低溫條件下噴施乙烯利對(duì)溫敏核不育水稻育性的影響

李林芝 魏家萍 賈彥鳳 劉小林 張海清 王明 麻浩,*

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低溫條件下噴施乙烯利對(duì)溫敏核不育水稻育性的影響

李林芝1魏家萍1賈彥鳳1劉小林1張海清2,3王明2麻浩1,*

(1南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095；2湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128；3南方糧油作物協(xié)同創(chuàng)新中心，長(zhǎng)沙 410128；)

【目的】為解決我國(guó)南方溫敏核不育水稻制種過(guò)程中遇低溫易發(fā)生育性轉(zhuǎn)換問(wèn)題，對(duì)處于育性轉(zhuǎn)換敏感期的溫敏核不育水稻進(jìn)行低溫誘導(dǎo)并噴施不同濃度乙烯利，探討其對(duì)溫敏核不育水稻育性的影響?！痉椒ā坷脺孛艉瞬挥局?S和準(zhǔn)S為材料，在育性敏感時(shí)期對(duì)其進(jìn)行連續(xù)7 d冷灌池低溫(22.5℃)誘導(dǎo)并分別噴施乙烯合成促進(jìn)物質(zhì)乙烯利和抑制物質(zhì)二氧化氯溶液，統(tǒng)計(jì)花粉可染率及套袋自交結(jié)實(shí)率，對(duì)乙烯合成關(guān)鍵酶進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。分離并分析了乙烯合成途徑關(guān)鍵酶和的啟動(dòng)子?！窘Y(jié)果】在22.5℃低溫誘導(dǎo)條件下，株1S和準(zhǔn)S連續(xù)7 d 噴水處理后的可染花粉率分別是4.3%和8.9%，套袋結(jié)實(shí)率分別是1.6%和2.5%；與噴水對(duì)照相比，噴施1600 mg/L乙烯利，株1S和準(zhǔn)S可染花粉率分別下降3.3和7.2個(gè)百分點(diǎn)，且都無(wú)結(jié)實(shí)；噴施1500 mg/L二氧化氯溶液的株1S和準(zhǔn)S可染花粉率分別上升3.5和3.3個(gè)百分點(diǎn)，套袋結(jié)實(shí)率分別上升0.78和0.52個(gè)百分點(diǎn)。在低溫誘導(dǎo)條件下(以噴水為對(duì)照)，連續(xù)7 d 噴施1600 mg/L乙烯利時(shí)，株1S和準(zhǔn)S幼穗中和基因表達(dá)量顯著升高，分別是對(duì)照(噴水)的1.19、1.24(株1S)和1.24、1.1(準(zhǔn)S)倍；連續(xù)7 d噴施1500 mg/L二氧化氯溶液時(shí)，株1S和準(zhǔn)S幼穗中基因表達(dá)量變化不顯著，而株1S和準(zhǔn)S中基因表達(dá)量顯著降低，分別是對(duì)照(噴水)的93%和89%。與正常大田溫度相比，在22.5℃低溫誘導(dǎo)7 d時(shí)，噴水、噴施1600 mg/L乙烯利及1500 mg/L二氧化氯溶液處理分別會(huì)導(dǎo)致株1S和準(zhǔn)S幼穗中和基因下調(diào)表達(dá)。此外，發(fā)現(xiàn)和的啟動(dòng)子除含TATA盒和CAAT盒等基本結(jié)構(gòu)以外，還含有多個(gè)組織特異表達(dá)及乙烯調(diào)控順式作用元件?！窘Y(jié)論】低溫誘導(dǎo)條件下，在溫敏核不育水稻育性敏感期，噴施1600 mg/L乙烯利可抑制育性轉(zhuǎn)換。

溫敏核不育水稻；低溫誘導(dǎo)；乙烯利；育性分析

水稻是人類重要的糧食作物之一，全球60%以上的人口都是以稻米為主糧[1-2]。盡管兩系雜交水稻在解決糧食安全問(wèn)題上作出了巨大貢獻(xiàn)，但在生產(chǎn)應(yīng)用中的問(wèn)題仍比較突出。我國(guó)南方盛夏三天以上的異常低溫，極易導(dǎo)致制種過(guò)程中溫敏核不育水稻發(fā)生育性轉(zhuǎn)換(從不育變?yōu)榭捎?，俗稱“打擺子”)從而導(dǎo)致兩系雜交稻大面積制種失敗[3-4]。因此，探尋在低溫條件下，抑制溫敏核不育水稻育性轉(zhuǎn)換的方法，分析溫敏核不育水稻育性不穩(wěn)定的機(jī)制，對(duì)今后溫敏核不育水稻的選育、雜交制種等起到積極的推動(dòng)作用。溫敏核不育水稻育性敏感期遇到低溫可引發(fā)育性轉(zhuǎn)換[5]，安農(nóng)S-1是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)并育成的溫敏核不育水稻[6]，敏感期內(nèi)日平均溫度為27℃以上的高溫可導(dǎo)致不育，低于24℃的低溫可誘導(dǎo)結(jié)實(shí)[7]。本課題組發(fā)現(xiàn)低溫誘導(dǎo)條件下溫敏核不育水稻中編碼乙烯合成途徑關(guān)鍵酶的和明顯下調(diào)表達(dá)，乙烯合成減少，其育性由不育向可育發(fā)生轉(zhuǎn)換，因而推測(cè)在低溫條件下，乙烯可能參與育性轉(zhuǎn)換過(guò)程的調(diào)控[8-9]。為進(jìn)一步證實(shí)低溫誘導(dǎo)條件下外源乙烯利對(duì)溫敏核不育水稻育性轉(zhuǎn)換的影響及乙烯是否參與其育性轉(zhuǎn)換的調(diào)控，本研究以溫敏核不育水稻株1S、準(zhǔn)S為材料，在冷灌池低溫(22.5℃)誘導(dǎo)及大田日均溫(30℃)條件下，噴施乙烯合成促進(jìn)物質(zhì)乙烯利和抑制物質(zhì)二氧化氯溶液，調(diào)查溫敏核不育水稻育性轉(zhuǎn)換情況，分析和啟動(dòng)子中與乙烯調(diào)控相關(guān)的順式作用元件并探討噴施處理后和基因的響應(yīng)模式，以期為低溫條件下溫敏核不育水稻育性保持穩(wěn)定提供技術(shù)措施。

1 材料與方法

1.1 材料種植與處理

本研究所用材料為溫敏核不育水稻株1S、準(zhǔn)S。于2016年5月在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)播種，6月插秧，7月對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育第Ⅳ期的溫敏核不育水稻株1S和準(zhǔn)S幼穗進(jìn)行裝盆移栽；每盆移栽4蔸，當(dāng)每蔸有3個(gè)分蘗穗進(jìn)入第Ⅴ期時(shí)標(biāo)記，在溫敏核不育水稻幼穗分化第Ⅳ～Ⅵ期即育性敏感期(Ⅳ～Ⅵ期：雌雄蕊形成期至花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂期)借助人工控溫冷水池處理的方法，連續(xù)低溫(22.5℃)誘導(dǎo)處理1、4、7 d，不同低溫誘導(dǎo)時(shí)間的材料均同時(shí)移進(jìn)冷水池并在相應(yīng)的天數(shù)后移出，以相應(yīng)大田自然條件下(日均溫30℃)作為對(duì)照；同時(shí)設(shè)置對(duì)不同藥劑的施用濃度、施用藥量的復(fù)因子試驗(yàn)，對(duì)不同低溫誘導(dǎo)處理的材料連續(xù)7 d分別噴施乙烯利(1600 mg/L和8000 mg/L)和二氧化氯溶液(750 mg/L和1500 mg/L)，每次噴施12蔸，噴施量為25 mL，以噴水作為對(duì)照，一盆為一個(gè)重復(fù)，所有處理和對(duì)照均設(shè)置3次重復(fù)；處理后在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)采樣，用液氮冷凍，－80℃冰箱保存待用。待抽穗開花前，隨機(jī)對(duì)每處理10個(gè)即將抽穗的溫敏核不育水稻單穗進(jìn)行套袋；當(dāng)溫敏核不育水稻株1S和準(zhǔn)S幼穗抽穗達(dá)到1/3時(shí)，隨機(jī)抽取當(dāng)天將要開花的幼穗，用于花粉鏡檢。

1.2 溫敏核不育水稻育性分析

1.2.1 花粉育性觀察

當(dāng)溫敏核不育水稻株1S和準(zhǔn)S幼穗抽穗達(dá)到1/3時(shí)，每處理中隨機(jī)選取當(dāng)天可以開花的3個(gè)稻穗，每處理每個(gè)稻穗中再選擇花藥已伸長(zhǎng)達(dá)穎殼2/3的花朵3~6個(gè)，剝開內(nèi)外稃片，從每朵花中取出花藥；花粉育性觀察參照Z(yǔ)hou等[10]，略加修改。

1.2.2 套袋自交結(jié)實(shí)率

在溫敏核不育水稻株1S和準(zhǔn)S稻穗開花前，隨機(jī)對(duì)每處理10個(gè)即將抽穗的單穗用羊皮紙袋套袋；套袋的不育系幼穗讓其繼續(xù)生長(zhǎng)自交結(jié)實(shí)，待成熟后去掉紙袋，分別統(tǒng)計(jì)其自交結(jié)實(shí)情況(自交結(jié)實(shí)率% =結(jié)實(shí)粒數(shù)/每穗總粒數(shù)×100%)。

1.2.3 引物合成

以NCBI公布的溫敏核不育水稻乙烯合成途徑關(guān)鍵酶OsACO5(1-氨基環(huán)丙烷-1-羧基氧化酶，登錄號(hào)為AK061064，1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase)和OsACS5 (1-氨基環(huán)丙烷-1-羧基合成酶，登錄號(hào)X97066，1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthetase)基因的CDS序列及其上游2000 bp DNA序列為模板，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物由上海桑尼生物科技有限公司合成(表1)。

1.2.4 實(shí)時(shí)PCR分析、表達(dá)量

利用Trizol法提取不同溫度、不同噴施處理?xiàng)l件下溫敏核不育水稻株1S和準(zhǔn)S幼穗的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。對(duì)乙烯合成途徑2個(gè)關(guān)鍵基因和設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)?5℃下5 min；95℃下10 s；61℃下30 s；70℃下1 min；40個(gè)循環(huán)；61℃下30 s，10℃下保存。采用2法分析數(shù)據(jù)，確定基因的相對(duì)表達(dá)量[11]。

1.2.5分析和基因的啟動(dòng)子

分離溫敏核不育水稻乙烯合成途徑關(guān)鍵酶和基因的啟動(dòng)子序列，并與NCBI上公布的序列進(jìn)行比對(duì)，利用BDGP(http://www. fruitfly.org/seqtools/promoter.htm)軟件預(yù)測(cè)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，PlantCARE(http://bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)軟件分析其中與乙烯相關(guān)的順式作用元件。

2 結(jié)果與分析

2.1 處理?xiàng)l件下溫敏核不育水稻的育性分析

花粉鏡檢可染花粉率和套袋自交結(jié)實(shí)率是水稻育性研究中的兩項(xiàng)重要參考，同時(shí)也是判定水稻不育系的不育性和可繁性的主要依據(jù)。為研究低溫誘導(dǎo)下溫敏核不育水稻株1S和準(zhǔn)S育性轉(zhuǎn)換的特性，分別選取冷灌池低溫(22.5℃)誘導(dǎo)條件下和正常大田溫度(30℃)生長(zhǎng)條件下并噴施乙烯利(1600和8000 mg/L)和二氧化氯溶液(750和1500 mg/L)的溫敏核不育水稻，觀察低溫誘導(dǎo)1、4、7 d時(shí)及相應(yīng)對(duì)照的可染花粉率和套袋自交結(jié)實(shí)率(表2和表3)。

表1 引物序列及PCR擴(kuò)增片段大小

表2 溫敏核不育水稻株1S和準(zhǔn)S不同處理下可染花粉率

表中數(shù)據(jù)為冷灌池22.5℃低溫誘導(dǎo)條件下的可染花粉率。大田自然溫度(30℃)下兩個(gè)不育系所有處理的可染花粉率均為0。

The data in Table 2 are the dyeing rates of pollen of Zhu 1S and Zhun S treated with artificial cooling water(22.5℃). The dyeing rates of the two sterile lines of all treatments are zero under natural field condition(30℃).

對(duì)可染花粉率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)(表2)，在冷灌池低溫(22.5℃)誘導(dǎo)條件下，隨著低溫誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，兩株系中花粉可染率均逐漸增加。噴水處理下，低溫誘導(dǎo)4 d，兩株系均開始有可育花粉出現(xiàn)，株1S花粉可染率達(dá)2.1%，準(zhǔn)S花粉可染率達(dá)6.5%；噴施乙烯利(1600和8000 mg/L)可染花粉率明顯低于噴水處理，7 d低溫誘導(dǎo)并噴施1600 mg/L乙烯利后株1S花粉可染率降為1%，下降1.1百分點(diǎn)，準(zhǔn)S花粉可染率降為1.7%，下降4.8百分點(diǎn)。低溫誘導(dǎo)7 d并噴施8000 mg/L乙烯利后花藥少且成白絲狀，可染花粉率均為0。此外，低溫誘導(dǎo)4 d和7 d后，噴施1500 mg/L二氧化氯溶液比噴施750 mg/L二氧化氯溶液處理下兩株系中可染花粉率高。且低溫誘導(dǎo)4 d并噴施1500 mg/L二氧化氯處理后株1S花粉可染率達(dá)5.6%，準(zhǔn)S花粉可染率達(dá)10.1%。經(jīng)過(guò)7 d低溫誘導(dǎo)，噴施1500 mg/L二氧化氯溶液處理后株1S花粉可染率達(dá)7.8%，準(zhǔn)S花粉可染率達(dá)12.2%。在對(duì)照正常大田溫度(30℃)生長(zhǎng)條件下，各噴施處理的溫敏核不育水稻株1S和準(zhǔn)S可染花粉率都為0%，表現(xiàn)完全敗育。說(shuō)明低溫誘導(dǎo)條件下，噴施低濃度的乙烯利后，可染花粉率降低，可育花粉數(shù)減少，有效抑制了育性轉(zhuǎn)換。

由表3可見，在冷灌池低溫(22.5℃)誘導(dǎo)下噴施1600 mg/L和8000 mg/L乙烯利處理?xiàng)l件下的兩株系也沒(méi)有出現(xiàn)套袋自交結(jié)實(shí)，結(jié)實(shí)率為零。而低溫誘導(dǎo)下噴施750 mg/L和1500 mg/L二氧化氯溶液處理，兩株系出現(xiàn)套袋自交結(jié)實(shí)，1500 mg/L二氧化氯溶液處理下株1S的套袋自交結(jié)實(shí)率是2.4%，準(zhǔn)S可以達(dá)到3.0%。在對(duì)照正常大田溫度(30℃)生長(zhǎng)條件下各噴施處理的溫敏核不育水稻株1S和準(zhǔn)S均沒(méi)有套袋自交結(jié)實(shí)的出現(xiàn)。這一結(jié)論與上面的可染花粉率結(jié)果相符，一方面說(shuō)明低溫誘導(dǎo)并噴施不同濃度乙烯利和二氧化氯溶液后，溫敏核不育水稻株1S和準(zhǔn)S的育性均受到影響并發(fā)生變化；另一方面說(shuō)明在低溫誘導(dǎo)條件下株1S的育性要相對(duì)穩(wěn)定，而準(zhǔn)S的育性穩(wěn)定性要相對(duì)差一些，容易受環(huán)境變化的影響。

2.2 不同處理下OsACO5、OsACS5基因的響應(yīng)模式分析

為了進(jìn)一步探討和基因在不同溫度(22.5℃和30℃)下連續(xù)7 d噴施1600 mg/L乙烯利和1500 mg/L二氧化氯溶液過(guò)程中的表達(dá)模式，分別取噴施后1、4、7 d的幼穗，采用熒光定量PCR分別對(duì)株1S和準(zhǔn)S幼穗中和的表達(dá)情況進(jìn)行了分析(圖1)。在不同溫度、不同噴施處理?xiàng)l件下溫敏核不育水稻株1S和準(zhǔn)S幼穗中和基因相對(duì)表達(dá)量存在差異。

表3 溫敏核不育水稻株1S和準(zhǔn)S不同處理下套袋自交結(jié)實(shí)率

表中數(shù)據(jù)為冷灌池22.5℃低溫誘導(dǎo)條件下的套袋自交結(jié)實(shí)率。自然溫度(30℃)條件下兩個(gè)不育系所有處理的套袋自交結(jié)實(shí)率均為0。

The data in Table 3 are the seed-setting rates of pollen of Zhu 1S and Zhun S treated with artificial cooling water(22.5℃). The seed-setting rates of the two sterile lines of all treatments are zero under natural field condition(30℃).

冷灌池低溫(22.5℃)誘導(dǎo)條件下(以噴水為對(duì)照)，溫敏核不育水稻株1S幼穗中基因表達(dá)量在噴施1600 mg/L乙烯利后1、4和7 d時(shí)均顯著升高，分別是對(duì)照的1.26、1.22、1.19倍(圖1-A)，溫敏核不育水稻準(zhǔn)S幼穗中基因的表達(dá)量在4和7 d時(shí)均顯著升高，分別是對(duì)照的1.15和1.24倍(圖1-E)，表達(dá)量在噴施后7 d時(shí)顯著升高，是對(duì)照的1.24(株1S)和1.1(準(zhǔn)S)倍(圖1-C、G)；噴施1500 mg/L二氧化氯，溫敏核不育水稻株1S和準(zhǔn)S幼穗中基因表達(dá)量變化不顯著(圖1-B、F)，在噴施后7 d時(shí)表達(dá)量顯著降低，是對(duì)照的91%(株1S)和89%(準(zhǔn)S)(圖1-D、H)。

A－株1S噴施乙烯利后OsACO5基因相對(duì)表達(dá)量; B－株1S噴施二氧化氯溶液后OsACO5基因相對(duì)表達(dá)量; C－株1S噴施乙烯利后OsACS5基因相對(duì)表達(dá)量; D－株1S噴施二氧化氯溶液后OsACS5基因相對(duì)表達(dá)量; E－準(zhǔn)S噴施乙烯利后OsACO5基因相對(duì)表達(dá)量; F－準(zhǔn)S噴施二氧化氯溶液后OsACO5基因相對(duì)表達(dá)量; G－準(zhǔn)S噴施乙烯利后OsACS5基因相對(duì)表達(dá)量; H－準(zhǔn)S噴施二氧化氯溶液后OsACS5基因相對(duì)表達(dá)量。

Fig. 1. Relative expression ofandin rice young panicles.

正常大田溫度(30℃)條件下(以噴水為對(duì)照)，噴施1600 mg/L乙烯利，溫敏核不育水稻株1S和準(zhǔn)S幼穗中基因表達(dá)量在噴施后4 d和7 d時(shí)均顯著升高，分別是對(duì)照的1.17、1.13(株1S)和1.2、1.24(準(zhǔn)S)倍(圖1-A、E)，溫敏核不育水稻準(zhǔn)S幼穗中基因表達(dá)量在噴施后7 d時(shí)顯著升高，是對(duì)照的1.1倍(圖1-G)；噴施1500 mg/L二氧化氯溶液，溫敏和不育水稻株1S和準(zhǔn)S幼穗中基因表達(dá)量在噴施后1 d、4 d和7 d時(shí)均顯著降低，分別為對(duì)照的80%、79%、78%(株1S)和85%、89%、85%(準(zhǔn)S)(圖1-B、F)，基因在株1S和準(zhǔn)S幼穗中處理7 d時(shí)顯著降低，是對(duì)照的84%(株1S)和88%(準(zhǔn)S)(圖1-D、H)。

與正常大田溫度(對(duì)照)相比，低溫(22.5℃)誘導(dǎo)1 d、4 d和7 d時(shí)，噴水導(dǎo)致溫敏核不育水稻株1S和準(zhǔn)S幼穗中和下調(diào)表達(dá)；噴施1600 mg/L乙烯利導(dǎo)致準(zhǔn)S幼穗中和下調(diào)表達(dá)(圖1-E、G)，株1S幼穗中在低溫誘導(dǎo)后7 d下調(diào)表達(dá)(圖1-A)，在低溫誘導(dǎo)后7 d上調(diào)表達(dá)(圖C);噴施1500 mg/L二氧化氯溶液后株1S幼穗中和基因表達(dá)量在低溫誘導(dǎo)后7 d均變化不顯著(圖1-B、D)，準(zhǔn)S幼穗中和在低溫誘導(dǎo)后7 d均下調(diào)表達(dá)(圖1-F、H)。

在低溫誘導(dǎo)條件下，在溫敏核不育水稻株1S和準(zhǔn)S在育性敏感期噴施1600 mg/L濃度的乙烯利7 d后，和基因，其表達(dá)量在幼穗中上調(diào)表達(dá)；噴施1500 mg/L二氧化氯溶液7 d后，和其表達(dá)量在幼穗中呈下調(diào)表達(dá)。同時(shí)，在低溫誘導(dǎo)條件下，噴施乙烯合成促進(jìn)物質(zhì)乙烯利和抑制物質(zhì)二氧化氯溶液后，編碼乙烯合成途徑關(guān)鍵酶的和5基因在響應(yīng)模式上的差別，也進(jìn)一步說(shuō)明和5基因?qū)Φ蜏?、乙烯利、二氧化氯脅迫的響應(yīng)可能依賴于乙烯信號(hào)途徑。

2.3 OsACS5和OsACO5基因啟動(dòng)子的順式作用元件分析

為了進(jìn)一步了解的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，我們分別分離得其啟動(dòng)子序列，其啟動(dòng)子序列與NCBI上公布的、編碼區(qū)上游約2000 bp的啟動(dòng)子序列完全一致。利用PlantCARE進(jìn)行在線分析，發(fā)現(xiàn)除含TATA盒和CAAT盒等啟動(dòng)子的基本結(jié)構(gòu)以外，還含有多個(gè)與組織特異表達(dá)及乙烯調(diào)控相關(guān)的順式作用元件等(表4和表5)。這些結(jié)果表明，和可能通過(guò)這些順式作用元件參與水稻對(duì)低溫、二氧化氯、乙烯利脅迫信號(hào)傳導(dǎo)途徑的應(yīng)答。

3 討論

兩系法雜交水稻是利用同一水稻株系由于受到外界環(huán)境變化的影響(主要是光和溫)可以一系兩用[12-13]。1987年鄧華鳳等首先發(fā)現(xiàn)了溫敏核不育水稻，一批實(shí)用型株系陸續(xù)被選育出來(lái)[14-15]。溫敏核不育水稻的育性受溫光條件控制，一旦溫光條件變化，極易導(dǎo)致制種過(guò)程中出現(xiàn)“打擺子”現(xiàn)象，從而導(dǎo)致兩系雜交稻大面積制種失敗。而目前針對(duì)這一現(xiàn)象尚無(wú)好的方法。

表5 水稻OsACS5啟動(dòng)子序列的順式作用元件

乙烯是一種揮發(fā)性氣體，雖然它對(duì)作物生長(zhǎng)發(fā)育有重要作用，但是在生產(chǎn)上難以直接利用[16-17]?，F(xiàn)在生產(chǎn)上人們利用比較多的是能釋放乙烯的乙烯利水劑(2-氯乙基磷酸)，該水劑被植物吸收后，在植物體內(nèi)產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，產(chǎn)生促進(jìn)開花、果實(shí)成熟、植株矮化、打破植物休眠等生理效應(yīng)，因此得到了廣泛的應(yīng)用[18-19]。

有研究表明，在正常大田溫度條件下，乙烯利具有良好的化學(xué)殺雄作用[20]。劉娜[21]在小麥光溫敏雄性不育系孤雌生殖和育性調(diào)節(jié)研究中發(fā)現(xiàn)乙烯利可降低BS366和BS400結(jié)實(shí)率并使兩種材料都達(dá)到100％不育；杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所和浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)分別于1977年、1978年兩年應(yīng)用乙烯利進(jìn)行小麥化學(xué)殺雄制種，大田制種初步獲得成功[22]。同時(shí)在正常大田溫度條件下，外源乙烯利能促進(jìn)內(nèi)源乙烯的合成。肖層林等[23]研究表明用外源乙烯利、殺雄劑2號(hào)(甲基胂酸鈉)等處理水稻誘導(dǎo)雄性不育時(shí)能夠刺激內(nèi)源乙烯的合成。謝學(xué)民等[24]發(fā)現(xiàn)乙烯利處理小麥誘導(dǎo)雄性不育主要是通過(guò)乙烯利分解為乙烯而實(shí)現(xiàn)的。乙烯在水稻育性中起到一定的調(diào)控作用，乙烯利能顯著提高水稻幼穗中內(nèi)源乙烯的釋放量，并具有抑制花粉發(fā)育的作用[25-26]。李德鴻等[27]發(fā)現(xiàn)在光敏核不育水稻中，內(nèi)源乙烯的含量與水稻育性呈負(fù)相關(guān)，在花粉單核期不育幼穗中的乙烯釋放量是可育幼穗的2.5~5.0倍。本課題組前期利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)溫敏核不育水稻的育性轉(zhuǎn)換進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)溫度從正常溫度28℃~30℃變換為22.5℃低溫時(shí)，其育性發(fā)生了轉(zhuǎn)換，并發(fā)現(xiàn)低溫誘導(dǎo)條件下和明顯下調(diào)表達(dá)，乙烯合成減少。

本研究中，在低溫誘導(dǎo)條件下，用1600 mg/L濃度的乙烯利處理育性轉(zhuǎn)換期的溫敏核不育水稻，導(dǎo)致其可育花粉數(shù)減少，結(jié)實(shí)率降低，有效抑制了育性轉(zhuǎn)換，但高濃度的乙烯利會(huì)對(duì)水稻植株產(chǎn)生一定藥害，特別是8000 mg/L高濃度會(huì)導(dǎo)致抽穗延遲，幼穗發(fā)白，花藥減少且呈白絲狀，株高變矮。同時(shí)，低溫誘導(dǎo)條件下，用1600 mg/L濃度的乙烯利處理育性轉(zhuǎn)換敏感期的溫敏核不育水稻，其幼穗中編碼乙烯合成途徑關(guān)鍵酶的和基因呈上調(diào)表達(dá)。但筆者對(duì)內(nèi)源乙烯含量進(jìn)行檢測(cè)，由于不同處理下材料中內(nèi)源乙烯含量少，沒(méi)有檢測(cè)到內(nèi)源乙烯合成變化，乙烯合成途徑前體物質(zhì)ACC含量變化也未檢測(cè)到。受環(huán)境控制的溫敏核不育水稻育性轉(zhuǎn)換機(jī)理甚為復(fù)雜。在低溫誘導(dǎo)條件下，乙烯利抑制育性轉(zhuǎn)換的機(jī)制是由于噴施外源乙烯利后的化學(xué)殺雄作用，還是在噴施外源乙烯利后促進(jìn)了內(nèi)源乙烯的合成，或者是兩者共同的作用，要從現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到確切結(jié)論，尚為時(shí)過(guò)早。這些都有待進(jìn)一步的研究。

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Effects of Exogenous Ethephon on Fertility of Thermo-sensitive Genic Male Sterile Rice Lines Under Low Temperature Inducement

LI Linzhi1, WEI Jiaping1,JIA Yanfeng1, LIU Xiaolin1, ZHANG Haiqing2,3, WANG Ming2,MA Hao1,*

(1State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;2College of Agriculture, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China;3Southern Regional Collaborative Innovation Center for Grain and Oil Crops in China, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China;)

【Objective】This research aims to elucidate the mechanism behind sterility conversion(infertile convert into fertile) in low temperature ofthermo-sensitive genic male sterile rice in seed production in South China by applying exogenous ethephon.【Method】The thermo-sensitive genic male sterile rice cultivars Zhu 1S and Zhun S weretreated with artificial cooling water tank (low temperature, 22.5℃) induction for 7 days and sprayed with ethephon (which promote synthesis of ethylene) and the chlorine dioxide solution (inhibitory substances)during fertility-sensitive period. Then the pollendyeing rate and the bagged seed-setting rate were calculated and the quantitative real-time PCR was conducted. In addition, the promoters ofand, which are key enzymes of ethylene synthesis pathway, were isolated and analyzed.【Result】Under 22.5℃ for 7 days, the pollen rate of Zhu 1S and Zhun Swas 4.3% and 8.9%, and bagged seed-setting rate was 1.6% and 2.5%, respectively. Compared with the water spray control, the pollen rate of lines Zhu 1S and Zhun S was reduced by 3.3and 7.2 percent, respectively when spraying with 1600 mg/L ethephon. When spraying with 1500 mg/L of chlorine dioxide solution, the pollen rate was increased by 3.5and 3.3 percent, and the bagged seed setting rate increased by 0.78and 0.52 percent, respectively. The expression ofandin young panicles was significantly increased at 1600 mg/L of ethephon under 22.5℃ induction for 7 days, which were 1.19, 1.24 (Zhu 1S) and 1.24, 1.1 (Zhun S) times of that of the control (water spray) respectively. When sprayed with 1500mg/L of chlorine dioxide solution for 7 days, the expression ofgene in the Zhu 1S and Zhun S was significantly reduced, which were 0.93 and 0.89 times of that of the control (water spray), respectively, but the expression ofwas not significantly changed. Compared with normal field temperature (control) for 7 days, water spraying, 1600 mg/L of ethephon and 1500 mg/L of chlorine dioxide solution at22.5℃down-regulated the expression ofandin young panicles of Zhu 1S and Zhun S.The promoters ofandcontained multiple tissue-specific expression elements and ethylene-regulated cis-acting elements in addition to the basic structures such as TATA-box and CAAT-box. 【Conclusion】Under low temperature condition, spraying 1600mg/L ethephon in the sensitive period of thermo-sensitive genic male sterile rice had inhibitory effect on fertility conversion from sterility to fertility.

thermo-sensitive genic male sterile rice; low-temperature inducement; ethephon; fertility

Corresponding author, E-mail: Lq-ncsi@njau.edu.cn

Q948.112+.2; S511.034

A

1001-7216(2018)02-0128-09

2017-04-19；

2017-06-13。

湖南省財(cái)政預(yù)算農(nóng)業(yè)專項(xiàng)；國(guó)家公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201303005)。

通訊聯(lián)系人，E-mail: Lq-ncsi@njau.edu.cn

10.16819/j.1001-7216.2018.7045