì)胞數(shù)/對照組侵襲細(xì)胞數(shù))×100%。

2　結(jié)　　果

2.1各組間質(zhì)細(xì)胞中SDF-1mRNA表達(dá)水平作用48 h后，對照組SDF-1mRNA表達(dá)水平為3.013±0.518，姜黃素低劑量組為2.831±0.241，姜黃素中劑量組為1.957±0.241，姜黃素高劑量組為0.965±0.198， 4組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=45.664，P<0.05)，姜黃素各劑量組異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中SDF-1 mRNA 表達(dá)量均有不同程度的下降(P均<0.05)，且隨藥物濃度的增加下降更明顯(P<0.05)。

2.2各組間質(zhì)細(xì)胞增殖與凋亡情況姜黃素作用間質(zhì)細(xì)胞24 h、48 h、72 h后的OD值見圖1。各濃度的姜黃素對細(xì)胞分別作用24 h、48 h、72 h后細(xì)胞抑制率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=25.834，P<0.05),同時(shí)點(diǎn)姜黃素高、中、低劑量組細(xì)胞抑制率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=614.698，P<0.05),姜黃素對異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的生長增殖抑制呈明顯的劑量和時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。見表1。

圖1　姜黃素作用間質(zhì)細(xì)胞24 h、48 h、72 h后的OD值

組別24h48h72h姜黃素低劑量組6．432±2．34312．572±2．65815．327±2．251姜黃素中劑量組32．526±3．00337．262±2．08643．977±1．737姜黃素高劑量組45．768±6．60755．218±1．99160．643±1．235

2.3各組間質(zhì)細(xì)胞的侵襲抑制率作用48 h后，侵襲抑制率組間整體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=122.674，P=0.000)，隨著姜黃素濃度的升高，間質(zhì)細(xì)胞的侵襲數(shù)量減少，濃度越高，侵襲率越低。見表2。

表2　各組間質(zhì)細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)及侵襲抑制率比較

3　討　　論

原代細(xì)胞培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)顯示，原代腺上皮細(xì)胞在培養(yǎng)過程中1～2代仍可保持其原來特性，從第3代以后的細(xì)胞形態(tài)開始發(fā)生變化，不易存活。在體外培養(yǎng)模型中，分離培養(yǎng)的腺上皮細(xì)胞由于缺乏與間質(zhì)細(xì)胞的物質(zhì)交換及信號交流，腺上皮細(xì)胞得不到必需的營養(yǎng)物質(zhì)和信號調(diào)控，導(dǎo)致生長緩慢甚至死亡。因此，可以推測在體外的子宮內(nèi)膜細(xì)胞異位種植過程中，相對于腺上皮細(xì)胞，間質(zhì)細(xì)胞對子宮內(nèi)膜的異位種植起著決定性的作用。有國外文獻(xiàn)報(bào)道， CXCR4基部基因水平在上皮細(xì)胞上高于間質(zhì)細(xì)胞；相反，CXCL12(SDF-1)在間質(zhì)細(xì)胞上高于上皮細(xì)胞[13]。所以本研究用SDF-1作為EMS間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志。

SDF-1屬CXC類趨化因子，是CXCR4唯一配體，SDF-1與其受體CXCR4結(jié)合后，可通過促進(jìn)CXCR4二聚體形成、空間構(gòu)象改變、內(nèi)化以及激活與其相耦聯(lián)的G蛋白等機(jī)制而激活多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[14]。SDF-1/CXCR4與EMS的關(guān)聯(lián)很可能是通過SDF-1/CXCR4→PI3→MAPK→NF-κB信號傳導(dǎo)通路，以及IACM-1、CD34+、MMP2、MMP9、VEGF等因子的作用來形成黏附、侵襲和血管生成“三步曲”及細(xì)胞的無限增殖。張敏等[15]研究報(bào)道大鼠異位內(nèi)膜組織中 SDF-1、CXCR4m RNA 的表達(dá)明顯高于大鼠在位內(nèi)膜組織及正常在位內(nèi)膜組織，說明SDF-1/CXCR4在大鼠EMS中起到一定作用。熊苗等[16]研究發(fā)現(xiàn)，EMS患者的在位內(nèi)膜、病灶周圍組織及異位病灶組織中均有SDF-1的表達(dá)，且異位病灶組織及在位內(nèi)膜中的表達(dá)明顯高于正常內(nèi)膜組織，說明SDF-1/CXCR4參與了EMS的形成和發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)通過RT-PCR技術(shù)測SDF-1mRNA表達(dá)情況，結(jié)果顯示姜黃素各劑量組異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中SDF-1 mRNA表達(dá)量均有不同程度的下降，且隨藥物濃度的增加下降更明顯，說明SDF-1/CXCR4軸可能參與了EMS的發(fā)展過程，姜黃素可能通過某種通路抑制EMS的形成。

EMS是一種子宮內(nèi)膜活性增高所致的內(nèi)膜異常性基因疾病，與內(nèi)膜細(xì)胞的異地黏附和侵襲性增強(qiáng)有關(guān)[17]。相關(guān)研究表明，通過調(diào)控NF-κB，下調(diào)PI3K、MAPK通路，可能會抑制MMP-2、MMP-9表達(dá)和活性，從而抑制子宮內(nèi)膜中相關(guān)細(xì)胞的侵襲和遷移[18]。蘇曉華等[19]研究發(fā)現(xiàn)EMS患者的子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)于非EMS患者，且在EMS發(fā)病中異位病灶子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力更強(qiáng)。Transwell小室是目前應(yīng)用較廣泛的細(xì)胞侵襲力研究模型。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)姜黃素作用后異位內(nèi)膜細(xì)胞侵襲力下降，且細(xì)胞侵襲力隨著姜黃素濃度的增加而減弱，進(jìn)一步說明侵襲是EMS形成的重要一步，姜黃素有抑制EMS侵襲性的作用。姜黃素可能通過降低細(xì)胞SDF-1mRNA的表達(dá)，抑制上游核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)活性而下調(diào)MMP的表達(dá)，進(jìn)而抑制人異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

研究表明,EMS組織區(qū)域內(nèi)細(xì)胞的凋亡功能會造成不同程度的損害[20]，所以通過凋亡可以有效清除子宮內(nèi)膜細(xì)胞，達(dá)到維持月經(jīng)周期內(nèi)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用[21]。1976年Hopwood和Levison首次提出正常的子宮內(nèi)膜有細(xì)胞凋亡的表達(dá)后，近年來越來越多的研究證明，凋亡通過清除異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞并維持月經(jīng)周期中細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定中起著重要作用[22]。Harada等[23]將EMS患者的在位和異位子宮內(nèi)膜組織與正常子宮內(nèi)膜組織進(jìn)行凋亡敏感性比較，發(fā)現(xiàn)無論是在位還是異位內(nèi)膜組織的凋亡性均降低，異位內(nèi)膜組織為甚。MTT法是一種檢測細(xì)胞存活和生長的常用方法，其吸光度OD值的大小可反映活細(xì)胞數(shù)目的增生或抑制程度[24]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，姜黃素對異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的生長增殖抑制呈明顯的劑量和時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。

姜黃素作為近年來具有潛在的抗癌作用的新藥被美國國立腫瘤所(NCI)將其列為第3代防癌藥物。EMS具有類癌生物學(xué)行為，異位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞凋亡、侵襲特性的改變可能是EMS發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制，所以姜黃素有望成為治療EMS的一種理想中藥，其抑制增殖和侵襲的能力可能是通過SDF-1/CXCR4生物學(xué)軸，但這只是一種猜想，還需進(jìn)一步證明。相信經(jīng)過不斷完善研究，能夠進(jìn)一步揭示姜黃素作用于異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞的具體作用機(jī)制，將姜黃素應(yīng)用于EMS的臨床治療指日可待。

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