食甲基桿菌J1-1吡咯喹啉醌生物合成突變株的篩選和鑒定

李彤，景愛霞，楊亞欣，劉曉陽，汪建華，劉黨生，熊向華，張惟材

1.沈陽藥科大學，遼寧 沈陽 110016；2.軍事科學院 軍事醫(yī)學研究院，北京 100071

吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinine，PQQ）是20世紀70年代末發(fā)現(xiàn)的繼煙酰胺核苷酸和黃素核苷酸后第三類氧化還原酶的輔酶[1]，具有抗氧化、清除氧自由基、增強線粒體功能、保護心肌損傷、促進認知等多種生理功能[2-4]。PQQ的制備方法主要有化學合成法和生物合成法?；瘜W合成步驟多、成本高、易造成環(huán)境污染，而生物合成周期短、成本低，被認為是最有前景的工業(yè)化生產(chǎn)路線。迄今發(fā)現(xiàn)只有某些革蘭陰性菌能產(chǎn)生PQQ，如乙酸鈣不動桿菌、肺炎克雷伯菌、扭脫甲基桿菌、氧化葡糖桿菌等[5]。目前PQQ合成基因以及PQQ的生物合成途徑還不完全清楚。從革蘭陰性菌分離到的PQQ合成基因包括pqqA、pqqB、pqqC、pqqD、pqqE、pqqF、pqqG，大多以基因簇的形式存在。其中pqqA基因編碼的小肽PqqA含有PQQ生物合成的骨架物質(zhì)谷氨酸和酪氨酸，被認為是PQQ合成的前體；PqqB可能與PQQ的跨膜運輸有關(guān)；PqqC負責催化PQQ合成最后一步反應；PqqD的功能尚不清楚；PqqE的作用可能是連接前體中的谷氨酸和酪氨酸殘基；PqqF、PqqG在PQQ合成中可能發(fā)揮內(nèi)切酶的作用[6]。

本實驗室從土壤中分離篩選到一株P(guān)QQ產(chǎn)生菌MP688，后經(jīng)誘變得到高產(chǎn)菌株J1-1。已完成MP688的全基因組測序，發(fā)現(xiàn)其中PQQ合成基因包括基因簇pqqABCDE和pqqFG，以及4個單獨拷貝的pqqA基因[7]。在此，我們通過Tn5轉(zhuǎn)座誘變技術(shù)進一步篩選食甲基桿菌J1-1中參與PQQ生物合成的相關(guān)基因，為闡明PQQ的生物合成機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

食甲基桿菌J1-1、大腸桿菌λ-pir感受態(tài)細胞、質(zhì)粒pCM66和pGX由本實驗室保存；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞、快速質(zhì)粒小提試劑盒、細菌基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收純化試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；ENTn5＜R6Kγori/KAN-2＞TNP Transposome Kit購自Epicentre公司；限制性內(nèi)切酶購自Thermo公司；DNA聚合酶、pEASY-Uni SeamLess Cloning and Assembly Kit、T4DNA連接酶、DNA marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PCR引物（表1）合成及測序由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，121℃滅菌20 min。

HC培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O 0.2 g/L，KH2PO42.8 g/L，（NH4）2SO43.0 g/L，Na2HPO46.0 g/L，MnCl2· 4H2O 5.0 mg/L，ZnSO4·7H2O 5.0 mg/L，CuSO4· 5H2O 0.5 mg/L，檸檬酸鐵60.0 mg/L，甲醇10 mL/ L，pH7.0，115℃滅菌30 min。

1.2 分子生物學操作

PCR、酶切、連接、轉(zhuǎn)化等常規(guī)分子生物學操作參照文獻方法進行[8]。

1.3 Tn5突變體庫的構(gòu)建

從 EN-Tn5＜R6Kγori/KAN-2＞TNP Transpo?some Kit中取1 μL Transposome加入J1-1感受態(tài)細胞中，冰浴5 min混勻后轉(zhuǎn)移到預冷的電擊杯中，2.5 kV電擊后迅速加入500 μL HC培養(yǎng)基，30℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)4 h，涂布于含50 μg/mL卡那霉素（Kan）的HC平板上，倒置培養(yǎng)2～3 d。挑取單菌落于5 mL HC Kan抗性試管中，30℃、200 r/min培養(yǎng)4 d，連續(xù)傳3代后仍有Kan抗性，說明轉(zhuǎn)座序列可以穩(wěn)定傳代，以此方法建立突變體庫。

表1 PCR引物序列

1.4 PQQ合成缺陷突變株的篩選及PQQ合成水平檢測

PQQ是一種棕紅色小分子化合物，食甲基桿菌J1-1在發(fā)酵過程中，PQQ被逐漸分泌到胞外，使發(fā)酵液呈紅色，發(fā)酵液顏色可直觀反映PQQ合成水平。挑取Tn5轉(zhuǎn)座突變體庫上的單菌落于5 mL HC液體培養(yǎng)基中，以J1-1為對照，30℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)4 d，挑選發(fā)酵液顏色呈白色且與對照菌發(fā)酵液顏色差異較大的菌株作為初篩突變株，進一步采用分光光度法[9]檢測發(fā)酵液中PQQ合成水平。

1.5 質(zhì)粒拯救法鑒定插入位點

突變菌株基因組提取按照基因組提取試劑盒說明書進行。選擇適當限制性內(nèi)切酶單酶切突變株基因組，酶切產(chǎn)物經(jīng)T4DNA連接酶連接，熱激轉(zhuǎn)化到大腸桿菌λ-pir感受態(tài)細胞中，涂布于含50 μg/mL Kan的LB抗性平板上，挑取單菌落37℃振蕩培養(yǎng)，12 h后用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，由華大公司用引物SeFP/SeRP測序，測序結(jié)果通過NCBI的BLAST比對，確定Tn5插入位點。

1.6 mpq0056基因敲除

以J1-1基因組為模板，選用引物up1500-F/ up1500-R和down1500-F/down1500-R分別擴增上、下游同源臂基因；以質(zhì)粒pGX-Gm為模板，選用引物Gm-F/Gm-R擴增慶大霉素（Gm）基因片段，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，用膠回收試劑盒純化。將上、下游同源臂基因，Gm基因和經(jīng)XhoⅠ、NotⅠ雙酶切的載體pGX-Gm用pEASYUni SeamLess Cloning and Assembly Kit重組轉(zhuǎn)化，獲得pGX-up-Gm-down重組質(zhì)粒。

以pGX-up-Gm-down質(zhì)粒為模板，選用引物up1500-F/down1500-R擴增片段-up-Gm-down-，純化后電擊轉(zhuǎn)入J1-1感受態(tài)細胞，從HC抗性平板上挑取單菌落，通過組合PCR驗證敲除菌。

1.7 mpq0056基因回補及過表達

用啟動子預測軟件BPROM預測mpq0056基因的啟動子位置。以J1-1基因組為模板，用引物mpq0056-F/mpq0056-R擴增mpq0056啟動子及編碼基因，回收純化DNA，用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、KpnⅠ分別雙酶切載體pCM66及目的DNA并膠回收純化，酶切產(chǎn)物經(jīng)T4DNA連接酶連接，將連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒酶切驗證。

將質(zhì)粒pCM66-0056分別電擊轉(zhuǎn)化野生菌J1-1和敲除菌J1-1Δ0056，構(gòu)建過表達菌株和回補菌株。HC抗性平板培養(yǎng)2～3 d后，挑取單克隆于HC液體培養(yǎng)基中，提取質(zhì)粒復轉(zhuǎn)到大腸桿菌DH5α中，測序鑒定。

1.8 菌株生長評價

挑取野生菌J1-1、突變菌1-52、敲除菌J1-1Δ 0056、回補菌和過表達菌單菌落于5 mL HC液體培養(yǎng)基中，30℃活化24 h，分別按1%的接種量接種至100 mL HC液體培養(yǎng)基中，30℃同步培養(yǎng)，間隔12 h取樣測定D600nm值，繪制生長曲線。

2 結(jié)果

2.1 Tn5轉(zhuǎn)座突變體庫構(gòu)建

對J1-1進行Tn5轉(zhuǎn)座誘變，通過Kan抗性篩選，構(gòu)建得到庫容量為1.0×105的突變體庫。以突變株基因組為模板，用引物Kan-F/R、MOD-F/R PCR擴增Kan與轉(zhuǎn)座序列，分別獲得約800和1923 bp的特異性條帶，與預期相符（圖1），表明轉(zhuǎn)座序列已插入受體菌株染色體基因組。

2.2 Tn5轉(zhuǎn)座突變株的篩選和插入位點鑒定

經(jīng)Tn5突變體庫篩選獲得1株P(guān)QQ產(chǎn)量顯著降低的突變株1-52，該突變株發(fā)酵液接近白色（圖2）。將該突變株基因組單酶切自連轉(zhuǎn)化后，從Kan抗性平板上挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)后提取質(zhì)粒并測序，測序結(jié)果經(jīng)BLAST后，確定插入基因為mpq0056（Chorismate lyase，ubiC）（圖3）。

2.3 mpq0056基因敲除

2.3.1mpq0056基因敲除質(zhì)粒的構(gòu)建 采用引物up1500-F/up1500-R和down1500-F/down1500-R菌落PCR驗證構(gòu)建的敲除質(zhì)粒pGX-up-Gm-down，均在1500 bp處出現(xiàn)特異性條帶，與預期相符（圖4）。將敲除質(zhì)粒送北京六合華大公司測序，結(jié)果進一步證實重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3.2mpq0056基因敲除菌的鑒定 選用引物up1700-F/Gm-R、Gm-F/down1700-R、Gm-F/Gm-R，以敲除菌基因組為模板進行組合PCR鑒定，應分別擴增出2500、2500、800 bp的片段，而以野生菌基因組為模板時應為陰性結(jié)果，結(jié)果與以上預期完全一致（圖5），說明mpq0056基因敲除成功。

圖1 缺陷株抗性基因及轉(zhuǎn)座片段的PCR鑒定M：DNA marker；1：空白對照；2：陽性對照；3：1-52 PCR擴增Kan序列；4：1-52 PCR擴增轉(zhuǎn)座序列

圖2 野生菌J1-1和突變株1-52發(fā)酵液

圖3 1-52突變株Tn5插入位點

圖4 pGX-up-Gm-down菌落PCR鑒定M：DNA marker；1：空白對照；2：陽性對照；3：mpq0056上游同源臂基因；4：mpq0056下游同源臂基因

圖5 敲除菌J1-1Δ0056的組合PCR鑒定M：DNA marker；1：空白對照；2：野生菌（up1700-F/Gm-R）；3：敲除菌（up1700-F/Gm-R）；4：野生菌（Gm-F/down1700-R）；5：敲除菌（Gm-F/down1700-R）；6：野生菌（Gm-F/Gm-R）；7：敲除菌（Gm-F/Gm-R）

2.4 mpq0056基因回補及過表達

用啟動子預測軟件BPROM預測結(jié)果顯示在mpq0056基因上游200 bp內(nèi)存在啟動子序列（圖6）。將mpq0056基因啟動子區(qū)和編碼區(qū)克隆到載體pCM66中，構(gòu)建pCM66-0056載體，經(jīng)XbaⅠ、KpnⅠ雙酶切后出現(xiàn)2條DNA帶，約8000 bp的條帶與載體pCM66大小一致，約700 bp的條帶與mpq0056的啟動子和編碼區(qū)片段大小一致（圖7），表明pCM66-0056重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

提取回補菌株和過表達菌株質(zhì)粒復轉(zhuǎn)到大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒，用引物mpq0056-F/mpq0056-R測序，結(jié)果顯示回補株和過表達菌株構(gòu)建成功。

2.5 菌株表型鑒定

用分光光度法檢測突變株1-52的生長及PQQ合成水平，突變株生長速度略慢，同時PQQ合成水平只有野生株的1/7～1/6。向突變株培養(yǎng)基中額外添加終濃度為10 mg/L的PQQ標準品（用“+”表示），突變株的生長基本恢復正常，但單位細胞的PQQ合成水平依然很低（圖8）。表明突變基因mpq0056與PQQ的生物合成是有關(guān)聯(lián)的。

敲除mpq0056基因后，敲除菌生長正常，單位細胞PQQ合成水平下降顯著，與Tn5誘變得到的結(jié)果相符；回補及過表達菌株的生長均正常，回補基因mpq0056后，PQQ合成水平回復到野生菌水平（圖9）。以上結(jié)果進一步說明基因mpq0056與PQQ的生物合成是相關(guān)的。

3 討論

隨著后基因組時代的到來，發(fā)現(xiàn)新基因和挖掘功能基因的方法越來越多，其中構(gòu)建轉(zhuǎn)座突變體庫是最直接有效的方法之一。Tn5轉(zhuǎn)座子是復合型轉(zhuǎn)座子，在宿主中單拷貝復制。相比于常規(guī)的轉(zhuǎn)座技術(shù)，Tn5具有突變性狀穩(wěn)定、突變基因容易定位、抗性篩選等優(yōu)勢[10]，操作簡單、轉(zhuǎn)化效率高，能夠快速獲得大量穩(wěn)定遺傳的Tn5轉(zhuǎn)座突變株。實踐證明利用Tn5轉(zhuǎn)座誘變篩選食甲基桿菌J1-1中PQQ合成基因的方法是可行的。前期研究發(fā)現(xiàn)，J1-1可利用的碳源并不多，其中以甲醇和果糖為碳源時菌體生長良好，當PQQ合成基因pqqBCDE敲除后，在果糖培養(yǎng)基中生長良好，卻不能利用甲醇為碳源生長，當敲除菌中加入痕量的外源PQQ后菌體生長正常，這一現(xiàn)象說明菌體利用甲醇為碳源時是PQQ依賴的。本研究經(jīng)Tn5轉(zhuǎn)座誘變篩選PQQ合成基因是在以甲醇為碳源的平板上篩選，因以甲醇為碳源時PQQ合成水平高，表型明顯，便于篩選，但目前這種方法只能篩選到PQQ合成水平下降的突變株，不合成PQQ突變株在甲醇為碳源的培養(yǎng)基中不生長。后續(xù)將嘗試利用以果糖為碳源的平板進一步篩選PQQ合成基因。

圖6 mpq0056上游前200 bp的啟動子預測分析

圖7 pCM66-0056雙酶切鑒定M：DNA marker；1：pCM66-0056質(zhì)粒XbaⅠ、KpnⅠ雙酶切

圖8 突變株1-52的生長及PQQ合成水平檢測

圖9 mpq0056基因敲除、回補及過表達菌生長和PQQ合成水平檢測

綜上，經(jīng)Tn5轉(zhuǎn)座誘變獲得一株插入位點為mpq0056的PQQ合成缺陷突變株，BLAST分析結(jié)果表明該基因編碼產(chǎn)物可能是分支酸裂合酶，Nichols[11]等研究顯示該酶在大腸桿菌中催化分支酸生成丙酮酸和對羥基苯甲酸，一方面作為泛醌類物質(zhì)合成的前體，參與催化泛醌生物合成的第一步反應，另一方面作為芳香族氨基酸生物合成的中間代謝產(chǎn)物。通過基因組位置分析發(fā)現(xiàn)，mpq0056與上游基因mpq0055（ATP-dependent DNA helicase RecG）間隔區(qū)為73 bp，經(jīng)在線啟動子預測軟件BPROM分析顯示此間隔區(qū)存在啟動子序列，提示mq0055與mpq0056基因不是同一基因簇，未影響上游基因功能；與下游基因mpq0057（4-hydroxybenzoate polyprenyl transferase，ubiA）間隔區(qū)為78 bp，功能注釋存在相關(guān)性。我們推測食甲基桿菌J1-1中基因mpq0056影響PQQ生物合成的機制可能是通過影響芳香族氨基酸的代謝，間接影響PQQ前體物質(zhì)合成。其影響機制須后續(xù)實驗闡明。

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