太行山野生艾蒿揮發(fā)油抗菌活性研究

朱紅霞 李鵬 朱英慧 胡林峰 陳錫嶺

摘要：為研究太行山野生艾蒿（Artemisia argyi）揮發(fā)油的抗菌活性，采用水蒸氣蒸餾法提取獲得艾蒿揮發(fā)油，并以生長(zhǎng)速率法和抑菌圈法分別測(cè)定其對(duì)5種植物病原真菌和4種病原細(xì)菌的抑菌活性。結(jié)果表明，艾蒿揮發(fā)油對(duì)水稻紋枯病菌（Thanatephorus cucumeris）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）和辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）等3種供試植物病原真菌的EC50均低于0.100 mg/mL；在0.050 mg/mL濃度下，對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抑菌圈直徑大于30 mm，對(duì)枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和炭疽桿菌（B. anthraces）表現(xiàn)出中等強(qiáng)度抗菌活性，抑菌圈直徑介于20～30 mm。

關(guān)鍵詞：艾蒿（Artemisia argyi）；揮發(fā)油；病原真菌；細(xì)菌；抗菌活性

中圖分類號(hào)：O629 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2018）04-0060-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.04.015

Study on the Antimicrobial Activities of Essential Oil Extracted from Wild

Artemisia argyi in Taihang Mountains

ZHU Hong-xia， LI Peng， ZHU Ying-hui， HU Lin-feng， CHEN Xi-ling

（Henan Institute of Science and Technology， Xinxiang 453003，Henan，China）

Abstract： Essential oil from wild Artemisia argyi in Taihang Mountains was extracted by steam distillation. Growth rate method and oxford cup method were applied to test the antimicrobial activities against five plant pathogenic fungic and four bacteria. The results showed that the EC50 of essential oil were lower than 0.100 mg/mL against Thanatephorus cucumeris，Botrytis cinerea and Phytophthora capsici. And the diameter of inhibition zone was more than 30 mm against Staphylococcus aureus under the concentration of 0.050 mg/mL. Moderate inhibition activities were determined against Bacillus subtilis and B. anthraces，and the diameter of inhibition zone located among 20～30 mm under the same concentration.

Key words： Artemisia argyi； essential oil； plant pathogenic fungic； bacteria； antimicrobial activity

植物是生物活性化合物的巨大天然寶庫(kù)，其產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物超過40萬種，這些物質(zhì)中很多具有抑菌作用，是發(fā)現(xiàn)新殺菌劑和殺菌化合物的較好開發(fā)資源，對(duì)農(nóng)藥的開發(fā)和利用有重要的意義。植物源農(nóng)藥具有低毒、低殘留、與環(huán)境和諧、符合現(xiàn)代環(huán)保和人類健康需求的優(yōu)點(diǎn)，越來越引起世界各國(guó)高度重視，近幾年掀起了一個(gè)研究開發(fā)植物源農(nóng)藥的高潮。在仿生殺菌劑研究中，植物被公認(rèn)為是篩選先導(dǎo)化合物的最佳資源，因此開發(fā)利用植物資源用于有害生物防治的前景十分廣闊。

長(zhǎng)期的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)和藥理研究表明，艾蒿（Artemisia argyi）具有很好的防霉、抑制病原細(xì)菌的能力，對(duì)部分植物病蟲害也有一定的作用。艾蒿揮發(fā)油的抗菌活性一直以來得到科研人員的關(guān)注[1]。已有研究表明，艾蒿揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）、黑曲霉（Aspergillus nige）等微生物具有較強(qiáng)的抑制作用[2-4]。艾蒿揮發(fā)油以及丙酮提取物對(duì)植物病原真菌也表現(xiàn)出一定的生物活性，對(duì)棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）、水稻紋枯病菌（Thanatephorus cucumeris）和蘋果腐爛病菌（Valsa mali）均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用[3，5]。艾蒿提取物還能夠影響昆蟲的正常生理活動(dòng)，干擾昆蟲產(chǎn)卵及發(fā)育[6，7]。

河南太行山區(qū)地理位置特殊，孕育了豐富的植物資源，其出產(chǎn)的艾蒿及其生物活性未見報(bào)道。為了有效地利用艾蒿這一植物資源，充分發(fā)掘艾蒿的功用，為艾蒿抗菌產(chǎn)品的開發(fā)提供新的發(fā)展方向，本研究對(duì)其揮發(fā)油進(jìn)行提取，并分析揮發(fā)油成分，測(cè)試揮發(fā)油對(duì)植物病原真菌和病原細(xì)菌的生物活性。

1 材料與方法

1.1 供試生物材料

艾蒿于2016年6月采于河南省輝縣市關(guān)山地區(qū)，室內(nèi)晾干后冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

供試真菌：棉花黃萎病菌（Verticillicum dahliae）、小麥赤霉病菌（Gibberellins zeae）、水稻紋枯病菌、灰霉病原菌（Botrytis cinerea）、辣椒疫霉病菌。

供試細(xì)菌：金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、炭疽桿菌（B. anthraci）、沙門氏菌（Salmonella typhimurium）。

1.2 儀器與試劑

儀器：電熱套、圓底燒瓶、球形冷凝管、高壓蒸氣滅菌器、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、超凈工作臺(tái)、霉菌培養(yǎng)箱。

藥劑：乙醚、氯化鈉、瓊脂、葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、吐溫-40，試劑均為分析純。

1.3 揮發(fā)油的提取

將艾葉粉碎，稱取50 g置于2 000 mL圓底燒瓶中，加入1 000 mL去離子水，超聲波振蕩20 min后開始蒸餾。收集餾出液500 mL后加入500 mL去離子水繼續(xù)蒸餾，兩次共得到1 000 mL的餾出液。向餾出液中加入氯化鈉使飽和，再用等體積的乙醚萃取3次，合并后濃縮除去乙醚，經(jīng)無水硫酸鈉干燥后即得艾蒿揮發(fā)油。

1.4 培養(yǎng)基的配制

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：稱取200 g馬鈴薯，洗凈去皮切片，加水1 000 mL煮沸20 min，用四層紗布過濾后加水補(bǔ)足至1 000 mL，再加12 g葡萄糖和12 g瓊脂粉，煮沸待瓊脂粉完全熔化后用三角瓶分裝，在121 ℃下高壓滅菌20 min，冷卻后貯存?zhèn)溆谩?/p>

牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：稱取牛肉膏3.0 g、蛋白胨5.0 g，加少量水加熱攪拌使其熔化，補(bǔ)充水至1 000 mL，調(diào)pH至7.2～7.4，分裝在三角瓶中，在121 ℃下高壓滅菌20 min，冷卻后貯存?zhèn)溆谩?/p>

牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：在上述液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，加瓊脂15.0 g，分裝在三角瓶中，在121 ℃下高壓滅菌20 min，冷卻后貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 GC-MS分析條件

氣相色譜分離采用TR-5MS（30 m×25 mm×25 μm）石英毛細(xì)管柱，載氣為高純氦，載氣流量1.0 mL/min，進(jìn)樣量1 μL，進(jìn)樣口采用不分流模式。色譜柱采用程序升溫：初始溫度40 ℃，保持1 min后，以3 ℃/min升至100 ℃，保持10 min，以5 ℃/min升至200 ℃，保持10 min，再以5 ℃/min升至250 ℃，保持15 min。質(zhì)譜分析采用Trace DSQII型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（Thermo公司），色譜柱及色譜柱程序升溫條件同上。載氣為高純氦，分流比為1∶50；質(zhì)譜接口溫度為280 ℃，電離方式EI，離子源溫度280 ℃，電子能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍為40～500 amu，檢索譜庫(kù)為Nist05。

1.6 抗菌活性測(cè)定

采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定艾蒿揮發(fā)油藥劑對(duì)5種病原真菌的離體抑菌活性。首先用丙酮配制成濃度為9.792 00～0.076 50 mg/mL的一系列溶液，用移液槍移取1 mL的稀釋液于刻度試管（20 mL或25 mL）中，再加入融化好的培養(yǎng)基至10 mL，充分混勻后倒入滅菌后的培養(yǎng)皿中，放置在平臺(tái)上冷卻后即制成帶藥平板。試驗(yàn)過程中設(shè)置溶劑對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。將預(yù)先在PDA培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)7 d的真菌用打孔器打出直徑為4 mm的菌餅，用接種針把菌餅倒扣（菌絲面朝下）在帶藥平板上，在25 ℃霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，按以下公式計(jì)算菌落生長(zhǎng)抑制率，并采用DPS軟件進(jìn)行毒力曲線計(jì)算及多重比較（Duncan氏新復(fù)極差法）。

抑制率=（對(duì)照組菌落平均直徑-處理組菌落平均直徑）/（對(duì)照組菌落平均直徑-菌餅直徑）×100%

采用牛津杯抑菌圈法[8]測(cè)定艾蒿揮發(fā)油對(duì)4種細(xì)菌的抑菌活性。用0.2%吐溫-40水溶液將揮發(fā)油配制成0.100、0.050、0.010、0.005、0.001 mg/mL等系列濃度。將所需細(xì)菌轉(zhuǎn)接于液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h。按2∶1（v/v）將融化冷卻至50 ℃左右的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基與轉(zhuǎn)接培養(yǎng)過的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基混勻，每培養(yǎng)皿倒入15 mL。待培養(yǎng)基冷卻后，用無菌鑷子將牛津杯輕輕放入培養(yǎng)皿中。吸取配制好的供試藥品0.2 mL加入牛津杯，以不含藥液的溶劑為對(duì)照，在25 ℃條件下培養(yǎng)24 h測(cè)定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 艾蒿揮發(fā)油的提取

艾蒿葉經(jīng)水蒸氣蒸餾及乙醚萃取最終得淡黃色艾蒿揮發(fā)油，出油率為0.606 9%。

2.2 揮發(fā)油成分分析

用毛細(xì)管氣相色法從艾葉揮發(fā)油中共分離出84個(gè)峰，采用氣相色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，以面積歸一化法測(cè)得揮發(fā)油各組分相對(duì)含量。按“1.5”GC-MS條件對(duì)艾葉揮發(fā)油進(jìn)行分析，得其總離子流如圖1所示。

對(duì)總離子流中的各峰經(jīng)質(zhì)譜掃描后得到質(zhì)譜圖，經(jīng)過計(jì)算機(jī)數(shù)椐庫(kù)系統(tǒng)檢索和人工譜圖解析，鑒定出艾葉揮發(fā)油中的化學(xué)成分62種，占峰面積的97.58%，結(jié)果見表1。由表1可以看出，艾蒿揮發(fā)油中含量最高的是桉樹腦（26.89%），其次為1，2-鄰苯二甲酸-（2-乙基己基）酯（11.22%），化合物類型以烯、醇、酮、芳香化合物為主，含氧化合物占揮發(fā)油總量的60%以上。揮發(fā)油中含量最高的桉樹腦為已知活性萜類，其他多種組分，如桉油精、異龍腦、匙葉桉油烯醇、紅沒藥烯環(huán)氧化物、植醇、香芹酮、紫蘇醛等化合物。在檢出上述化合物的同時(shí)，還從艾蒿揮發(fā)油中鑒定出羽扇烯酮、羽扁豆醇、α-香樹脂醇、烏蘇烷-12-烯-24-甲酸-3-氧甲酯、正三十七醇、4，4， 6a，6b，8a，11，11，14b-Octamethyl-1，4，4a，5，6，6a，6b，7，8，8a，9，10，11，12，12a，14，14a，14b-octadecahydro-2H-picen-3-one等高分子量化合物，這些化合物在已有文獻(xiàn)中未曾報(bào)道過。這些差異可能與艾蒿的產(chǎn)地、氣候、生長(zhǎng)環(huán)境以及提取方法、檢測(cè)手段等有著密切的關(guān)系，這些成分的檢出對(duì)深入研究艾蒿揮發(fā)油的生物活性具有重要意義。

2.3 艾蒿揮發(fā)油抗菌活性測(cè)定

采用生長(zhǎng)速率法[9]測(cè)定艾蒿揮發(fā)油對(duì)5種病原菌的抑制作用，抗菌效果見表2。由表2可知，艾蒿揮發(fā)油對(duì)水稻紋枯病菌的抗菌效果顯著好于除辣椒疫霉病菌外的其他病菌，EC50為0.035 0 mg/mL，對(duì)辣椒疫霉病菌的抗菌效果次之，EC50為0.055 9 mg/mL。艾蒿揮發(fā)油對(duì)小麥赤霉病菌和棉花黃萎病菌的抗菌效果較差，EC50高于0.150 0 mg/mL。測(cè)試中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)揮發(fā)油濃度高于1 mg/mL時(shí)，能夠完全抑制5種病原菌的生長(zhǎng)。

牛津杯法測(cè)定結(jié)果（表3）表明，艾蒿揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抗菌效果最好，其次是炭疽桿菌和枯草芽孢桿菌，對(duì)沙門氏菌僅在高供試濃度（0.10 mg/mL）下表現(xiàn)出微弱的抗菌活性。

3 小結(jié)與討論

對(duì)太行山區(qū)艾蒿揮發(fā)油的成分及抗菌活性進(jìn)行研究，經(jīng)GC-MS分析，從揮發(fā)油中分離鑒定出62種化合物。艾蒿揮發(fā)油成分分析中采用更寬的質(zhì)量掃描范圍，從而鑒定出多種高分子量且含量較高的化合物，這些化合物在以往的研究中均未發(fā)現(xiàn)?？咕钚詼y(cè)定表明，艾蒿揮發(fā)油在0.1 mg/mL濃度下即對(duì)供試植物病原真菌和供試病原細(xì)菌表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抗菌作用，其活性優(yōu)于艾蒿傳統(tǒng)用材[3，10]。由此可見，太行山區(qū)所出產(chǎn)的艾蒿，其揮發(fā)油具備較好的抗菌活性，在日常病原細(xì)菌的防治以及植物病原真菌殺菌劑的開發(fā)中具有潛在的研究?jī)r(jià)值。

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