先天性手足分裂畸形的分子遺傳學(xué)及基因診斷研究進(jìn)展

陳政升　陳瓅　石文暘　許彥　王斌　韓剛

手足分裂畸形（Split-hand/foot m alformation，SHFM）是一種主要影響手/足中心線發(fā)育的先天性畸形。其發(fā)病率約為1/18 000，占所有四肢畸形的8%～17%。手足分裂畸形臨床表現(xiàn)多樣，包括中央列單指發(fā)育不全（圖1），中央列多個(gè)手指的分化發(fā)育異?；蛉笔В▓D2），最嚴(yán)重的是先天性單指，其典型特征是肢端中央列和橈側(cè)列均發(fā)育不全（圖3）。

四肢由胚胎肢芽發(fā)育而來。肢芽包括兩層細(xì)胞：外胚層細(xì)胞及其包裹的快速增殖的間充質(zhì)細(xì)胞。三個(gè)特定區(qū)域細(xì)胞產(chǎn)生信號(hào)分子調(diào)節(jié)肢芽形成，分別是頂端外胚層嵴（Apical ectodermal ridge，AER），增生區(qū)（Progress zone，PZ）和極性活化區(qū)（Zone of polarizing activity，ZPA），相互作用并從三個(gè)空間維度（遠(yuǎn)近軸、前后軸、腹背軸）決定了肢體的形態(tài)。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGFs）、骨形成蛋白（BMPs）及 AER產(chǎn)生的WNT和MSX等信號(hào)分子和轉(zhuǎn)錄因子，將相鄰的間充質(zhì)細(xì)胞維持在持續(xù)增殖和未分化的狀態(tài)，從而形成了PZ[1]。PZ的持續(xù)增殖細(xì)胞決定了肢芽的遠(yuǎn)近軸極性。如果AER和PZ無法維持，則會(huì)影響到遠(yuǎn)端的形成，引起手足分裂畸形。

手足分裂畸形多為散發(fā)。家族性手足分裂畸形大部分按照常染色體顯性的模式遺傳，也發(fā)現(xiàn)過其他遺傳形式。手足分裂畸形可作為一個(gè)獨(dú)立的病癥出現(xiàn)，也可與其他的先天畸形合并發(fā)生，如唇腭裂、外胚層發(fā)育不良/遲緩及精神遲滯等。最常見的手足分裂畸形相關(guān)綜合征有EEC綜合征、LMS綜合征、EEM綜合征、ADULT綜合征和DLDMS綜合征等。除遺傳因素外，環(huán)境因素（如AER中發(fā)生的細(xì)胞凋亡等）也可引起手足分裂畸形的發(fā)生。

本文將詳述非綜合征型手足分裂畸形的基因位點(diǎn)及突變形式，探討引起疾病發(fā)生的分子通路和機(jī)制，為基因診斷和遺傳咨詢提供依據(jù)。

圖1　中央列缺失和發(fā)育不全Fig.1　Defect and dysplasia of central rays

圖2　中央列多個(gè)指列缺失和分化發(fā)育異常Fig.2　Multiple defect of central rays and abnormality of differentiation

圖3　中央列和橈側(cè)列同時(shí)發(fā)育不全Fig.3　Dysplasia of both central and radial rays

1　SHFM1（7q21）（OMIM 183600）

SHFM1由7q21.3-q22.1區(qū)域染色體重排引起，大多是新發(fā)生的突變，也可由常染色體顯性方式遺傳，常伴有較低的外顯率和多樣的表現(xiàn)型。35%的SHFM1患者合并有神經(jīng)性耳聾[2]。該區(qū)域包括一些肢體發(fā)育的相關(guān)基因，如DSS1、DLX5和DLX6等[3-4]。小鼠DSS1同源基因主要在胚胎肢芽間充質(zhì)細(xì)胞表達(dá)。因此，胚胎發(fā)育早期DSS1表達(dá)減少可能與手足分裂畸形的發(fā)生有關(guān)[3]。DLX5和DLX6引起手足分裂畸形的可能性更大。這兩個(gè)基因?qū)儆赪nt信號(hào)通路，對(duì)于肢體的骨骼發(fā)育和形態(tài)發(fā)生都非常重要[5]。這兩個(gè)基因的產(chǎn)物可幫助保持AER細(xì)胞的增殖活性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，這兩個(gè)基因同時(shí)敲除，可以引起肢體先天畸形[6]。

除單拷貝缺失以外，SHFM1位點(diǎn)染色體易位/倒位或調(diào)節(jié)元件受到破壞，都是引起肢體缺陷的可能機(jī)制。Lo Iacono等[7]發(fā)現(xiàn)，DLX蛋白和TP63基因編碼的p63轉(zhuǎn)錄因子在AER中共存，且p63結(jié)合DLX5和DLX6啟動(dòng)子調(diào)控其轉(zhuǎn)錄。p63活性抑制或受到p63控制的調(diào)控元件受到破壞，都會(huì)引起Dlx5/Dlx6表達(dá)的下調(diào)[8]。最近，Shamseldin等[9]對(duì)一個(gè)常染色體隱性遺傳的手足分裂畸形家系展開研究，發(fā)現(xiàn)位于同源區(qū)的純合子DLX5錯(cuò)義突變會(huì)引起肢體畸型，證明DLX5在人類SHFM1的發(fā)病機(jī)理中的直接參與作用。

2　SHFM2（Xq26）（OMIM 313350）

到目前為止，X連鎖遺傳手足分裂畸形家系的報(bào)道只有一個(gè)[10]，即巴基斯坦的一個(gè)近親婚姻家系，其中有36名成員出現(xiàn)完全的手足分裂畸形（33名男性和3名女性），主要表現(xiàn)為手部單指或雙指及典型的分裂足。女性雜合子中約有一半表現(xiàn)出輕微的手和/或足的畸形。核型分析排除了X染色體或常染色體異位。連鎖分析將這個(gè)家系的致病位點(diǎn)定位到Xq26，即SHFM2[11]。兩個(gè)定位在該區(qū)域的基因FGF13和TONDU可能是致病基因，但目前尚未在手足分裂畸形患者中發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因的編碼突變[12]。

3　SHFM3（10q24）（OMIM 246560）

SHFM3定位在染色體10q24區(qū)域，由長(zhǎng)度為325～570 Kb的亞微觀串聯(lián)重復(fù)導(dǎo)致[13-14]。該位點(diǎn)是手足分裂畸形的最高發(fā)突變（約占20%）[15]。定位于該重復(fù)區(qū)域的基因包括：FBXW4、BTRC、POLL和LBX1。SHFM3以常染色體顯性的方式遺傳，大部分情況下引起非綜合征型典型手足分裂畸形，常伴有肢體內(nèi)側(cè)畸形（如拇指三節(jié)指畸形的或/和復(fù)拇畸形）[16]。

Dac小鼠之前被作為人類SHFM3研究的一個(gè)動(dòng)物模型。Dac小鼠帶有中間手指缺失，掌/跖骨發(fā)育不全以及并指的癥狀，以半顯性方式遺傳，即雜合子會(huì)表現(xiàn)出前后肢中間手指的缺失，而純合子則表現(xiàn)出更加嚴(yán)重的先天性單指[17-18]。然而，Dac小鼠致病位點(diǎn)雖位于SHFM3區(qū)域，但并非染色體微重復(fù)引起，不能完全模擬人類致病機(jī)制。

SHFM3致病機(jī)制尚不明確?？赡艿慕忉層袃煞N，其一是FBXW4轉(zhuǎn)錄畸變對(duì)野生型等位基因的顯性有不良影響，其二是別的發(fā)生重復(fù)的基因過表達(dá)。BTRC作為蛋白質(zhì)泛素化因子，存在于許多信號(hào)傳導(dǎo)通路中（如Wnt/β聯(lián)蛋白、SHH和NF-κB）[19]。這些通路都與肢體發(fā)育有關(guān)，因此BTRC的表達(dá)失調(diào)可能與SHFM3顯性有量效關(guān)系[13]。

4　SHFM4（3q27；TP63）（OMIM 605289）

SHFM4定位在3q27區(qū)域，并與TP63基因的突變直接相關(guān)[20]。該位點(diǎn)是唯一的常染色體顯性遺傳的單基因致病位點(diǎn)。TP63基因編碼一種轉(zhuǎn)錄因子，通過維持外胚層細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)肢芽頂端外胚層脊的形成與分化[21-22]。缺少p63蛋白小鼠無法形成正常的外胚層結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出皮膚、頭發(fā)、牙齒、顱面骨骼、乳腺和肢體的發(fā)育缺陷，例如分裂手或無肢[21-22]。這些小鼠的肢芽由于沒有完整頂端外胚層脊，會(huì)出現(xiàn)個(gè)體無肢現(xiàn)象，這說明p63蛋白對(duì)該結(jié)構(gòu)的發(fā)生十分重要[20]。

人類的大約10%～16%的散發(fā)型手足分裂畸形由TP63變異所導(dǎo)致；另外，93%的EEC綜合征（肢體發(fā)育不良為主要癥狀之一）患者的該基因也發(fā)生了突變，說明這一位點(diǎn)突變?cè)谙嚓P(guān)疾病中的具有重要作用[13，23]。

5　SHFM5（2q31）（OMIM 606708）

在一些手足分裂畸形（包括單指/趾畸形）的患者中發(fā)現(xiàn)了2q31染色體區(qū)域的缺失，這個(gè)區(qū)域中包含了整個(gè)HOXD基因群（HOXD1-HOXD13）[24-26]。 Goodman 等[27]報(bào)道了兩個(gè)患有肢體發(fā)育不良病例的家系。第一個(gè)家系中，父親和女兒都帶有 HOXD基因 5'端缺失 （HOXD9-HOXD13），并且HOXD13上游只延伸出包括EVX2基因在內(nèi)的85 Kb區(qū)域，引發(fā)并多指畸形（SPD）。第二個(gè)家系中，先證者患有雙側(cè)分裂足畸形，2q31-q33區(qū)域缺失，包括完整的HOXD基因群（HOXD1-HOXD13）、EVX2、DLX1 和 DLX2，一直到微衛(wèi)星標(biāo)記D2S294（位置在離EVX2大約5 Mb遠(yuǎn)處）。因此，與EVX2相連的5'端HOXD基因的單倍體不足造成并多指畸形，但不會(huì)造成手足分裂畸形；而位于該區(qū)域內(nèi)的DLX1和DLX2這兩個(gè)基因是分裂手可能的候選基因，這兩個(gè)基因也都在頂外胚層脊和發(fā)育區(qū)域中表達(dá)。然而，不論是純合子和雜合子的Dlx1/Dlx2單敲除小鼠，還是Dlx1-/Dlx2-雙敲除小鼠，都未發(fā)生肢體發(fā)育不良[28]。因此，其在手足分裂畸形中的作用尚不明確。

6　SHFM6（12q13；WNT10B）（OMIM 225300）

SHFM6由WNT10B基因純合突變導(dǎo)致。WNT蛋白是多個(gè)信號(hào)通路配體，在肢體的形態(tài)發(fā)生和發(fā)育中起主要作用，調(diào)控了肌肉、肌腱、骨骼等結(jié)構(gòu)的位置與形態(tài)[29]。

Uhur等[30]發(fā)現(xiàn)，在Yurkish這個(gè)近親家庭中所有受影響的個(gè)體都攜帶有一個(gè)純合的錯(cuò)義突變（p.R332W）。在另一個(gè)常染色體隱性遺傳的手足分裂畸形的報(bào)道中，一位瑞士患者WNT10B上有一個(gè)純合的4 bp的重復(fù)（c.458dupAGCA）[31]。

其余報(bào)道中的家系分別出現(xiàn)了WNT10B基因的純合無義突變（p.T329R）、4 bp 長(zhǎng)度的缺失（c.1165delAAGT）和 7 bp長(zhǎng)度的重復(fù)（c.300dupAGGGCGG）。這些家庭是來自巴基斯坦的4個(gè)近親婚姻的家庭。因此，SHFM6遺傳咨詢應(yīng)注重近親婚姻導(dǎo)致的常染色體隱形遺傳疾病的高發(fā)[32-33]。

7　其他SHFM位點(diǎn)

伴長(zhǎng)骨缺損的手足分裂畸形（SHFLD）一般影響脛骨和腓骨，常伴隨17p13.3區(qū)域的重復(fù)；另有12%不涉及長(zhǎng)骨的手足分裂畸形由17p13.3區(qū)域的重復(fù)所導(dǎo)致。首次報(bào)道的病例是一個(gè)巴西家族，該家族SHFLD綜合征的致病位點(diǎn)被定位到了17p13.1-p13.3的841 Kb的區(qū)段。Lezirovitz等[34]將這一區(qū)段縮小到BHLHA9單個(gè)基因，發(fā)現(xiàn)是由該區(qū)段重復(fù)所致。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)確定了這一基因在肢體發(fā)育中的功能[15]。與17p13.3區(qū)域相關(guān)的SHFLD呈現(xiàn)出了明顯的與性別相關(guān)的外顯率降低，大約50%的該區(qū)段復(fù)制攜帶者（尤其是女性）未受影響，可能的解釋是X染色體上的激素相關(guān)元件或調(diào)節(jié)器因子與17p13.3重復(fù)的共同作用，導(dǎo)致了SHFLD的發(fā)生[15]。

Aten等[35]報(bào)道了一個(gè)散發(fā)的男性病例，可能由19p13.11染色體區(qū)域上的長(zhǎng)度為1 Mb的缺失所導(dǎo)致，該區(qū)段中EPS15L1基因可能是致病基因。EPS15L1蛋白作為底物參與酪氨酸激酶在上皮生長(zhǎng)因子受體中的活動(dòng)，從而與肢體生長(zhǎng)相關(guān)聯(lián)[36]。Bens等[37]在一個(gè)患者身上檢測(cè)到一個(gè)與上述拷貝區(qū)域部分重合的新型缺失，在一定程度證實(shí)了EPS15L1基因是手足分裂畸形的可能基因。

8　診斷與遺傳咨詢

對(duì)手足分裂畸形患者的診斷，需要結(jié)合細(xì)致的臨床檢查和相關(guān)的基因/分子檢查。

如上所述，手足分裂畸形最主要的遺傳方式是常染色體顯性遺傳[4]、常染色 體 隱形遺傳[9，31，33，38]和 X 染 色 體連鎖的 遺傳[10]。散發(fā)型手足分裂畸形可能來自于新發(fā)生的突變，在這種突變中，先證者的兄弟姐妹的再顯率很低，但子女再顯率很高，可達(dá)30%～50%[31]?？紤]到較低的外顯率、多樣的表型、非孟德拉遺傳、偏分離和性別偏倚[15]，還有從患病父親到兒子的基因選擇性傳遞[39]，都導(dǎo)致手足分裂畸形的家族性遺傳和散發(fā)病例的遺傳咨詢變得十分困難且具有挑戰(zhàn)性。許多手足分裂畸形由復(fù)雜基因突變/染色體畸變的組合導(dǎo)致，是雙基因甚至是多基因的障礙，更增加了診斷與基因咨詢的困難。因此，手足分裂畸形的遺傳咨詢必須建立在相關(guān)基因的檢測(cè)上，才能提供有效信息且足夠可信。但是，即便患者接受了全部可能致病基因檢測(cè)，仍可能有基因的缺陷未被了解，這些患者的再顯率無法被準(zhǔn)確判斷，只能通過經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

基因檢測(cè)的順序可由基因突變出現(xiàn)頻率決定。目前，最大的分裂手足患者實(shí)驗(yàn)群體有56例病例，其中出現(xiàn)最頻繁的基因突變/染色體畸變是 10q24.3（SHFM3）和 17p13.3（SHFM/SHFLD）的亞微觀重復(fù)，分別占20%和16%[15]。在這一發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，Sowinska-Seidler等[40]提出手足分裂畸形基因檢測(cè)可以從10q24和17p13.3的拷貝數(shù)變異檢測(cè)開始。aCGH作為這一檢測(cè)的工具，不僅能檢測(cè)出上述變化，而且能檢測(cè)出其他的非平衡染色體畸變，例如影響到不同區(qū)域的亞顯微重組（如SHFM1和SHFM5）。此外，aCGH在全部的手足分裂畸形突變位點(diǎn)的檢測(cè)也可以被數(shù)量檢測(cè) （例如MLPA和qPCR）替代[6]。另一個(gè)重要的分裂手足畸形患者的基因診斷方法是TP63基因的測(cè)序。該基因的點(diǎn)突變?cè)斐傻纳l(fā)型手足分裂畸形占散發(fā)型總病例的10%～16%，且出現(xiàn)新型突變的概率較高。這一突變?cè)斐傻幕尉哂袠O高的外顯率，但是表達(dá)較為多樣[13]。由于一些手足分裂畸形由較大的染色體畸變?cè)斐桑Ｒ?guī)的染色體核型檢測(cè)就足夠作出診斷，例如7q21-q22（SHFM1）區(qū)域[31]的缺失或轉(zhuǎn)位[3，4，41]或者 2q31 區(qū)域（SHFM5）的缺失[27，38]。因此，傳統(tǒng)的GTG條帶檢測(cè)可用于aCGH之后，主要檢測(cè)SHFM1和SHFM5位置上的突變，尤其是在SHFM5中常見的合并其他先天異?；蛘呔襁t滯的情況下[41]。而其他已報(bào)道的散發(fā)性的分裂手足病例 （除小部分的SHFM3）的染色體核型均正常。相對(duì)于aCGH而言，染色體核型分析的重要優(yōu)點(diǎn)是可以檢測(cè)出染色體的平衡重組 （如在SHFM1中較為少見的易位），且費(fèi)用較低，因此仍有較大的利用價(jià)值。

SHFM6區(qū)域包含了WNT10B基因[30]，其變異以常染色體隱形的方式遺傳，多為純合子致病或WNT10B的組合雜合子致病。此外，常染色體隱性遺傳的家族型手足分裂畸形，還可由DLX5基因同源域變異的純合子導(dǎo)致[9]。在隱性遺傳的模型中，先證者的兄弟姐妹的再顯率為25%，而除非是近親婚姻，否則子女再顯率極低[31]。因此，常染色體隱性遺傳的手足分裂畸形十分少見，主要出現(xiàn)在近親婚姻的家庭中。在診斷的最后可以考慮WNT10B和DLX5基因的測(cè)序。在排除了上述所有已知的可能選項(xiàng)后，基因診斷（如全基因組測(cè)序/全外顯子測(cè)序）為一些還未確診的病例提供了確認(rèn)機(jī)會(huì)，從而幫助發(fā)現(xiàn)新的手足分裂畸形變異位點(diǎn)（圖4）[40]。

圖4　基因診斷流程Fig.4　Diagnostic flow-chart of genetic diagnostics

包括aCGH在內(nèi)的分子診斷技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，使包含手足分裂畸形在內(nèi)的四肢畸形遺傳診斷有了長(zhǎng)足進(jìn)步。確定具體致病基因可以讓患者理解疾病原因，并且提供預(yù)防或支持措施，為風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估建立堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，讓相關(guān)家庭能進(jìn)行生育前或移植前的診斷。

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作者聲明

本人作為通訊作者在《組織工程與重建外科》雜志2016年第3期上發(fā)表的《淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物的研究進(jìn)展》一文，和在2016年第6期上發(fā)表的《改良小鼠后肢淋巴水腫模型的構(gòu)建》一文，均受國(guó)家自然科學(xué)基金資助，項(xiàng)目編號(hào)為81371700和81501571。

特此聲明。