玉米黃曲霉毒素污染生防菌篩選及菌株B42-3抗菌活性研究

姚彥坡　丁　丹　張友青　常曉嬌 董李學(xué)　張立田　杜瑞煥　孫長(zhǎng)坡

(唐山市畜牧水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)中心1，唐山　063000) (湖北省黃岡市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心2，黃岡　435400) (河北省遷安市植保站3，遷安　063000) (國(guó)家糧食局科學(xué)研究院4，北京　100037)

玉米是我國(guó)主要糧食作物，同時(shí)也是重要的飼料原材料。玉米在生長(zhǎng)、儲(chǔ)藏和轉(zhuǎn)運(yùn)過程中容易受到霉菌毒素的污染，特別是黃曲霉毒素，這將嚴(yán)重影響到玉米農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量安全。如何解決玉米霉菌毒素污染問題，已成為一個(gè)亟待解決的世界性難題。黃曲霉毒素是由黃曲霉或寄生曲霉產(chǎn)生的次生真菌代謝產(chǎn)物，是一類理化性質(zhì)相當(dāng)穩(wěn)定、結(jié)構(gòu)極其相似的劇毒性、高致癌性和高污染性真菌毒素[1]，每年給玉米、水稻、油菜、小麥、大豆及花生等農(nóng)作物的生產(chǎn)帶來高達(dá)數(shù)百億美元損失[2,3]。人或家畜食用受黃曲霉毒素污染的農(nóng)產(chǎn)品后會(huì)導(dǎo)致機(jī)體病變，嚴(yán)重者甚至死亡。因此，加強(qiáng)玉米、水稻、花生等農(nóng)產(chǎn)品中黃曲霉毒素污染的防控刻不容緩。

黃曲霉毒素對(duì)玉米的污染主要發(fā)生在儲(chǔ)藏時(shí)期，但黃曲霉菌對(duì)玉米的侵染主要發(fā)生在田間生長(zhǎng)時(shí)期，因此，防控好黃曲霉菌對(duì)田間玉米的侵染至關(guān)重要。目前，對(duì)玉米生長(zhǎng)時(shí)期黃曲霉菌侵染的防治沒有理想的措施，主要以化學(xué)防治為主。由于化學(xué)防治污染環(huán)境，防治成本較高，并且導(dǎo)致大量的農(nóng)產(chǎn)品藥殘問題，所以，尋找一種對(duì)人體健康、對(duì)環(huán)境友好的防控措施勢(shì)在必行。生物防治是近年來發(fā)展速度較快的一種病害治理措施，由于不污染環(huán)境、防病機(jī)理多樣、殺菌譜廣、不影響農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)，因而備受廣大研究人員和科技人員青睞[4]。目前，國(guó)內(nèi)玉米內(nèi)生拮抗菌的研究主要針對(duì)玉米根腐病和紋枯病等病害，對(duì)黃曲霉菌侵染及毒素污染的研究鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以黃曲霉菌及毒素為研究對(duì)象，從健康的玉米籽粒中分離內(nèi)生細(xì)菌，并采用活體方法篩選拮抗細(xì)菌，研究其抗菌活性，以期為玉米黃曲霉毒素污染的防控瓶頸問題的解決探索新的途徑。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1供試菌株及植物 黃曲霉菌株由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所質(zhì)標(biāo)室提供。內(nèi)生細(xì)菌自河北、山東、山西及吉林等黃曲霉菌侵染嚴(yán)重病區(qū)的健康玉米籽粒內(nèi)分離獲得。

1.1.2供試玉米品種：鄭單958，唐山市農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究室提供。

1.2　實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1內(nèi)生細(xì)菌的分離、純化及保存

玉米內(nèi)生細(xì)菌的分離參照Dey等[5]方法。選取河北、山東、山西及吉林等省份健康玉米籽粒，將稱重后的玉米籽粒在無菌三角瓶中用3%次氯酸鈉溶液浸泡5～8 min，用無菌水沖洗5次，最后瀝干水分。用鑷子夾住玉米籽粒后用無菌剪刀將其分成3～5等份，把玉米放入LB培養(yǎng)基平板中，然后放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，認(rèn)真觀察菌落每天的生長(zhǎng)情況，及時(shí)挑取生長(zhǎng)良好、特征明顯的單菌落進(jìn)一步純化培養(yǎng)，在LB斜面培養(yǎng)基上4 ℃條件下保藏備用。

1.2.2玉米內(nèi)生拮抗細(xì)菌的離體篩選

采用平板對(duì)峙培養(yǎng)方法對(duì)黃曲霉菌及其毒素拮抗細(xì)菌進(jìn)行篩選。將預(yù)先準(zhǔn)備好的黃曲霉菌菌碟置于PDA平板中央，然后用高溫滅過菌的牙簽挑取內(nèi)生細(xì)菌，距病原菌2 cm處，等距離對(duì)稱接種到PDA平板上，放置于28 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)3～7 d，觀察抑菌帶的有無及大小，重復(fù)3次。選出抑菌帶較寬的內(nèi)生細(xì)菌菌株在玉米籽粒上進(jìn)行活體抑菌實(shí)驗(yàn)復(fù)篩及計(jì)算抑制率。抑制率=(對(duì)照菌落半徑-處理菌落半徑)/對(duì)照菌落半徑×100%。

1.2.3黃曲霉菌拮抗菌的活體篩選

拮抗菌發(fā)酵液的準(zhǔn)備：利用接種針把離體實(shí)驗(yàn)中具有抑菌活性的拮抗菌株單菌落轉(zhuǎn)移至裝有100 mL LB培養(yǎng)液的三角瓶中，于28 ℃培養(yǎng)條件下，150 r/min振蕩培養(yǎng)1 d。利用移液槍吸取1 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至裝有100 mL LB培養(yǎng)液的三角瓶中，28 ℃培養(yǎng)條件下、150 r/min振蕩培養(yǎng)2 d，獲得拮抗菌株的發(fā)酵液。拮抗細(xì)菌的活體篩選：把上述發(fā)酵2 d的拮抗菌發(fā)酵液(1.0×106cfu/mL)和培養(yǎng)7 d生長(zhǎng)旺盛的黃曲霉菌孢子懸液(1.0×106cfu/mL)分別浸泡玉米籽粒30 min，每板30粒玉米，放入光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 d。培養(yǎng)箱培養(yǎng)條件為：溫度28 ℃，濕度70%～80%，光照為12 h黑暗/12 h光照。以不浸菌液為空白對(duì)照，每處理設(shè)3次重復(fù)。

1.2.4田間防控實(shí)驗(yàn)

采用隨機(jī)設(shè)計(jì)，3個(gè)重復(fù)，每個(gè)小區(qū)的面積為15 m×3 m。將60 kg·hm-2(1×108孢子·g-1)生防制劑于玉米播種時(shí)隨肥料施入，設(shè)置化學(xué)防治方法(70%甲基托布津可濕性粉劑)及對(duì)照，農(nóng)藥的施用方法同生防制劑。玉米收獲后每組隨機(jī)調(diào)查5個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)10株。調(diào)查生防菌對(duì)黃曲霉毒素污染的控制效果。抑毒率/%=(對(duì)照毒素量-處理毒素量)/對(duì)照毒素量×100%；促生率/%=(對(duì)照株高-處理株高)/對(duì)照株高×100%。

1.2.5內(nèi)生拮抗細(xì)菌菌株B 42-3的鑒定

常規(guī)鑒定方法參見文獻(xiàn)[6]。

16S rDNA PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定: 采取試劑盒的方法對(duì)生防菌基因組DNA進(jìn)行提取。擴(kuò)增細(xì)菌菌株的16S rDNA所用引物為：27 F(5、-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3、)和1 492 R(5、-CTACGGCTA CCTTGTTACGA-3、)。PCR反應(yīng)體系：10×Taq反應(yīng)緩沖液 5μL，dNTP(10 mM each)lμL，引物27 F (10 μmol/L) 1 μL，引物1 492 R (10 μmol/L) 1 μL，模板DNA10 pmol，TaqDNA聚合酶 (μmol/L)0.25 μL，Dd H2O 50 μL。擴(kuò)增條件：98 ℃ 為5 min；95 ℃為35 s，55 ℃為35 s，72 ℃為l min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃為8 min。瓊脂糖凝膠電泳并回收目標(biāo)DNA片段，由上海派諾森生物科技公司進(jìn)行測(cè)序；測(cè)序結(jié)果用BLAST軟件在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性比對(duì)，對(duì)生防菌株進(jìn)行鑒定。

1.2.6上清液和過濾液制備

取一環(huán)LB斜面上活化后的生防菌B42-3于100 mL LB培養(yǎng)液的三角瓶中，于37 ℃培養(yǎng)條件下，160 r/min振蕩培養(yǎng)48 h后，制備成以下處理液：上清液，培養(yǎng)液在12 000r/min下離心10 min，取上清，用0.22 μm細(xì)菌過濾器過濾后得到無菌的過濾液。蛋白粗提液：培養(yǎng)液在4 ℃條件下，于12 000 r/min離心150min，棄沉淀。在上清液中加入固體硫酸銨至70%飽和度，在4 ℃條件下，于10 000 r/min離心20 min，4 ℃靜置過夜，棄上清液，沉淀用磷酸緩沖液懸浮(pH 7.0，1/25體積10 mmol/L)，然后用0.22 μm細(xì)菌過濾器過濾掉可能存在的細(xì)菌。

1.2.7生防菌代謝產(chǎn)物對(duì)黃曲霉菌菌絲生長(zhǎng)的影響

取黃曲霉菌菌懸液1×1065 mL，放入溫度降到35 ℃左右PDA三角瓶中(100 mL/350 mL)，搖晃2 min后，均勻的倒入培養(yǎng)皿中。用打孔器在PDA平板周圍等距離打3個(gè)孔，用移液槍分別加入100 μL上清液、過濾液、蛋白粗提液、冷凍上清液及冷凍過濾液(-4 ℃條件下保藏24 h)，30 ℃培養(yǎng)3～5 d，在對(duì)照黃曲霉菌落長(zhǎng)滿平板時(shí)，檢測(cè)各處理抑菌圈的半徑，計(jì)算出生防菌代謝產(chǎn)物對(duì)黃曲霉菌生長(zhǎng)的抑制率。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.2.8黃曲霉毒素污染HPLC法檢測(cè)

黃曲霉毒素含量測(cè)定可分為3個(gè)步驟：萃取、凈化、檢測(cè)。首先使用甲醇∶水(6∶4)溶液對(duì)其進(jìn)行萃取，然后使用免疫親和柱對(duì)樣品殘留毒素進(jìn)行凈化提取(方法參照免疫親和柱使用說明書)；最后用HPLC(柱后光化學(xué)衍生)對(duì)凈化提取得到的樣品進(jìn)行檢測(cè)。HPLC檢測(cè)條件為流動(dòng)相甲醇∶水=1∶1；流速1 mL/min；色譜柱C18 150 mm×4．6 mm，0.5 μm；激發(fā)波長(zhǎng)360 nm，檢測(cè)波長(zhǎng)440 nm；進(jìn)樣量20 μL。

計(jì)算出生防細(xì)菌對(duì)黃曲霉毒素的抑毒率。抑毒率=(對(duì)照毒素含量-處理毒素含量)/對(duì)照毒素含量×100%。

2　結(jié)果與分析

2.1　玉米內(nèi)生細(xì)菌的分離

根據(jù)菌落形態(tài)、顏色及出現(xiàn)的先后差異，從表面徹底消毒的籽粒放置的平板中挑取不同菌落進(jìn)行純化，得到350株內(nèi)生細(xì)菌。分離結(jié)果為，河北玉米籽粒中分離到內(nèi)生菌105株；山東玉米籽粒中分離出內(nèi)生菌95株；山西玉米籽粒中分離出內(nèi)生菌152株；吉林玉米籽粒中分離出內(nèi)生菌148株。研究結(jié)果顯示，不同省份區(qū)域的玉米籽粒中分離到的細(xì)菌數(shù)量明顯不同。

2.2　內(nèi)生拮抗細(xì)菌的篩選

2.2.1離體篩選

將分離獲得的350株內(nèi)生細(xì)菌通過對(duì)峙培養(yǎng)法進(jìn)行拮抗篩選，挑選10株對(duì)黃曲霉菌有較強(qiáng)抑制作用的細(xì)菌進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)研究(表1)。10株生防菌的抑菌帶寬均在8 mm以上，拮抗效果在35%以上。其中菌株B42-3對(duì)黃曲霉菌的抑制率最高，達(dá)85.5%，其次為菌株B12-3和B96-1，抑制率分別達(dá)到75.5%和70.5%。

表1　生防菌株對(duì)黃曲霉菌的拮抗作用

2.2.2活體拮抗篩選

將離體條件下具有較強(qiáng)拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌在玉米籽粒上進(jìn)行活體篩選(表2)，結(jié)果表明獲得的內(nèi)生細(xì)菌在籽粒上表現(xiàn)出較好防病效果，對(duì)黃曲霉菌毒素污染抑制率較高。較好的8株拮抗細(xì)菌對(duì)黃曲霉菌的抑制效果達(dá)42.5%～75.0%，其中，菌株B42-3對(duì)黃曲霉菌的防效最高，達(dá)75.0%。抑毒效果較好的菌株分別為B42-3、B12-3及B88-5，抑毒率分別為70.5%、68.5%及62.7%，有進(jìn)一步研究的價(jià)值。

表2　拮抗菌對(duì)黃曲霉菌的防治效果及抑毒率

2.3　田間實(shí)驗(yàn)

田間實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，生防菌對(duì)黃曲霉毒素污染具有較好的抑制效果。菌株B42-3促生率及抑毒率最高，分別達(dá)到4.5%及75.5%，該菌株有進(jìn)一步研究的價(jià)值，生防潛力巨大，其次是菌株B96-1，促生率及抑毒率分別達(dá)到3.5%及60.5%(表3)。

表3　拮抗菌對(duì)黃曲霉菌產(chǎn)毒抑制率及對(duì)花生促生效果

2.4　菌株B42-3的鑒定

2.4.1常規(guī)鑒定

觀察發(fā)現(xiàn)，菌株B42-3在LB培養(yǎng)基上菌落圓形，邊緣不規(guī)則，表面較光滑，不產(chǎn)色素；菌體桿狀，大小為(0.9～1.2) μm×(2.8～3.2) μm；革蘭氏染色陽性；產(chǎn)芽孢，芽孢橢圓形；具有運(yùn)動(dòng)性，證明該菌株為芽孢桿菌(Bacillussp.)。

菌株生理生化測(cè)定結(jié)果見表4。菌株B42-3接觸酶反應(yīng)、葡萄糖、甘油、D-木糖、淀粉水解、山梨醇、甘露糖、果糖、肌醇及纖維二糖均為陽性，氧化酶、D-阿拉伯糖等實(shí)驗(yàn)均為陰性。參照文獻(xiàn)[8-9]，發(fā)現(xiàn)該菌株與解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)的特征基本相似，因此判斷該菌株可能為解淀粉芽孢桿菌。

表4　菌株B42-3的生理生化特征

注：“+”為陽性反應(yīng)，“-”為陰性性反應(yīng)。

2.4.2菌株B42-316S rDNA的序列分析

以菌株B42-3基因組DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增得到該菌株1.48 kb左右的16S rDNA。測(cè)序結(jié)果表明該菌株16S rDNA序列長(zhǎng)度為1 477 bp。BLAST分析發(fā)現(xiàn)菌株B42-3與解淀粉芽孢桿菌菌株EF176773關(guān)系最緊密，同源性達(dá)到100%。結(jié)合菌株B42-3形態(tài)特征及生理生化指標(biāo)測(cè)定等鑒定結(jié)果，可將菌株B42-3鑒定為解淀粉芽孢桿菌。并將該菌株的16S rDNA序列提交到NCBI中登記注冊(cè)，序列接受號(hào)為FJ597542。

2.5　菌株B 42-3代謝物對(duì)黃曲霉菌的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，生防菌培養(yǎng)液對(duì)黃曲霉菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用很強(qiáng)，所篩選菌株抑制率均為100%；生防菌的上清液和凍上清抑菌率均在75%以上，其中B42-3抑菌率最強(qiáng)，分別達(dá)到97.5%和95.4%，其次是B96-1，達(dá)到95.3%和93.2%；生防菌過濾液和凍過濾抑菌率均在75%以上，其中B42-3抑菌率最強(qiáng)，分別達(dá)到95.5%和94.3%，其次是B96-1，達(dá)到92.0%和93.5%；生防菌蛋白粗提液對(duì)黃曲霉菌也有較強(qiáng)的抑制作用，其中B42-3抑菌率最強(qiáng)，達(dá)到88.3%，其次為菌株B12-3和B96-1，抑菌率達(dá)到85.5%和70.6%(表5)。

表5　生防菌代謝產(chǎn)物對(duì)黃曲霉菌生長(zhǎng)的抑制作用

3　討論與結(jié)論

黃曲霉毒素是目前已知的一種自然界最強(qiáng)致癌物，由于能對(duì)糧油產(chǎn)品造成污染，對(duì)人畜造成嚴(yán)重危害，因而備受關(guān)注[7-9]。目前，世界各國(guó)雖然已經(jīng)研發(fā)和推廣了一些毒素污染防控措施，但效果并不理想，存在一定的局限性和不足。人民希望能開發(fā)出一種對(duì)毒素污染防治效果較好、對(duì)環(huán)境無污染和對(duì)人畜安全的技術(shù)和措施，因而，生物防治逐漸受到技術(shù)人員和科研人員的青睞[10-12]。本課題組從我國(guó)不同產(chǎn)區(qū)玉米籽粒中分離內(nèi)生有益微生物，創(chuàng)建生防菌高效篩選體系，篩選高效抑制黃曲霉菌生長(zhǎng)及黃曲霉毒素合成的生防細(xì)菌，選擇抑菌抑毒能力較強(qiáng)的生防菌株進(jìn)行生防機(jī)制研究。

植物體是一種微生態(tài)環(huán)境，內(nèi)生多種對(duì)植物生長(zhǎng)有益的微生物。內(nèi)生細(xì)菌是植物體內(nèi)重要的微生物種群，生存空間穩(wěn)定，不易受外界環(huán)境條件影響，可以在植物體內(nèi)繁殖和生長(zhǎng)，成為一種有潛力的生防菌而加以利用[13-14]。本研究從我國(guó)不同玉米產(chǎn)區(qū)的健康玉米籽粒中分離到350株內(nèi)生細(xì)菌，其中有8株對(duì)玉米黃曲霉菌有較強(qiáng)的拮抗作用，經(jīng)室內(nèi)實(shí)驗(yàn)和田間實(shí)驗(yàn)，菌株B42-3對(duì)黃曲霉毒素污染的抑制率可達(dá)70%以上，具有較好的開發(fā)應(yīng)用潛力。菌株B42-3發(fā)酵濾液、上清液及蛋白粗提液對(duì)黃曲霉菌的菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)具有較強(qiáng)的抑制活性。研究結(jié)果表明內(nèi)生細(xì)菌B42-3可通過分泌抗菌物質(zhì)，來抑制黃曲霉菌絲生長(zhǎng)和分生孢子萌發(fā)及毒素污染。但其解毒機(jī)制、對(duì)環(huán)境中微生物種類和區(qū)系影響、定殖能力、對(duì)玉米品質(zhì)與防病作用的關(guān)系有待進(jìn)一步深入探索和研究。

[1]LIU X. Strengthen research work of exposure and control of mycotoxin [J]. Chinese Journal of Preventive Medicine, 2006, 40: 307-308

[2]PAL K, GARDENER B. Biological control of plant pathogens [J]. The plant health instructor, 2006, 17: 2-8

[3]Dorner J W. Biological control of aflatoxin contamination of crops [J]. Toxin Reviews, 2004, 23(2): 425-450

[4]李強(qiáng)，李小林，黃羽佳，等. 偏腫栓菌內(nèi)生木霉菌菌株18-21抑菌效果研究[J]．微生物學(xué)雜志，2016,36(1):17-21

LI Q, LI X L, HUANG Y J, et al.Biocontrol effect of trichoderma viridescens strain 18-21 screened from fruiting bodies of trametes gibbosa[J]. Journal of Microbiology, 2016,36(1):17-21

[5]DEY R, PAL K K, BHATT D M et al. Growth promotion and yieid enhancement of peanut (Arachis hypogaea L.) by application of plant growth-promoting rhizobacteria[J]. Microbiological Research, 2004, 159(4): 371-394

[6]東秀珠，蔡妙英．常見細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M]．北京：科學(xué)出版社，2001

DONG X Z, CAI M Y. Common bacteria identification manual[M]．Beijing:Science press, 2001

[7]JI X L, LU G B, GAI Y P. Biological control against bacterial wilt andcolonization of mulberry by an endophytic Bacillus subtilis strain[J]. FEMS Microbiology Ecology，2008，65(3)：565-573

[8]KIRK G D, BAH E, MONTESANO R. Molecular epidemiology of human liver cancer: Insights into etiology, pathogenesis and prevention from The Gambia[J]. Carcinogenesis, 2006, 27: 2070-82

[9]GROOPMAN J D, KENSLER T W, WILD C P. Protective interventions to prevent aflatoxin-Induced carcinogenesis in developing countries [J]. Annual Review of Public Health, 2008, 29: 187-203

[10]WU F, KHLANGWISET P. Health economic impacts and cost-effect tiveness of aflatoxin reduction strategies in Africa: Case studies in biocontrol and postharvest interventions[J]. Food Additives and Contaminants, 2010, 27: 496-509

[11]LIU Y, WU F. Global burden of aflatoxin-induced hepatocellular carcinoma: A risk assessment[J]. Environmental Health Perspectives, 2010, 118: 18-24

[12]EGMOND V, DRAGACCI S. Liquid chromatographic method for aflatoxin M1 in milk[J]. Methods in Molecular Biology, 2001, 157: 59-69

[13]TEKINSEN K, EKEN H S. Aflatoxin M1 levels in UHT milk and kashar cheese consumed in Turkey[J]. Food and Chemical Toxicology, 2008, 46: 3287-3289

[14]KIRK G D, BAH E, MONTESANO R. Molecular epidemiology of human liver cancer: Insights into etiology, pathogenesis and prevention from The Gambia[J]. Carcinogenesis, 2006, 27: 2070-82.